Adenovirus—mediated Transfer of p53 and p16 Inhibiting Proliferating Activity of Human Bladder Cancer Cell EJ in vitro and in vivo

To evaluate the effects of adenovirus (Ad)-mediated transfer of p53 and p16 on human bladder cancer cells EJ,EJ were transfected with Ad-p53 and Ad-p16.Cell growth,morphological change,cell cycle,apoptosis were measured using MTT assay,flow cytometry,cloning formation,immunocytochemical assays.Ad-p16 or Ad-p53 alone could inhibit the proliferating activity of EJ cells in vitro.Ad-p53 could induce apoptosis of partial EJ cells.G1 arrest was observed 72h after infection with Ad-p16,but apoptosis was not obvious.The transfer of Ad-p16 and Ad-p53 could significantly inhibit the growth of EJ cells,decrease the cloning formation rate and induce apoptosis of large number of EJ cells.The occurrence time of subcutaneous tumor was delayed and the tumor volume in 4 weeks was diminished by using Ad-p53 combined with Ad-p16 and the difference was significant compared with using Ad-p53 or Ad-p16 alone.It was suggested that the transfer of wild-type p53 and p16 could significantly inhibit the growth of human bladder cancer in vitro and in vivo.     

p63与UNC5D在冬凌草甲素诱导的膀胱癌细胞凋亡中的表达

 目的探讨p63与UNC5D在冬凌草甲素（oridonin）诱导的p53突变型膀胱癌细胞系5637 凋亡过程中的表达。方法应用MTT 比色法检测oridonin 对5637 细胞存活的影响,TUNEL 法检测细胞凋亡,RT-PCR 检测凋亡相关基因mRNA 表达,Western blot 法检测p63、UNC5D蛋白表达。结果浓度为5,10,20 μmol/L 的oridonin 以剂量依赖方式有效抑制5637细胞的存活并诱导凋亡（P < 0.05）。oridonin 处理可明显诱导p63 和UNC5D的共同表达,而p53与UNC5D及家族其他成员的表达无明显变化。结论oridonin 能以剂量依赖的方式有效诱导突变型膀胱癌细胞5637 的凋亡,其作用机制可能与上调促凋亡基因p63与UNC5D的表达有关。     

p16和p53基因及顺铂联用对胆管癌细胞系QBC939的生长抑制作用

目的：探索p16基因和p53基因及p16基因和顺铂（CDDP）联合应用对体内外胆管癌细胞系生长的抑制作用。方法：将重组体腺病毒p16（Ad-p16）和Ad-p53及Ad-p16和CDDP联合作用于人胆管癌细胞系QBC939，观察和分析其对体内外胆管癌细胞生长抑制作用及其机制，结果：Ad-p16在QBC939细胞中表达能抑制QBC939细胞的生长，与p53、CDDP联合应用能明显抑制QBC939细胞的生长，p16和p53基因诱导癌细胞发生G1期阻滞和细胞凋亡，CDDP能诱导癌细胞发生G2期阻滞和细胞凋亡；裸鼠皮下移植瘤模型瘤体内注射Ad-p16及腹腔内注射CDDP均能抑制QBC939肿瘤的生长，两者联合应用具有协同作用。结论：p16基因和p53基因及CDDP联合应用具有协同作用。     

Construction of the Antisense Eukaryotic Vector for Proliferating Cell Nuclear Antigen Gene and Its Expression in Bladder Cancer EJ Cell Line

Proliferating cell nuclear antigen ( PCNA) isan important co- factor of DNA polymerase delta,which participates in cellular DNA synthesis and isdirectly correlated with the proliferation status ofeukaryotic cells. Researches have indicated thatPCNA expression increased in tumor tissues andundulated with the changes of cell cycle phases[1] .Over the past ten years,PCNA has become an ef-fective indicator for evaluating the prognosis ofmany tumors. So,it may act as a potential genetherapy …     

Effect of Ad-p16 Combined with CDDP or As_2O_3 on Human Bladder Cancer Cells

Summary:To evaluate the therapeutic efficiency of combined use of p16-expressing adenovirus andchemotherapeutic agents CDDP or As_2O_3 on human bladder cancer cell line EJ,the human bladdercancer cell line EJ were transfected with adenovirus-mediated p16 gene(Ad-p16),with administra-tion of cisplatin(CDDP)or arsenic trioxide(As_2O_3).The cell growth,morphological changes,cellcycle,apoptosis and molecular changes were measured using cell counting,reverse microscopy,flowcytometry,cloning formation,immunocytochemical assays and in vivo therapy experiments to evalu-ate the therapeutic efficacy of such combined regimen.Ad-p16 transfer and CDDP or As_2O_3 adminis-tration to EJ cells could exert substantially stronger therapeutic effects than the single agent treat-ment.Especially in in vivo experiments,combined administration of p16 and CDDP or As_1o_3 inducedalmost tumor diminish compared to the partial tumor diminish induced by single agent.Moreover,delivery of Ad-p16,or administration of minimal-dose CDDP     

腺病毒介导的NT4p53(N15)Ant异源融合基因对肝癌细胞的杀伤作用

目的 构建包括神经营养因子4(NT4)信号肽,p53氨基端短活性肽(12～26位氨基酸)及蛋白质转导结构域-黑腹果蝇触足肽(Ant)序列在内的异源融合基因,并以腺病毒作为基因转移载体观察NT4p53(N15)Ant基因在体外对肝癌细胞系HepG2的杀伤效应.方法 应用互为模板的引物PCR技术及T载体克隆法获得p53(N15)Ant基因克隆,经酶切后连入pBV220/NT4质粒,再将融合基因NT4p53(N15)Ant亚克隆至腺病毒的穿梭质粒内,与辅助质粒pJM17共转染HEK293细胞,通过同源重组获得重组腺病毒,经PCR鉴定后,NT4p53(N15)Ant重组腺病毒感染HepG2细胞,用MTT比色法和PI染色流式细胞计数仪分析Ad.NT4p53(N15)Ant对肿瘤细胞和正常细胞的杀伤效应及凋亡率.结果 克隆出NT4p53(N15)Ant基因,得到高滴度的重组腺病毒,提取病毒DNA经PCR证实含目的基因.MTT测定结果显示,与平行对照病毒Ad.GFP相比,Ad.NT4p53(N15)Ant对HepG2细胞有强烈的杀伤效应,且以病毒感染后48 h作用最为明显,对肿瘤细胞抑制率达到63.3%,而对正常细胞NIH3T3的影响很小.Ad.NT4p53(N15)Ant感染HepG2细胞30 h后的流式细胞仪分析结果显示:Ad.NT4p53(N15)Ant可使HepG2细胞发生凋亡,凋亡率为18.16%.结论 通过分子克隆体外重组技术我们首次成功制备了NT4p53(N15)Ant复制缺陷型重组腺病毒;初步的研究发现Ad.NT4p53(N15)Ant对HepG2细胞有强烈的杀伤效应,这种效应部分是通过诱导HepG2细胞的凋亡而实现的.     

转染p16基因对人膀胱癌细胞周期的影响

目的 探讨p16基因对人膀胱癌细胞周期的影响。方法 通过脂质介导的基因转移技术将野生型P16基因导入人膀胱癌细胞系T24中,绘制细胞生长曲线,用流式细胞仪检测转染前后细胞周期的变化。结果 与对照组相比,转染p16基因的膀胱癌细胞生长速率降低,流式细胞仪检测显示S期及增殖指数明显降低。结论 p16基因能阻止肿瘤细胞进入S期,抑制肿瘤细胞DNA的合成,对膀胱癌细胞生长起明显抑制作用。     

褪黑素、顺铂协同抑制人肝癌细胞SMMC-7721的机制研究

目的 研究褪黑素(melatonin，MLT)、顺铂(cisplatinumum，DDP)联用对人肝癌细胞SMMC-7721的抑制作用机制。方法用不同浓度的褪黑素、顺铂及二者联用处理人肝癌细胞株SMMC-7721，采用MTT法测定细胞抑制率；流式细胞仪分析细胞周期及凋亡；通过酶解可见光底物DEVD-pNp测定Caspase3的活性；Western blot分析p27^kipl蛋白表达。结果 ①褪黑素、顺铂单独应用和联合应用均能抑制SMMC-7721生长，且低浓度联合应用可达到甚至超过单用高浓度顺铂的抑制效果。②褪黑素无论与顺铂联用与否均能激活Caspase3，诱导细胞凋亡，而顺铂单独使用无此效应。③褪黑素与顺铂均可导致细胞周期阻滞，二者联用更明显。④褪黑素无论与顺铂联用与否均明显诱导p27^kipl的表达，而顺铂单独使用无此作用。结论 褪黑素能够通过诱导细胞凋亡和促进p27^kipl表达协同增强顺铂抑制肝癌细胞作用。     

人肺腺癌细胞系GLC-82中p21WAF1和p53基因的过表达

目的 探讨p21^WAF1和p53基因过表达对人肺腺癌细胞生长和细胞凋亡的影响。方法 用带有p21cDNA的真核表达载体pCEP和带有p53的腺病毒表达载体pAdCMV,分别通过基因转染和腺病毒感染,使其在人肺腺癌细胞系(GLC—82)中过表达;通过流式细胞仪、透射电镜和原位末端分析(TUNEL)观察细胞的生长和凋亡情况。结果 p21过表达的细胞系G1期细胞增加,细胞生长抑制,克隆形成率下降,电镜下未见特征性凋亡小体,原位细胞凋亡分析未见凋亡信号;p53腺病毒感染的肿瘤细胞增殖明显抑制并出现死亡,原值细胞凋亡检测到凋亡信号。结论 P21和p53基因的过表达能够抑制人肺腺癌细胞的生长,其中p53能够诱发细胞凋亡,因此这两种基因在肿瘤基因治疗上有着广泛的应用前景。     

PCDNA3/p33ING1、wt-p53转染对胃癌细胞株SGC-7901生长抑制及凋亡的影响

目的 研究p33^ING1基因与p53基因间的协同功能对胃癌细胞生长抑制和细胞凋亡的影响。方法 构建PCD—NA3／p33^ING1真核表达质粒（正义，反义）与wt—p53质粒，将其单、共转染至胃癌细胞株SGC-7901；应用流式细胞仪检测细胞生长周期曲线比例；TUNEL法、MG-P-MY法染色观察SGC-7901的凋亡情况。结果 p33^ING1单转染和wt-p53共转染的SGC-7901胃癌细胞株较反义组和转染空载体组细胞生长速度减慢。细胞周期G0／G1期延长，S期变短（P〈0．05），细胞调亡数增加（P〈0．05）。结论 p33 ING1具有抑癌功能及生物活性．与p53基因共同抑制胃癌细胞的生长，诱导细胞的凋亡，使细胞周期阻滞。二者呈协同依赖关系。     

MiR-let-7g-3p靶向HMGB2调控膀胱癌细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡

目的 探讨MiR-let-7g-3p靶向HMGB2对膀胱癌细胞生物学行为的影响及其分子机制。方法 通过qRT-PCR检测膀胱癌组织和癌旁组织以及正常尿路上皮细胞SV-HUC-1和膀胱癌细胞（T24、5637和EJ）中let-7g-3p的表达水平;通过转染过表达或敲低T24细胞let-7g-3p表达,检测细胞增殖、迁移和侵袭、和凋亡等变化;对过表达let-7g-3p的细胞进行转录组测序,结合生物信息学分析,通过双荧光素酶报告实验、qRT-PCR和Western-blot分析let-7g-3p靶向负性调控HMGB2基因;qRT-PCR检测正常尿路上细胞和膀胱癌细胞（T24、5637和EJ）中HMGB2的表达水平,并且在敲低HMGB2的细胞株中,敲低let-7g-3p,检测细胞生物学行为改变。结果 qRT-qPCR证实let-7g-3p在膀胱癌组织和细胞表达明显下调（P<0.01）;过表达let-7g-3p可抑制细胞增殖、迁移和侵袭,促进细胞凋亡（P<0.01）;相反,敲减let-7g-3p表达可促进细胞增殖、迁移和侵袭,抑制细胞凋亡（P<0.01）。生物信息学和转录组测序结果显示,HMGB2是let-7g-3p作用于膀胱癌细胞的关键分子;双荧光素酶报告实验、qRT-PCR和Westernblot显示,HMGB2受let-7g-3p的负性调控;HMGB2膀胱癌细胞中表达水平均明显上调（P<0.01）,敲低HMGB2可部分逆转敲低let-7g-3p对膀胱癌细胞生长的促进作用。结论 MiRNA-let-7g-3p通过靶向负性调控HMGB2基因抑制膀胱癌细胞的生物行为。     

曲古抑菌素A对膀胱癌细胞的抑制作用及其机制

目的本研究探讨曲古抑菌素A(TSA)对人膀胱癌细胞的杀伤作用和机制.方法以不同浓度的TSA作用于体外培养的膀胱癌BIU-87细胞株;采用MTT法检测细胞生长抑制率;以流式细胞术(FCM)测定不同浓度的TSA作用前后膀胱癌细胞的凋亡情况及细胞周期变化;应用RT-PCR分析了TSA作用前后膀胱癌细胞中p21^WAF1 mRNA表达的变化.结果 TSA在纳摩尔级浓度即能有效抑制膀胱肿瘤细胞增殖,FCM结果表明TSA能显著诱导细胞发生凋亡且主要诱导G1期细胞发生凋亡而出现凋亡峰,RT-pCR结果示TSA处理能显著诱导p21^WAF1 mRNA表达.上述结果都呈现出明显的量-效与时-效关系.结论 TSA在体外能有效抑制对传统化疗耐药的人膀胱癌细胞生长,其抗肿瘤生长机制之一可能是通过上调p21^WAF1蛋白水平实现的.     

外源性P27kip1基因转染诱导前列腺癌细胞凋亡的实验研究

目的　探索前列腺癌基因治疗的新途径。方法　用脂质体介导 p2 7kip1基因转染前列腺癌 PC- 3 M细胞 ,SABC免疫组化法检测癌细胞外源性 p2 7kip1基因表达 ;MTT比色分析检测癌细胞体外生长活性 ;流式细胞仪 ( FCM)分析细胞周期改变 ;DNA L adder、吖啶橙 -溴化乙啶荧光染色法检测细胞凋亡。结果　发现外源性 p2 7kip1基因转移后 ,前列腺癌细胞 p2 7kip1蛋白水平显著增强 ( P<0 .0 1) ,体外生长抑制 12 .2 4%～ 3 6.5 2 % ( P<0 .0 1) ,出现 G0 / G1 期细胞周期阻滞及凋亡性“亚 G1期”峰 ,电泳可见典型的“梯状”条带 ,凋亡比率为 18.5 % ( P<0 .0 1)。结论　转染外源性p2 7kip1基因能增强对细胞周期的负性调节 ,显著诱导前列腺癌细胞凋亡 ,是前列腺癌基因治疗的潜在途径     

Preliminary study of the in vitro growth inhibition of human bladder cancer cell line BIU-87 by arsenic trioxide

Arsenic trioxide (As,O, ) is the major effectivecomponent of Pishuang. Because of its toxic and sideeffects, it was not widely used in clinic for a lOng period. In addition, it was believed that arsenic compound could result in chromosome abnormality, sis…     

In vitro effect of p21WAF-1/CIP1 gene on growth of human glioma cells mediated by EGFR targeted non-viral vector GE7 system

Objective: To construct the EGFR targeted non-viral vector GE7 system and explore the in vitro effect of p21WAF-1/CIP1 gene on growth of human glioma cells mediated by the GE7 system. Methods: The EGFR targeted non-viral vector GE7 gene delivery system was constructed. The malignant human glioma cell line U251MG was transfected in vitro with β-galactosidase gene(reporter gene) and p21WAF-1/CIP1 gene (therapeutic gene) using the GE7 system. By means of X-gal staining, MTS and FACS, the transfection efficiency of exogenous gene and apoptosis rate of tumor cells were examined. The expression of p21WAF-1/CIP1 gene in transfected U251MG cell was examined by immunohistochemistry staining. Results: The highest transfer rate of exogenous gene was 70%. After transfection with p21WAF-1/CIP1 gene, the expression of WAF-1 increased remarkably and steadily; the growth of U251MG cells were inhibited evidently. FACS examination showed G1 arrest. The average apoptosis rate was 25.2%. Conclusion: GE7 system has the ability to transfer exogenous gene to targeted cells efficiently, and expression of p21WAF-1/CIP1 gene can induce apoptosis of glioma cell and inhibit its growth.     

三氧化二砷联合阿霉素对人淋巴瘤细胞增殖及凋亡的影响

目的：探讨三氧化二砷（As2O3）联合阿霉素（adriamycin, ADM）对淋巴瘤细胞增殖及凋亡的影响。方法：将Raji细胞分为实验组与对照组,实验组分为1 μmol/L As2O3组、2 μmol/L As2O3组、ADM组、1 μmol/L As2O3与ADM联合组、2 μmol/L As2O3与ADM联合组。用As2O3和ADM干预不同时间的人淋巴瘤细胞株Raji,采用Wright-Giemsa染色法观察细胞凋亡的形态学变化;采用噻唑蓝比色法检测As2O3联合ADM对淋巴瘤细胞的增殖抑制作用;流式细胞术检测As2O3联合ADM对淋巴瘤细胞凋亡率及淋巴瘤细胞内ADM荧光强度的影响;半定量聚合酶链反应检测As2O3和ADM对淋巴瘤细胞p53表达的影响。结果：As2O3联合ADM作用细胞24h后,可观察到细胞出现凋亡形态学改变。与As2O3和ADM单药组相比,As2O3联合ADM可增强对Raji细胞的抑制率,差异有统计学意义（P＜0.05）,其作用呈浓度和时间依赖性;As2O3与ADM联合组与单药组相比,Raji细胞的凋亡率差异具有统计学意义（P＜0.05）;As2O3和ADM单药组及联合组p53的表达水平均低于对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）;另外,加入1 μmol/L和2 μmol/L As2O3后细胞内ADM的荧光强度分别为18.53和18.12,分别增加0.056倍和0.023倍,差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：As2O3和ADM单药及两种药物联合体外均可抑制淋巴瘤细胞增殖,诱导凋亡和下调突变型p53;As2O3和ADM联合体外有协同抗淋巴瘤作用;As2O3对Raji细胞内ADM浓度无显著影响;As2O3可增强淋巴瘤细胞的化疗敏感性,其下调突变型p53的表达可能是其分子水平的作用机制之一。     

外磁场协同卟啉-葡聚糖磁性纳米微粒的光动力学对人膀胱癌细胞的杀伤作用

目的:探讨外磁场协同卟啉-葡聚糖磁性纳米微粒(porphyrin-dextran magnetic nanoparticles,PDMN)的光动力学作用对人膀胱癌细胞杀伤作用的影响。方法:用化学共沉淀和氧化还原法制备PDMN,并检测其理化性质。采用四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法、流式细胞术分别观察脉冲电磁场协同PDMN的光动力学作用对人膀胱癌BIU-87细胞的杀伤作用。结果:PDMN的直径、比饱和磁化强度(saturation magnetization,Ms)分别为10～15 nm、0.20 emu/g,有效粒径为94.8 nm。PDMN光动力学作用可显著抑制BIU-87细胞增值,抑制率达(17.61±2.73)%,并诱导BIU-87细胞发生明显的凋亡,凋亡率为(24.53±5.74)%。脉冲外电磁场(5 mT)也可抑制BIU-87细胞增殖和诱导发生凋亡,且协同PDMN的光动力学作用对BIU-87细胞的生长抑制和诱导肿瘤细胞凋亡的效应均显著增强,抑制率和凋亡率分别为(28.11±4.25)%、(24.53±5.74)%,明显高于其他各组(P﹤0.01)。结论:化学修饰后的PDMN的光动力学作用能有效地抑制人膀胱癌BIU-87细胞的增殖并诱导其凋亡,与恒定外磁场协同作用对BIU-87细胞的杀伤作用更强。     

微小RNA-382-5p靶向作用核因子蛋白90对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察微小RNA-382-5p （miR-382-5p）对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法 采用荧光实时定量聚合酶链反应（qPCR）的方法检测miR-382-5p在9例乳腺癌患者癌组织和乳腺癌细胞株中的表达,细胞计数试剂盒（CCK-8）法和平板克隆实验分别检测过表达miR-382-5p后乳腺癌细胞活力和增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。qPCR和Western blot法检测过表达miR-382-5p的乳腺癌细胞中核因子蛋白90（NF90）的表达。采用荧光素酶活性实验验证miR-382-5p对靶基因的靶向作用。结果 miR-382-5p在乳腺癌组织和细胞中低表达（P<0.05）,过表达miR-382-5p可抑制乳腺癌细胞的增殖能力,促进细胞的凋亡（P<0.01）。转染miR-382-5p模拟物组NF90基因的相对表达量较miR-NC组明显降低（P<0.01）。荧光素酶活性实验显示miR-382-5p与NF90基因3''非翻译区存在靶向关系（P<0.01）。结论 miR-382-5p对乳腺癌细胞的增殖具有抑制作用,对细胞的凋亡具有促进作用,其机制与靶向抑制NF90基因表达有关。     

黄芩苷联合黄芩素诱导乳腺癌细胞凋亡的机制研究

目的：探讨黄芩苷和黄芩素联合应用对乳腺癌细胞凋亡的诱导作用及其相关机制。方法将不同浓度的黄芩苷、黄芩素以及两者联合作用于人乳腺癌（Michigan Cancer Foundation 7,MCF-7）细胞。检测上述化合物对乳腺癌细胞的活力、凋亡情况以及凋亡相关蛋白表达的影响。结果黄芩苷或黄芩素作用于乳腺癌细胞后,与作用前相比细胞生长抑制率显著升高（P〈0.05）;两者联合应用,与两者单独作用相比抗增殖作用明显增强（P〈0.05）。流式细胞术检测发现两者作用后尤其是两者联用后细胞凋亡显著增加。蛋白印迹分析显示黄芩苷和黄芩素联合作用后Caspase-3、Caspase-9、Bax和p53的表达增加而Bcl-2表达下降,同时p-38活化亦增加。结论黄芩苷和黄芩素均能诱导乳腺癌细胞的凋亡,两者联合应用后作用明显增强,其机制可能与其促进促凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-9、Bax和p53等的表达,并抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达有关。     

三氧化二砷诱导慢性髓系白血病细胞G2/M周期停滞及其机理

目的 研究三氧化二砷对慢性髓系白血病细胞的体外作用特点及其机理。方法 将三氧化二砷与慢性髓性白血病细胞系K562作用后，测定细胞的生长曲线及活性，流式细胞测量术检测细胞凋亡和细胞周期分布的改变；同时，采用RT-PCR方法检测药物作用前后细胞周期相关基因表达的变化。结果 ①三氧化二砷明显抑制K562细胞的生长，其作用呈时间和浓度依赖性；②三氧化二砷诱导K562细胞凋亡的作用较弱，但可明显诱导K562细胞在G2／M期停滞，此效应也呈时间和浓度依赖性；③三氧化二砷作用后，细胞周期抑制基因p57表达明显上调，而细胞周期促进基因cyclinB的表达受到抑制。结论 三氧化二砷能有效抑制慢性髓系白血病细胞的生长，其机理主要为诱导细胞G2／M期周期停滞；该效应与细胞周期相关基因的表达变化有关。