巴斯德毕赤酵母表达系统

巴斯德毕赤酵母表达系统在DNA重组技术中得到越来越广泛的应用。该酵母具有独特的生物学特性，作为真核表达系统，具有严格调控外源蛋白的表达，加工修饰表达产物，表达量高，营养要求低等优点；在该表达系统中，主要有3种表达宿主菌，其载体包括整合型载体和自我复制型游离载体，其转化和表达比大肠埃希氏菌系统复杂；巴斯德毕赤酵母中表达产物可分泌至胞外，从而获得较高表达量和利于表达产物的分离纯化。     

影响外源基因在巴斯德毕赤酵母表达的因素

巴斯德毕赤酶母表达系统是广泛使用的真核表达系统,但有些蛋白在该系统中表达量低,甚至不表达。本文从外源基因的内部结构、宿主菌、信号肽、转化子的拷贝数和发酵条件五个方面综述影响外源基因在巴斯德毕赤酵母表达的因素。     

D-氨基酸氧化酶在巴斯德毕赤酵母中的表达研究

用分子生物学方法获得了D-氨基酸氧化酶(DAAO)的表达质粒(pPIC3.5k-DAAO),用其电转化巴斯德毕赤酵母GS115获得重组菌,经筛选获得高表达菌株PD27,并对其高密度培养和诱导条件进行了优化.PD27工程菌经250ml摇瓶发酵得到的DAAO活力达到2500～2600IU/L,在14L发酵罐中的表达水平优于其它表达系统.     

毕赤酵母表达系统

毕赤酵母表达系统是一种新的真核基因表达系统 ,由于其有许多突出的优点 ,越来越受到分子生物学界的重视 ,已有多种重组蛋白在该系统成功表达。本文从表达菌株、表达载体、转化及整合、外源蛋白的表达及修饰等方面对其进行综述 ,并分析了影响毕赤酵母高效表达外源蛋白的因素。     

巴斯德毕赤酵母高效表达外源蛋白的策略

巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)是表达外源蛋白最理想的真核表达系统之一.要在一种宿主表达系统中成功表达外源蛋白并获得较高产量,必须要较为全面地了解影响其表达的诸多因素.本文综述了应用该体系高效表达外源蛋白需考虑的策略.     

巴斯德毕赤酵母表达人微小纤溶酶原的放大研究

目的:研究巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达重组人微小纤溶酶原(rh-mPlg)的放大工艺。方法:分别采用1 L摇瓶、7.5 L发酵罐对Pichia pastoris工程菌rh-MPLG/GS115进行高密度培养、甲醇诱导表达。摇瓶培液经2步纯化:SP-Seph-arose FF、Superdex 75;发酵罐培液经3步纯化:超滤、Sephacryl S-100、Q-Sepharose FF,活性组分透析后冷冻干燥。以组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)激活rh-mPlg,纤维蛋白平板测定其纤维蛋白溶解活性,计算并比较2种制备方法所获rh-mPlg比活性及得率。结果:采用1 L摇瓶和7.5 L发酵罐发酵可分别获得34 mg.L-1培液、210 mg.L-1培液的得率,经纯化后rh-mPlg纯度分别为95%和97%,比活性分别为20.6和23.0 U.mg-1。结论:以发酵罐生产rh-mPlg,可显著提高其产量,且比活性与摇瓶表达相近,验证了放大生产的可行性。     

巴斯德毕赤酵母启动子研究进展

目前,巴斯德毕赤酵母表达系统是非常成功的外源蛋白表达系统之一,其启动子的开发和利用也备受关注.醇氧化酶1启动子(alcohol oxidase 1 promoter,PAOX1)在巴斯德毕赤酵母中应用最为广泛.鉴于外源蛋白表达的需要,不断有启动子被发现和利用,如三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase promoter,PGAP)、甲醛脱氢酶1启动子(formaldehyde dehydrogenase 1 promoter,PFLD1)等.此文列举了多种巴斯德毕赤酵母启动子,并对启动子的来源、特点以及外源蛋白的表达等方面进行综述,以期为启动子的选择提供参考.     

毕赤酵母表达系统

毕赤酵母表达系统是一种新的真核基因表达系统，由于其有许多突出的优点，越来越受到分子生物学界的重视，已有多种重组蛋白在该系统成功表达。本文从表达菌株、表达载体、转化及整合、外源蛋白的表达及修饰等方面对其进行综述，并分析了影响毕赤酵母高效表达外源蛋白的因素。     

应用巴氏毕赤酵母表达基因工程药物的影响因素

巴氏毕赤酵母（Pichia pastoris，Pp）表达体系是近年来刚发展起来的真核表达体系，其操作技术和酿酒酵母非常相似，相比而言Pp表达体系的应用还不够广泛，但这一体系已经显示出很好的优势和应用前景，已经成为目前分子生物学领域中用于表达重组蛋白的标准工具之一，广泛用于基因重组药物的表达。本文就采用这一表达体系表达外源蛋白所应考虑的因素进行综述。     

重组人肝细胞生长因子真核表达载体的构建

目的构建重组人肝细胞生长因子(rhHGF)的真核表达载体,为后续毕赤酵母蛋白高效表达提供基础。方法根据酵母表达偏爱密码子合成rhHGFcDNA全长序列,将rhHGF和pGAPZαA质粒双酶切后行连接转化,构建穿梭载体pGAPZαA-rhHGF,并鉴定。结果重组真核表达载体pGAPZA-rhHGF经限制性内切酶分析,与理论值相符,测序结果未见碱基变异。结论成功构建了pGAPZαA-rhHGF真核表达载体,为后续毕赤酵母高效表达rhHGF蛋白提供了可行性。     

猪囊尾蚴cC1亚单位疫苗毕赤酵母高表达体系的优化

目的　优化猪囊尾蚴 c C1亚单位疫苗毕赤酵母表达系统。方法　毕赤酵母转化菌在 BMMY、BMM、MM及各加 1%酪蛋白水解物 (CA)的诱导培养基中经 0 .5 %甲醇诱导表达后 ,上清液行 SDS- PAGE。结果　高拷贝毕赤酵母转化菌 SMD116 8的表达水平高于酵母转化菌 GS115 ;Mut S型比 Mut+型表达量高 ;表达水平与拷贝数呈正相关 ,即拷贝数越高 ,表达量也越高 ;在诱导培养基 BMMY中的表达水平明显高于其它诱导培养基 ;阴性对照菌未见目的表达条带。结论　猪囊尾蚴 c C1亚单位疫苗在毕赤酵母高表达系统中得到优化 ,为大量制备生产打下了基础。     

葡激酶在毕赤酵母中的表达及纯化

目的探索葡激酶基因在毕赤酵母中的表达和纯化方法。方法根据毕赤酵母的偏性合成了葡激酶基因,克隆到分泌型酵母表达载体pPIC9K中,重组载体线性化后,转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达。应用DEAE-Sepharose FF、Q-Sepharose FF和Sephacry1 S-200凝胶过滤层析法纯化表达产物,采用溶圈法对纯化产物进行生物学活性测定。结果葡激酶在毕赤酵母中GS115的表达量约站总蛋白的45%;表达产物经DEAE-Sepharose FF、Q-Sepharose FF和SephacrylS-200纯化后纯度达到95%;测得其比活为5.2×10^4AU/mg。结论利用毕赤酵母成功进行了重组葡激酶基因的表达及其表达产物的纯化。     

重组rPA基因在毕赤酵母细胞中的胞内表达研究

目的构建含rPA全长基因的重组酵母胞内表达质粒pPIC9K rPA ,并在毕赤酵母中进行表达。方法用限制性内切酶BamHI和NotI将含有rPA全长基因的质粒pJZ1 6双酶切后 ,克隆至酵母表达载体pPIC9K中 ,构建酵母重组表达质粒。rPA基因经DNA序列测定准确无误。通过电穿孔法转染毕赤酵母菌GS1 1 5 ,PCR鉴定阳性酵母转化子 ,将rPA基因整合入酵母基因组DNA ,在毕赤酵母中实现了胞内非融合表达。表达产物进行SDS PAGE、Western blots以及溶纤维蛋白活性检测。结果表达产物以胞内包涵体的形式存在 ,未糖基化。SDS PAGE结果显示表达蛋白质的相对分子量约为 39kD。Western blots检测表明表达蛋白质能与单克隆抗体发生特异性反应。包涵体经 8mol L脲溶液溶解后 ,有明显的溶纤维蛋白活性。结论在毕赤酵母中成功地实现了rPA重组蛋白的胞内表达     

纳豆激酶基因在毕赤酵母中的表达纯化及抗体制备

目的实现纳豆激酶(NK)在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达,以纯化产物为抗原制备兔抗NK血清。为建立双抗夹心酶联免疫吸附反应法测定生物体内NK含量,进一步研究NK在体内代谢与功能奠定基础。方法将NK基因克隆到毕赤酵母表达载体pHBM905A中,鉴定后的重组质粒用SalⅠ酶切线性化后电转化到毕赤酵母宿主菌GS115中,甲醇诱导表达,经盐析和Millipore超滤膜过滤分离纯化表达产物。纤维蛋白法检测纯化产物的活性,并以纯化产物为抗原免疫新西兰大白兔制备兔抗NK血清。结果SDS-PAGE结果显示NK成功表达,其相对分子质量(Mr)约为27 000,纤维蛋白平板实验显示表达产物具有较好的纤溶活性。酶联免疫法测得多克隆抗体效价约为1∶8 000,Western blot结果显示在Mr27 000附近有1条特异带出现。结论NK在巴斯德毕赤酵母中实现了分泌表达,表达产物具有较好的纤溶活性和免疫原性。     

毕赤酵母N-糖基化改造的研究进展

毕赤酵母表达系统具有诸多优点,广泛用于生产重组蛋白.由于其糖基化途径与人不同,表达的糖蛋白为高甘露糖型,改变了糖蛋白的结构,影响其特性和功能,且具有免疫原性,限制了以毕赤酵母为表达系统大量生产重组蛋白的应用.在过去的20多年里,很多研究集中在毕赤酵母N-糖基化人源化改造研究上,希望产生类人的糖链结构,但进展缓慢.近期,毕赤酵母N-糖基化改造研究已经取得了重大进展,产生了类人的末端为唾液酸的糖链结构,为应用毕赤酵母表达系统大量生产重组蛋白铺平了道路.现对毕赤酵母N-糖基化的研究进展进行简述.     

重组人白介素-18在毕赤酵母中的表达和纯化

构建了含重组人白介素-18(rhIL-18)基因的酵母表达载体pPIC9k-il18,利用电转化法将pPIC9k-il18线性化质粒转入毕赤酵母GS115中,筛选出高表达菌株.通过离子交换亲和层析和分子筛凝胶层析两步纯化,可获得rhuIL-18试剂品HPLC纯度>97%,纯化得率49mg·L-1发酵液.IL-18具有促进KG-1细胞产生IFN-γ的活性,并且产生的IFN-γ的量与IL-18的量成剂量依赖性,测定产生IFN-γ量与商业化的rHu-IL18标准品相当.本研究为进一步规模化制备rHu-IL18奠定了基础.     

双表达盒人骨唾液酸蛋白毕赤酵母工程细胞的构建

目的构建含人骨唾液酸蛋白(hBSP)双表达盒的毕赤酵母工程细胞,为hBSP在毕赤酵母中的高效非融合分泌表达奠定基础。方法用PCR方法扩增hBSP基因,将其亚克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA中,并在此基础上构建含有双表达盒的重组pPICZαAN-2×hBSP载体,电转化毕赤酵母GS115,通过Zeocin高抗性筛选转化子并对其表型进行PCR鉴定。结果得到GS115/pPICZαAN-hBSP和GS115/pPICZαAN-2×hBSP毕赤酵母工程细胞。结论GS115/pPICZαAN-2×hBSP毕赤酵母工程细胞中含双表达盒hBSP。     

鲑鱼降钙素前体多肽在毕赤酵母中的分泌表达

将鲑鱼降钙素前体多肽（sCTGly）基因克隆到表达载体pPIC9K上,然后转化毕赤酵母营养缺陷型菌株GS115,利用酿酒酵母分泌信号肽α-factor将目的产物分泌到发酵上清液中.经组氨酸缺陷筛选、G418高拷贝筛选及摇瓶表达筛选,获得较高水平表达菌株GS115-sCTGly.酶联免疫反应检测上清液中酶的活性,表明sCTGly产量在10mg/L以上.通过5L发酵罐发酵条件优化,表达水平提高到200mg/L上.