巴斯德毕赤酵母表达系统

巴斯德毕赤酵母表达系统在DNA重组技术中得到越来越广泛的应用。该酵母具有独特的生物学特性，作为真核表达系统，具有严格调控外源蛋白的表达，加工修饰表达产物，表达量高，营养要求低等优点；在该表达系统中，主要有3种表达宿主菌，其载体包括整合型载体和自我复制型游离载体，其转化和表达比大肠埃希氏菌系统复杂；巴斯德毕赤酵母中表达产物可分泌至胞外，从而获得较高表达量和利于表达产物的分离纯化。     

人胰岛素生长因子-1基因在毕赤酵母中的表达

研究人胰岛素生长因子-1(Insulin-like growth factor-1,IGF-1)在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中的表达.用聚合酶链反应法(PCR)和基因重组技术构建重组人胰岛素生长因子毕赤酵母表达载体并在毕赤酵母中进行表达.SDS-PAGE分析和质谱测定产物分子量7.6kD和理论值相同.人胰岛素生长因子在毕赤酵母的分泌表达为今后的研究打下基础.     

影响外源基因在巴斯德毕赤酵母表达的因素

巴斯德毕赤酶母表达系统是广泛使用的真核表达系统,但有些蛋白在该系统中表达量低,甚至不表达。本文从外源基因的内部结构、宿主菌、信号肽、转化子的拷贝数和发酵条件五个方面综述影响外源基因在巴斯德毕赤酵母表达的因素。     

巴斯德毕赤酵母启动子研究进展

目前,巴斯德毕赤酵母表达系统是非常成功的外源蛋白表达系统之一,其启动子的开发和利用也备受关注.醇氧化酶1启动子(alcohol oxidase 1 promoter,PAOX1)在巴斯德毕赤酵母中应用最为广泛.鉴于外源蛋白表达的需要,不断有启动子被发现和利用,如三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase promoter,PGAP)、甲醛脱氢酶1启动子(formaldehyde dehydrogenase 1 promoter,PFLD1)等.此文列举了多种巴斯德毕赤酵母启动子,并对启动子的来源、特点以及外源蛋白的表达等方面进行综述,以期为启动子的选择提供参考.     

重组人源白介素-1β发酵条件的优化及其产品的纯化

目的初步建立重组人源IL-1β巴斯德毕赤酵母的培养体系;进一步优化大规模培养重组人源IL-1β巴斯德毕赤酵母的条件;探讨大规模纯化重组人源IL-1β巴斯德毕赤酵母表达产物的条件;鉴定酵母表达产物及纯化样品。方法在菌体湿重达190g.L-1左右时开始甲醇诱导表达;选用了SP Sepharose XL阳离子交换层析和反相疏水柱层析进行纯化。结果在pH4.5的含0.5%蛋白胨的FM21培养基中发酵时,放罐时间在30h较为适宜;经过纯化蛋白纯度即可达95%以上。结论最终经过鉴定,表达和纯化的样品就是我们想要得到的IL-1β。     

戊型肝炎病毒（HEV）开读框架2（ORF2）1．3kb基因片段在甲基营养型酵母（Pi

戊型肝炎病毒（HEV）整个基因组有3个开放性阅读框架（ORFs)，ORF2是主要结构基因编码区，将戊型肝炎病毒（HEV）ORF21．3kb基因定向亚克隆到甲基营养型酵母－巴斯德毕赤酵母（Pichia Pastoris)分泌性表达质粒pHIL-S1和pPIC9中，转化入大肠杆菌，筛选出阳性重组株，重组质粒pPIC9HEV和pHILS1HEV分别经限制性内切酶Sal I和Bg1 II线化，电转化入巴斯德毕赤酵母GS115。与宿主GS115染色体发生整合，整合方式不同，产生两种表型，分别为HIS＋MUT＋）甲醇诱导快的，HIS＋MUTS（甲醇诱导慢的），通过营养缺陷性选择性培养基筛选出阳性菌株，经PCR技术确认外源基因整合在酵母染色体中，重组菌株先在甘油培养基中充分增殖，然后转移到甲醇培养基中诱导，取上清液，用ELIAA，SDS－PAGE，Western-blot检测到特异性HEVORF2蛋白，得到有效表达HEVORF2蛋白的菌株。     

生物技术文摘

B35-10 表达于甲醇营养型巴斯德毕赤氏酵母中的重组雪花莲凝集素(GNA)的大规模生产和纯化Baumgartner P等[BiotechnolLett, 2003, 25: 1281]将雪花莲凝集素(GNA)的编码基因在甲醇营养型巴斯德毕赤氏酵母中进行表达并分泌出产物。筛选出巴斯德毕赤氏酵母的转化子并开发了一个在克级水平上生产和纯化重组GNA的工艺。在200L规模上,GNA的分泌浓度接近80mg/L,采用疏水色谱将GNA纯化至95%同质性。重组蛋白在结构和生物学活性方面与在植物中合成的蛋白相近。[袁 宁摘 朱春宝校]B35-11 从Citrobacter braakii分离和鉴定有改良特性…     

B36-04通过含胶粘红酵母环氧化物水解酶的重组巴斯德毕赤酵母生产S-氧化苯乙烯Lee EY等Enzyme MicrobTechnol

构建了一株携带来源于胶粘红酵母的编码环氧化物水解酶(EH)基因的重组巴斯德毕赤酵母，可以对一些苯乙烯氧化物的外消旋混合物对映体选择性水解以生产Ｓ－氧化苯乙烯。EH基因是通过对胶粘红酵母的ＣDNA文库的PCR扩增获得的，并整合到巴斯德毕赤酵母的染色体DNA上，在AOX启动子的调控下表达EH。     

纳豆激酶基因在毕赤酵母中的表达纯化及抗体制备

目的实现纳豆激酶(NK)在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达,以纯化产物为抗原制备兔抗NK血清。为建立双抗夹心酶联免疫吸附反应法测定生物体内NK含量,进一步研究NK在体内代谢与功能奠定基础。方法将NK基因克隆到毕赤酵母表达载体pHBM905A中,鉴定后的重组质粒用SalⅠ酶切线性化后电转化到毕赤酵母宿主菌GS115中,甲醇诱导表达,经盐析和Millipore超滤膜过滤分离纯化表达产物。纤维蛋白法检测纯化产物的活性,并以纯化产物为抗原免疫新西兰大白兔制备兔抗NK血清。结果SDS-PAGE结果显示NK成功表达,其相对分子质量(Mr)约为27 000,纤维蛋白平板实验显示表达产物具有较好的纤溶活性。酶联免疫法测得多克隆抗体效价约为1∶8 000,Western blot结果显示在Mr27 000附近有1条特异带出现。结论NK在巴斯德毕赤酵母中实现了分泌表达,表达产物具有较好的纤溶活性和免疫原性。     

鲑鱼降钙素前体多肽在毕赤酵母中的分泌表达

将鲑鱼降钙素前体多肽（sCTGly）基因克隆到表达载体pPIC9K上,然后转化毕赤酵母营养缺陷型菌株GS115,利用酿酒酵母分泌信号肽α-factor将目的产物分泌到发酵上清液中.经组氨酸缺陷筛选、G418高拷贝筛选及摇瓶表达筛选,获得较高水平表达菌株GS115-sCTGly.酶联免疫反应检测上清液中酶的活性,表明sCTGly产量在10mg/L以上.通过5L发酵罐发酵条件优化,表达水平提高到200mg/L上.     

人ω干扰素基因工程菌发酵条件的优化

目的对表达人ω干扰素(in terferon,ωIFN-ω)的巴斯德毕赤酵母的发酵条件进行优化,确定最佳的发酵控制条件以获得ω干扰素的最高表达量。方法设计三因素三水平正交实验方案,用直观分析法分析来确定出最佳的发酵条件。结果用FBS培养基发酵的最佳条件是:温度28℃,溶氧50%,甲醇浓度1%,pH 7.0。结论通过发酵条件优化后,ω干扰素表达量达到了90m g.L-1。     

PTD-SOD融合蛋白的毕赤酵母表达载体的构建和表达

目的 PTD-SOD是含有PTD和SOD的融合蛋白,前人的研究表明它能跨膜进入细胞,具有比SOD更高的生物利用率.但至今为止的表达都是在大肠杆菌中完成的,得到的是没有活性的包涵体.本文将人工合成的PTD-SOD全基因插入含有AOX1基因启动子和分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体pPICZα中,重组载体转化进入毕赤酵母.结果 表明,经甲醇诱导,配合蛋白PTD-SOD成功得到分泌表达,表达量随诱导时间的延长而递增,诱导8d后活力达到最高,值为301.48U·mL-1.由于本文构建的毕赤酵母表达系统表达的PTD-SOD是有活性的分泌蛋白,这就为下游的工艺操作带来了极大的便利,为PTD-SOD的理化研究和工业化生产提供了物质基础.     

D-氨基酸氧化酶在巴斯德毕赤酵母中的表达研究

用分子生物学方法获得了D-氨基酸氧化酶(DAAO)的表达质粒(pPIC3.5k-DAAO),用其电转化巴斯德毕赤酵母GS115获得重组菌,经筛选获得高表达菌株PD27,并对其高密度培养和诱导条件进行了优化.PD27工程菌经250ml摇瓶发酵得到的DAAO活力达到2500～2600IU/L,在14L发酵罐中的表达水平优于其它表达系统.     

多拷贝水蛭素基因在毕赤酵母中的分泌型表达

目的:通过多拷贝克隆技术实现水蛭素(Hirudin)基因在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达.方法:利用基因重组技术,从pPIC9-Hirudin中扩增α-facor-Hirudin插入到载体pA0815中,并构建pA0815-(α-Hirudin)n多拷贝重组质粒,转化毕赤酵母GS115后进行诱导表达,并鉴定表达产物活性.结果:PCR证实成功构建了水蛭素多拷贝毕赤酵母表达载体pA0815-(α-Hirudin)n,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳证实能成功高效分泌重组水蛭素,活性测定表明表达的水蛭素有良好的抗凝血活性.结论:成功构建了分泌型水蛭素多拷贝质粒,筛选出多拷贝稳定整合表达菌株,成功表达出具有抗凝血活性的1 600 ATU/mL重组水蛭素,为大规模表达纯化水蛭素蛋白及其临床应用奠定了基础.     

毕赤酵母表达系统

毕赤酵母表达系统是一种新的真核基因表达系统 ,由于其有许多突出的优点 ,越来越受到分子生物学界的重视 ,已有多种重组蛋白在该系统成功表达。本文从表达菌株、表达载体、转化及整合、外源蛋白的表达及修饰等方面对其进行综述 ,并分析了影响毕赤酵母高效表达外源蛋白的因素。     

毕赤氏酵母/hGM-CSF工程菌的构建及表达分析

为了探索利用毕赤氏酵母系统表达和生产人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(human granulocyte-macrophage colony-stimulatingfactor,hGM-CSF)的可行性,使用经改造的hGM-CSF基因构建pGAPZα-A/hGM-CSF分泌型表达载体,转入毕赤氏酵母SMD1168(his 4,pep 4)菌株和GS115(his 4)菌株,利用斑点杂交技术筛选hGM-CSF基因阳性菌株,利用SDS-PAGE和TF-1依赖细胞株/MTT比色法对工程菌株的分泌产物进行表达和生物活性分析,最后筛选得到7个hGM-CSF基因阳性菌株,其中有3个工程菌株的杂蛋白较少且主带蛋白质相对分子质量与经改造的hGM-CSF基因相对分子质量保持一致,这3个工程菌株的分泌蛋白质样品都具有天然hGM-CSF的生物活性,经初步提取,活性单位分别为2.28×105U/ml、2.22×105U/ml和2.46×105U/ml.从而证明利用毕赤氏酵母系统表达hGM-CSF是可行的,为hGM-CSF的生产和临床应用打下了基础.     

天然大麦α-淀粉酶／枯草杆菌蛋白酶抑制剂在毕赤酵母中的高水平表达

利用甲醇诱导的醇氧化酶1（AOX1）启动子，构建了天然大麦α-淀粉酶／枯草杆菌蛋白酶抑制剂在毕赤酵母中的高水平表达系统。为了提高表达水平，在紧邻野生型编码区处设计了两种密码子优化的编码区并使之表达。利用来源于酿酒酵母的截短的α交配因子分泌信号，以保证天然成熟蛋白的分泌。利用PCR方法筛选AOX1基因被替换的单拷贝插入转化子，比较不同克隆的表达水平。经甲醇诱导后，野生型的表达水平为125mg／L，两种含有密码子优化编码区的突变株分别为65和125mg／L。纯化的重组蛋白通过埃德曼降解、液相色谱、质谱以及不溶性蓝色淀粉测定等方法显示重组蛋白与大麦中的野生型蛋白具有相同特征。     

重组人组织因子在毕赤酵母中的高效分泌表达的研究

目的构建含有人组织因子(h TF)基因的毕赤酵母高效表达系统,实现胞外高效分泌表达。方法全基因合成h TF胞外区序列,PCR扩增该基因片段,经Xho I和Xba I双酶切后,和表达载体p GAPZa A相连,并电转化毕赤酵母SMD1168H。在YPD培养基中进行表达,取培养基上清进行SDS-PAGE检测,并利用Western进行确证,通过BCA法检测胞外蛋白表达量。结果在毕赤酵母中成功表达人组织因子,通过Western确证目的蛋白分子量大小正确,BCA法检测摇瓶表达胞外总蛋白达1 g/L,Bandscan软件分析目的蛋白占胞外总蛋白80%以上。结论本研究实现了截短型人组织因子在毕赤酵母中的高效分泌表达,获得了具有与完整因子相同凝血活性的截短型组织因子。     

葡激酶在毕赤酵母中的表达及纯化

目的探索葡激酶基因在毕赤酵母中的表达和纯化方法。方法根据毕赤酵母的偏性合成了葡激酶基因,克隆到分泌型酵母表达载体pPIC9K中,重组载体线性化后,转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达。应用DEAE-Sepharose FF、Q-Sepharose FF和Sephacry1 S-200凝胶过滤层析法纯化表达产物,采用溶圈法对纯化产物进行生物学活性测定。结果葡激酶在毕赤酵母中GS115的表达量约站总蛋白的45%;表达产物经DEAE-Sepharose FF、Q-Sepharose FF和SephacrylS-200纯化后纯度达到95%;测得其比活为5.2×10^4AU/mg。结论利用毕赤酵母成功进行了重组葡激酶基因的表达及其表达产物的纯化。     

Exendin-4真核表达载体的构建及其在毕赤酵母中的表达

目的:构建Exendin-4基因真核表达载体,并在巴斯德毕赤酵母GS115中进行表达,为大量获得Exendin-4奠定基础。方法:采用重叠聚合酶链反应法扩增出Exendin-4的完整序列,将其亚克隆到表达载体pPIC9K上,得到重组质粒pPIC9K-Exendin-4。重组质粒经SacI线性化后用电穿孔法导入到GS115中,经组氨酸缺陷筛选、G418高拷贝筛选及摇瓶表达筛选,甲醇诱导表达后用凝胶电泳法分析Exendin-4的表达。结果:序列测定结果表明成功地构建了毕赤酵母表达载体,电泳结果证明Exendin-4在毕赤酵母中能高效表达。结论:实现了Exendin-4单体在毕赤酵母中的表达,为Exendin-4的规模化生产奠定了基础。