TGF-β1、VEGF在兔角膜缝线后新生血管形成中的表达及意义

目的 探讨角膜组织中转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、血管内皮细胞生长因子(vescular endothelium growth factor,VEGF)与角膜新生血管(corneal neovascularization,CNV)形成的相关性.方法 双侧角膜缝线制备兔角膜新生血管模型.33只兔随机分为正常对照组(3只)、实验组(15只)和实验对照组(15只);实验组兔行单纯角膜缝线,实验对照组兔术后隔日结膜下注射一定量地塞米松.术后每日观察CNV生长情况并记录,分别于术后1 d、4 d、7 d、14 d、21 d检测角膜组织中TGF-β1、VEGF阳性表达情况.结果 缝线后各时间点,实验对照组CNV面积、角膜组织炎症细胞浸润程度及TGF-β1、VEGF的表达情况与实验组相比明显受到抑制(P＜0.05).角膜组织中TGF-β1、VEGF的表达与CNV面积存在显著的相关性.结论 CNV的形成与炎症反应密切相关,TGF-β1、VEGF可能参与了CNV的形成过程,地塞米松可能通过抑制角膜炎症反应及TGF-β1、VEGF等细胞因子的表达进而抑制CNV的生长.     

促红细胞生成素小干扰RNA对兔角膜新生血管的抑制作用

目的：评估促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)在兔角膜新生血管发病机制中的作用,并观察促红细胞生成素小干扰RNA(siRNA)对角膜新生血管的抑制作用。

方法：健康新西兰白兔22只,随机分为实验组及正常对照组,实验组兔双眼行碱烧伤法建立角膜新生血管模型,造模后每日裂隙灯检查角膜形态学改变并计算新生血管面积,同时自造模当日起右眼每日结膜下注射siRNA 1U组成siRNA治疗组,左眼以control siRNA为实验对照组,分别于术后3、7、14、21d取角膜组织行免疫组化染色,观察EPO的表达情况。

结果：实验组最早于碱烧伤后3d可见CNV长入,7～14d生长最为旺盛,免疫组织化学染色见随碱烧伤时间延长,角膜EPO的表达逐渐增加; siRNA治疗后CNV延迟长入,面积较实验对照组明显减小,炎性细胞浸润减轻,且角膜中EPO的表达较前者明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。

结论：EPO可能在CNV的发生发展中发挥重要作用,碱烧伤后siRNA的早期干预可能通过影响EPO的表达而抑制CNV的生长。     

DATS对缝线诱导的大鼠角膜新生血管的影响及机制研究

目的：探讨二烯丙基三硫化物(diallyl trisulfide，DATS)抑制缝线诱导的大鼠角膜新生血管(corneal neovascularization，CNV)的生长情况，检测大鼠新生血管化角膜中VEGF、p-AKT 的表达量，初步探讨其抑制CNV的可能机制。

方法：缝线法诱导大鼠CNV模型，随机分为A组：含DMSO的生理盐水对照组(10只)； B组：25μmol/L DATS治疗组(10只)； C组：50μmol/L DATS治疗组(10只)； D组：100μmol/L DATS治疗组(10只)； E组：200μmol/L DATS治疗组(10只)。缝线后第7d裂隙灯下观察各组CNV的生长情况并计算面积。缝线后第14d取各组大鼠角膜组织行HE 染色，光镜下观察各组角膜病理组织形态，并采用RT-PCR 法检测VEGF mRNA 的表达情况，Western-blot 法检测VEGF、p-AKT蛋白表达情况。

结果：C、D、E组的CNV面积分别与A组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。HE切片显示，与A组相比，B、C、D组角膜水肿、新生血管、炎症细胞浸润情况逐渐减轻。与A组相比，B、C、D、E组的VEGF mRNA 的表达水平均降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。与A组相比，C、D、E组的VEGF、p-AKT蛋白的表达逐渐下降，差异均有统计学意义(P<0.05)。

结论：DATS 能够抑制缝线诱导的大鼠CNV的形成，其机制可能与抑制VEGF的表达及使得p-AKT的失活有关。     

重组人生长激素对兔角膜损伤早期修复的研究

目的：探讨重组人生长激素(rHGH)对兔角膜上皮损伤早期的修复作用。

方法：选取32只健康雄性新西兰兔制作双眼角膜上皮损伤模型,随机选取1眼滴无菌生理盐水作为对照组,另1眼滴20nmol/L重组人生长激素作为rHGH组,分别于造模前、造模后24、48、72h采用荧光素钠染色法观察角膜上皮愈合情况,采用Cochet-Bonnet角膜知觉测量仪测量检查中央角膜敏感度,同时收集各时间点泪液检测炎症因子的表达。

结果：造模后48h对照组和rHGH组角膜上皮愈合率分别为62.52%±6.73%和79.62%±10.62%(P<0.05),造模后72h分别为90.56%±9.57%和98.43%±3.65%(P<0.05)。造模后48h,对照组和rHGH组中央角膜敏感度分别为3.22±0.42、4.22±0.26cm(P<0.05)。造模后各时间点两组泪液TNF-α和IL-1α表达均较造模前增加,且对照组均高于rHGH组。造模后24、48h,两组泪液MMP-9表达均较造模前增加,且造模后48h对照组高于rHGH组(均P<0.05)。造模后24、48h两组泪液IL-21表达均较造模前增加(P<0.05)。造模后各时间点两组泪液IL-17α、Leptin表达与造模前相比及两组之间比较均无差异(P>0.05)。

结论：重组人生长激素有利于兔角膜上皮损伤早期修复。     

兔角膜及房水中VEGF的表达与角膜新生血管形成的相关性

目的:探讨兔角膜与房水中VEGF的表达与角膜新生血管(corneal neovasucularization,CNV)形成的相关性。方法:兔33只,随机分为正常对照组、实验组和实验对照组,角膜缝线制备CNV模型,实验对照组自术后当日起隔日结膜下注射一定剂量地塞米松治疗。术后每日观察CNV生长情况并计算其面积。分别于术后1,4,7,14,21d检测角膜组织及房水中VEGF的表达情况。结果:实验对照组CNV生长情况及角膜组织炎症细胞浸润程度较实验组明显受到抑制(P<0.05)。角膜组织中VEGF主要定位于上皮细胞、基质纤维细胞、内皮细胞、浸润的炎症细胞及新生血管内皮细胞胞质中。实验组角膜组织内VEGF表达的阳性率随时间推移逐渐增高,且表达强度与CNV面积具有显著的相关性。角膜缝线后14,21d实验组VEGF表达阳性率显著高于实验对照组(P<0.05)。实验组房水中VEGF的含量随着时间的推移逐渐增长,各检测点均高于实验对照组,并且房水及角膜组织中VEGF的表达与CNV面积显著正相关。结论:CNV的形成与炎症细胞浸润密切相关,角膜及房水中的VEGF可能在CNV形成过程中发挥着重要的调控作用。地塞米松可能通过抑制炎症反应、下调VEGF等细胞因子的表达,进而抑制CNV的生长。     

角膜缝线诱导建立大鼠角膜新生血管模型

目的探讨在大鼠角膜基质缝线诱发角膜新生血管(CNV)模型的制作技巧及特点。方法20只SD大鼠,在手术显微镜下用10-0号尼龙线铲针在角膜基质层间置3针缝线(11点、12点、1点3个钟点位置),自距离角膜缘略小于2.0mm向瞳孔中心方向进针。采用裂隙灯显微数字图像处理系统动态观察角膜新生血管的生长情况,并观察CNV模型的角膜组织病理学变化。结果①角膜缝线后4d可见明显从角膜缘伸入角膜的毛刷状小血管、垂直角膜缘切线方向,角膜缝线处水肿;随着角膜水肿继续加重,8d新生血管延伸到达或超过缝线位置,分支密集并互相吻合形成袢状血管网、生长范围不超过50%圆周;②HE染色显示在正常角膜切片基质层仅见成纤维细胞和纤维母细胞,而在CNV模型角膜切片则见角膜上皮层水肿增厚、浅层基质内密集大量新生血管、管腔大小不等,新生血管周围有大量分叶核炎性细胞浸润。结论大鼠角膜显微缝线诱导的新生血管生长稳定、适于定量研究。     

金雀异黄素对兔角膜碱烧伤新生血管的抑制作用

目的:探讨金雀异黄素(genistein,Gen)对兔角膜新生血管(corneal neovascularization,CNV)的抑制作用。方法:取新西兰大白兔13只,不造模1只观察药物对眼表前房等组织的不良反应。其余12只24眼采用浸润1mol/LNaOH滤纸片贴敷角膜中心60s,诱导碱烧伤CNV形成,左眼用二甲亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO)溶液,右眼用Gen的DMSO溶液点眼。碱烧伤后3,7,14,21d测量角膜CNV面积,处死相应组别的动物取眼球做切片HE染色和免疫组织化学染色观察角膜和前房等情况。结果:兔角膜碱烧伤后CNV存在生长和消退的病理变化,Gen+DMSO组角膜CNV面积与DMSO组相比有明显的统计学差异性(P<0.01)。结论:Gen对于兔角膜碱烧伤模型的CNV有明显的抑制作用。     

α-氰基丙烯酸酯和缝线治疗兔角膜穿孔伤的激光共焦显微镜像比较

目的比较α-氰基丙烯酸酯医用胶和常规缝线对兔角膜穿孔伤愈合的影响。方法在24只新西兰白兔的双眼近角膜缘处作一长5 mm的切口,左眼用α-氰基丙烯酸酯封闭伤口,右眼用10-0尼龙线间断缝合,利用激光共焦显微镜观测术后7、15、30、60 d穿孔伤处兔角膜的愈合情况,并比较2组角膜新生血管（CNV）的生长。结果术后7 d内2组兔角膜伤口均闭合。实验组上皮细胞沿伤口表面胶膜边缘生长,对照组角膜伤口表面上皮细胞覆盖。术后15 d,实验组部分胶膜脱落,伤口上皮化。术后30 d,2组角膜基质层瘢痕增生,部分角膜见CNV。术后60 d,2组伤口处基质胶原连接成网状,前弹力层瘢痕愈合。术后7 d实验组的上皮细胞密度小于对照组,差异有统计学意义（P〈0.05）。其余实验组角膜伤口的各层细胞密度与对照组比较,差异均无统计学意义（P〉0.05）。术后60 d,记录2组CNV长入的兔眼数,利用Robert电脑公式对2组角膜CNV面积进行计算,经统计学分析,实验组CNV的出现率和平均CNV面积均低于对照组,两者差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论α-氰基丙烯酸酯封闭兔眼角膜穿孔伤口,对角膜伤口的愈合无明显的长期影响,可抑制CNV的生长。     

甘草甜素对小鼠角膜急性碱烧伤后新生血管的抑制作用

目的：研究甘草甜素(Gly)对小鼠角膜急性碱烧伤后角膜新生血管(CNV)的抑制作用。

方法：采用碱烧伤法制备小鼠碱烧伤模型60只,随机平均分为Gly组和PBS组,分别隔天结膜下注射2g/L Gly溶液或PBS溶液,共14d。裂隙灯显微镜下观察角膜炎症反应和CNV。实验结束后取角膜行HE染色法和免疫组织化学法CD34及髓过氧化物酶(MPO)染色并计算角膜微血管密度(MVD)及中性粒细胞数。

结果：造模后第7、14d Gly组CNV面积分别是4.16±0.00、7.33±0.13mm²,显著低于PBS组(7.58±0.20、9.24±0.08mm²,均P<0.05)。HE病理染色显示正常小鼠角膜结构完整,未见新生血管形成及炎症细胞浸润; Gly组角膜新生血管数量及炎症细胞浸润较少,胶原排列较规则,而PBS组角膜基质中可见大量炎症细胞浸润及新生血管。免疫组织化学CD34染色结果显示Gly组MVD为11.13±1.46条/mm²,显著低于PBS组(34.08±2.46条/mm²,P<0.001); 免疫组织化学MPO染色结果显示Gly组中性粒细胞计数为每200倍视野17.50±1.98个,明显少于PBS组(59.56±4.79个,P<0.001)。

结论：Gly能减轻小鼠角膜急性碱烧伤模型中的角膜炎症反应,并抑制角膜新生血管形成,这为临床上有效防治角膜新生血管类疾病提供了一种新的思路。     

清眩润目饮治疗兔蒸发过强型干眼的作用机制

目的：研究清眩润目饮对蒸发过强型干眼模型兔的作用机制和疗效。

方法：将25只雄性健康日本大耳白兔随机分为5组：空白对照组、模型组、西药组、高剂量清眩润目饮组、低剂量清眩润目饮组。空白对照组不做任何处理,采用改良睑板腺口灼烧法制备兔蒸发过强型干眼模型; 造模后,高、低剂量组每天分别予27.2mg/kg、6.8mg/kg的清眩润目饮灌胃,模型组每天以等量生理盐水灌胃,西药组以妥布霉素地塞米松眼膏1滴,1次/d点双眼,各组连续给药28d。各组分别在实验前第14d、实验前第7d、造模后当天、造模后第7d、造模后第14d,对全部实验兔行Schimer Ⅰ试验(SchimerⅠ test,SⅠt)和泪膜破裂时间(break-up time,BUT)测定。造模后15d以过量麻醉法处死动物,制备兔角结膜组织切片,采用苏木精-伊红染色法,观察各组兔角膜组织形态变化; 采用ELISA法检测兔角结膜中TNF-α、IL-1、IL-6的浓度含量。

结果：(1)BUT、SⅠt：造模后7d,西药组、高、低剂量清眩润目饮组的BUT、SⅠt较造模时均有不同程度的改善(P<0.05); 西药组、高、低剂量清眩润目饮组与模型组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。(2)TNF-α、IL-1、IL-6：ELISA法检测显示,模型组兔角结膜中的TNF-α、IL-1、IL-6浓度含量明显高于空白对照组,西药组和高、低剂量组兔角结膜中的TNF-α、IL-1、IL-6浓度明显低于模型组,差异均有统计学意义(均P<0.05),且高剂量组作用优于西药组。(3)病理组织学检查：造模后14d,空白对照组角膜上皮分层好,基底部细胞排列呈柱状,靠近角膜上皮呈鳞状改变,结膜可见完整的上皮层和结膜下组织层,杯状细胞排列紧密; 模型组角膜上皮层细胞数减少甚至剥脱缺失,基质层分层紊乱,结膜上皮细胞层不规则脱失,杯状细胞大量减少; 西药组、高剂量组兔角膜形态接近正常组,结膜杯状细胞数量与空白对照组无明显差异。

结论：清眩润目饮可以通过下调蒸发过强型干眼兔角膜和结膜中TNF-α、IL-1、IL-6的表达而抑制炎症反应,从而改善眼表症状,增加泪液分泌,延长泪膜破裂时间。     

兔眼超声乳化吸出术后非手术眼房水及血清中TNF-α、IL-1β表达变化与该眼角膜知觉敏感度变化之间的关系

目的　探讨超声乳化吸出术后不同时间点兔非手术眼房水及血清中肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β）表达变化与该眼角膜知觉敏感度变化之间的关系。方法　选取健康成年新西兰大白兔40只作为实验对象。采用随机数字表法将大白兔分为实验组与空白对照组,实验组25只,空白对照组15只。实验组:一眼行晶状体超声乳化吸出术,根据术后取材时间分为术后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d共5组,每组5只动物。空白对照组:按照对应取材时间也分为5组,每组3只动物。术后观察并记录各组兔双眼的结膜充血、角膜混浊及前房炎症反应情况。实时定量PCR检测各组兔血清TNF-α mRNA和IL-1β mRNA表达水平,ELISA法检测房水中TNF-α、IL-1β蛋白浓度,角膜知觉计测量角膜知觉敏感度。结果　实验组非手术眼与空白对照组双眼在不同时间点,结膜充血、角膜混浊及前房炎症反应级别均为0级。术后1 d、3 d、7 d、14 d,实验组兔血清TNF-α mRNA和IL-1β mRNA表达水平均较基线值升高,术后7 d达高峰（TNF-α mRNA相对表达量为14.95±0.89,IL-1β mRNA相对表达量为7.56±>0.46）,之后逐渐下降,术后21 d降至术前水平。实验组各相邻取材时间点两两比较,血清TNF-α mRNA和IL-1β mRNA表达水平差异均有统计学意义(均为P<0.05)。术后1 d、3 d、7 d、14 d,非手术眼房水TNF-α和IL-1β蛋白浓度均较基线值升高,其中峰值出现于术后7 d［TNF-α蛋白浓度为（162.34±5.71） ng·L^-1,IL-1β蛋白浓度为（16.68±0.74）ng·L^-1］,之后逐渐下降,术后21 d降至术前水平。实验组相邻取材时间点两两比较,非手术眼房水TNF-α和IL-1β蛋白浓度差异均有统计学意义(均为P<0.05)。术后1 d、3 d、7 d、14 d,非手术眼角膜知觉敏感度较基线值升高,于术后7 d角膜知觉敏感度最高;之后角膜知觉敏感度逐渐下降,术后21 d基本恢复至基线水平。实验组非手术眼相邻时间点两两比较,角膜知觉敏感度差异均有统计学意义（均为P<0.05）。结论　实验兔第一眼晶状体超声乳化吸出术后早期,非手术眼角膜知觉敏感度升高,该变化可能与该眼房水及血清中TNF-α和IL-1β表达的动态变化相关。     

地塞米松对大鼠角膜酸烧伤疗效初探

目的：探讨不同时期使用地塞米松对大鼠角膜酸烧伤的疗效。

方法：40只SD大鼠的40只角膜酸烧伤眼按随机数字法分成4组,每组10只,其中Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ组为治疗组,分别于角膜烧伤后0～3,3～7,7～21d使用地塞米松滴眼; Ⅳ组为空白对照组。于烧伤后使用裂隙灯显微镜动态观察角膜上皮缺损直径、角膜新生血管及角膜基质混浊程度并照相,并取角膜行HE染色观察角膜各层组织的形态学变化。

结果：最终角膜修复优良情况依次为Ⅲ组,Ⅰ组,Ⅳ组,Ⅱ组; 酸烧伤后各组角膜上皮愈合速度和新生血管面积不同,不同时期的实验组与对照组间的比较有统计学意义(P<0.01)。

结论：在酸烧伤后不同时期使用地塞米松,疗效存在差异。在急性期和修复晚期使用地塞米松能够促进角膜的修复,在修复早期使用地塞米松则会阻碍角膜的修复甚至可促使角膜溶解。     

分泌粒蛋白Ⅲ(Scg3)抗体对角膜新生血管的抑制作用

目的 分析分泌粒蛋白III (Scg3)抗体对兔角膜新生血管(CNV)的干预作用。方法 选取健康新西兰白兔45只,未做碱烧伤的5只作为对照组,剩余40只白兔用碱烧伤法构建CNV模型,随机分为模型组(20只)和干预组(20只),自碱烧伤之日起每隔2 d结膜下分别注射0.1 mL 1×PBS溶液或0.5 mg·L^-1的Scg3抗体工作液。碱烧伤后14 d, Western blot检测对照组与模型组兔角膜组织中Scg3的蛋白表达。分别在碱烧伤后1 d、7 d、14 d应用眼前段分析仪测量CNV的面积和长度,应用角膜共聚焦显微镜观察眼表变化,利用蛋白芯片法检测细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、白细胞介素-10(IL-10)、转化生长因子-β1(TGF-β1)等炎症相关细胞因子的表达。结果 角膜碱烧伤后14 d,模型组兔烧伤区域出现大量CNV,而干预组兔角膜无明显CNV生长。Western blot检测结果显示,与对照组相比,模型组兔角膜中Scg3蛋白表达显著升高(P<0.05)。角膜共聚焦显微镜下观察可见,模型组兔的角膜缘内出现大量活动性CNV。角膜碱烧伤后7 ...     

缺氧诱导因子1α在碱烧伤后兔角膜新生血管形成中的作用

目的 观察碱烧伤后兔角膜新生血管形成的不同时期缺氧诱导因子1α（HIF-1α）在角膜内的表达,探讨HIF-1α对角膜新生血管形成的影响.方法 实验研究.取30只健康家兔,采用随机数字表法分成5组,每组各6只兔,右眼采用1 mol/L氢氧化钠溶液建立角膜碱烧伤模型,左眼作为自身对照.分别于碱烧伤前和碱烧伤后1、3、5、7、14 d,在裂隙灯显微镜下观察家兔角膜新生血管增生情况,HE染色观察角膜组织病理学特征,并采用免疫组织化学法检验角膜组织中HIF-1α的表达,计算炎性细胞（多形核白细胞和淋巴细胞）和HIF-1α阳性细胞核数,对其结果行单因素方差分析及相关分析.结果 角膜碱烧伤后,HIF-1α主要表达在角膜基质中的炎性细胞、血管内皮细胞的细胞核中.随着时间的增加,炎性细胞表达增强,HIF-1α表达量也相应增加,并于碱烧伤后5 d达到高峰,以后逐渐减少.碱烧伤后1、3、5、7、14 d,角膜组织中炎性细胞和HIF-1α表达水平的差异均有统计学意义（F=422.086,437.555;P均＜0.05）,且HIF-1α的表达与新生血管的形成在时空上一致.经相关分析,角膜中炎性细胞和HIF-1α阳性细胞表达呈正相关（r=0.860,P＜0.05）.结论 碱烧伤后炎症反应能诱导HIF-1α的表达,而HIF-1α能促进角膜新生血管的形成.     

HIF在兔角膜碱烧伤后CNV生成中的作用研究

目的研究缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor,HIF)以及诱导性一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在角膜碱烧伤后角膜新生血管(corneal neovascularization,CNV)形成中的作用及机制。方法 建立兔CNV动物模型,将其随机分为对照组和3个实验组,对照组结膜下注射生理盐水,实验组注射不同剂量的三氧化二砷。观察兔CNV的生长情况,并记录CNV的生长面积。用免疫组织化学方法检测兔角膜HIF、iNOS以及VEGF的表达。结果 对照组6 d、12 d、15 d、21 d、28 d CNV的面积分别为:(53.86±20.60)mm2、(87.21±25.80)mm2、(128.31±40.10)mm2、(114.42±29.40)mm2、(78.15±35.13)mm2。各实验组CNV面积均小于对照组,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。免疫组织化学方法检测角膜HIF-1α、iNOS及VEGF蛋白的表达:VEGF表达集中在角膜上皮下基质,存在于血管内皮细胞、炎性细胞胞浆内,呈深黄色。在7 d有较高表达,14 d达到高峰,28 d时明显降低,且对照组明显高于实验组,各实验组的表达随三氧化二砷剂量的增加而减少。蛋白的表达与CNV面积呈正相关。结论 角膜碱烧伤后CNV的形成可能与HIF-1α有关。三氧化二砷通过抑制HIF-1α和iNOS、VEGF表达而抑制兔CNV的形成。     

塞来昔布与羊膜匀浆提取液对兔角膜热烧伤后角膜新生血管面积及基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达的影响

目的 比较塞来昔布与羊膜匀浆提取液对兔角膜热烧伤后角膜新生血管(comeal neovascularization,CNV)面积及基质金属蛋白酶-2(matrix metallo-proteinase-2,MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)表达的影响,为临床上塞来昔布治疗CNV提供理论依据.方法 建立36只兔角膜热烧伤动物模型,随机分为3组:阴性对照组、羊膜匀浆提取液组、塞来昔布组,每组12只,8只用于观察,4只用于取材.各组兔均于造模后第1天开始球结膜下注射,至造模后第14天;阴性对照组注入90g· L-1生理盐水0.1 mL,羊膜匀浆提取液组注入羊膜匀浆提取液0.1 mL,塞来昔布组注入8 mg·mL-塞来昔布溶液0.1 mL.对比热烧伤后4d、7d、14 d在裂隙灯显微镜下所观察到的各组角膜的组织形态及新生血管的生长状况,并测算CNV面积;各组均于热烧伤后第7天随机取4只兔完整角膜,行免疫组织化学染色并用计算机图像分析系统检测MMP-2、MMP-9的表达.结果 角膜热烧伤后第4天,阴性对照组、羊膜匀浆提取液组、塞来昔布组都可见不同程度的角膜水肿,角膜缘血管充血扩张,新生的小血管芽呈毛刷状,垂直角膜缘切线向内生长.热烧伤后4d、7d、14 d,CNV面积阴性对照组为(11.32±1.11)mm2、(38.49±4.64)mm2、(43.30±4.39) mm2;羊膜匀浆提取液组为(9.69±1.30) mm2、(31.15±4.85) mm2、(37.19±5.27) mm2;塞来昔布组为(8.47±1.20) mm2、(30.31±4.93) mm2、(36.69±3.54)mm2.热烧伤后4d、7d、14 d,阴性对照组的CNV面积均明显大于羊膜匀浆提取液组和塞来昔布组,差异均有统计学意义(均为P＜0.05);羊膜匀浆提取液组的CNV面积与塞来昔布组相比,差异均无统计学意义(均为P＞0.05).热烧伤后第7天MMP-2和MMP-9表达阴性对照组大于羊膜匀浆提取液组和塞来昔布组,差异均有统计学意义(均为P ＜0.05);羊膜匀浆提取液组与塞来昔布组相比,差异均无统计学意义(均为P ＞0.05).结论 塞来昔布与羊膜匀浆提取液均能有效抑制角膜热烧伤后新生血管的生长,可能与其抑制MMP-2、MMP-9在热烧伤后角膜中的表达有关.     

角膜碱烧伤白细胞介素-1ra基因治疗的实验研究

目的探讨阳离子聚合物包装IL-1ra重组质粒、角膜原位转染治疗角膜碱烧伤的疗效。设计实验性研究。研究对象角膜碱烧伤大鼠动物模型。方法制作Wistar大鼠角膜碱烧伤模型，随机分为2组，Ⅰ组为阴性对照（12只），结膜下注射生理盐水。Ⅱ组为IL-1ra基因治疗组（18只），以PeDNA3．1质粒作为IL-1ra基因表达载体，阳离子聚合物为转染介质，角膜基质显微注射20μg IL-1ra质粒。碱烧伤后不同时间点（3、7、21天）处死实验动物取下角膜，HE染色分析角膜组织病理变化，比较两组角膜透明性和新生血管生长情况，对角膜内浸润的炎性细胞进行计数。主要指标角膜透明性和新生血管情况，角膜组织病理变化及炎性细胞计数。结果碱烧伤造模后，对照组角膜浸润水肿明显，且随时间延长而加重，角膜基质内大量炎性细胞浸润和粗大新生血管形成。IL-1ra基因治疗组的角膜基质轻、中度水肿，角膜中性粒细胞、淋巴细胞等炎性细胞计数在不同时间点均少于对照组，角膜新生血管管径均较细。结论角膜基因原位转染可使IL-1ra在局部有效表达，抑制碱烧伤引起的角膜免疫炎症反应，为眼碱烧伤的治疗提供了新的选择。     

人脐带间充质干细胞移植治疗角膜碱烧伤的实验研究

目的:研究人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)移植治疗兔角膜碱烧伤的疗效,分析多形核中性白细胞(PMNs)的浸润和血管内皮生长因子(VEGF)的表达变化。方法:将75只健康日本白兔随机分成A、B、C组,每组25只,均建立右眼角膜碱烧伤模型。A组兔右眼角膜碱烧伤后立即行角膜病灶区羊膜负载hUCMSCs覆盖术;B组兔右眼角膜碱烧伤后立即行角膜病灶区羊膜覆盖术;C组兔右眼角膜碱烧伤后未进行处理。角膜碱烧伤后3、7、14、21、28d,裂隙灯下观察实验兔角膜恢复情况并照相,对角膜新生血管(CNV)生长情况进行评分,并分离角膜组织制作病理切片,通过苏木素-伊红(HE)染色观察PMNs浸润情况,采用免疫组化染色法测定VEGF的表达。结果:角膜碱烧伤后14d时,A组CNV较B组生长明显缓慢,A组病灶区周围CNV生长评分明显低于B组(P<0.05)。碱烧伤后3d时,角膜PMNs数量增加,浸润角膜基质层,7d时稍有下降,14d时达到峰值,后渐进性下降,碱烧伤后早期浸润在病灶区角膜基质内,后期浸润范围与溃疡面积相同,碱烧伤后各时间点A组和B组角膜PMNs密度均明显低于C组(P<0.05),且1...     

糖尿病大鼠玻璃体腔注射缺氧诱导因子-1α siRNA对血管内皮生长因子蛋白表达的影响

目的：观察缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)小干扰RNA(siRNA)对糖尿病大鼠视网膜组织中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白表达的抑制作用,及其用于糖尿病新生血管性疾病治疗的可行性。

方法：以pSilencer2.1-U6neo为质粒载体,构建HIF-1α.siRNA 重组质粒。选取雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠54只,随机分为正常对照组(15只)和实验组(39只)。实验组采用尾静脉注射链尿佐菌素(STZ)的方法建立糖尿病大鼠模型,造模成功后将实验组随机分为糖尿病组(15只)、基因治疗组(12只)和空载体组(12只)。正常对照组及糖尿病组大鼠均不做转染; 基因治疗组和空载体组分别转染HIF-1α.siRNA 重组质粒和pSilencer空载体质粒。行苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE染色)观察视网膜组织形态,并采用免疫组织化学法检测VEGF蛋白的表达。分别于干扰后24、48、72h,1wk时计算VEGF蛋白的抑制效率。采用单因素方差分析和LSD-t检验进行统计学分析。

结果：HIF-1α.siRNA 重组质粒经酶切、测序鉴定,确定为目的序列。HE染色显示：正常对照组大鼠视网膜各层细胞排列整齐,细胞形态基本正常。糖尿病大鼠视网膜各层细胞排列紊乱,内界膜不完整,新生血管芽、新生血管簇呈垂直状突破内界膜生长。免疫组织化学染色显示：VEGF阳性表达为细胞浆出现棕黄色颗粒,主要位于神经节细胞层。正常对照组VEGF蛋白呈弱阳性表达,而DR对照组和空载体组表达明显增强,基因治疗组较DR组和空载体组表达明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。VEGF蛋白抑制率24、48、72h和1wk时分别为：27.4%、40.6%、47.5%、64.5%。

结论：HIF-1α.siRNA重组质粒能够抑制糖尿病大鼠视网膜中VEGF蛋白的表达,可能成为一种治疗糖尿病性新生血管疾病的新方法。     

缺氧诱导因子-1α及促红细胞生成素在大鼠角膜新生血管中的表达

目的:探讨缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)及促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)在碱烧伤大鼠角膜组织中的表达,评估其在角膜新生血管(corneal neovascularization,CNV)发生发展中的作用。方法:健康3月龄SD大鼠,随机分为实验组和对照组,碱烧伤法建立CNV模型,分别于造模成功后1,3,5,7,14d测量CNV的长度并计算面积,同时取角膜组织以免疫组织化学检测HIF-1α及EPO的表达部位,并以RT-PCR法检测其mRNA的表达情况,实验数据采用SPSS 20.0处理。结果:碱烧伤后1,3,5,7,14d,CNV的面积随时间逐渐增加,7d生长最为旺盛,14d后生长减慢。免疫组织化学提示:正常角膜各层未见HIF-1α的表达,可见微量EPO,碱烧伤后1d时HIF-1α及EPO免疫活性增强,主要表达于角膜上皮及内皮层。RT-PCR结果显示HIF-1α及EPO mRNA的表达在正常大鼠角膜组织中表达极少,在角膜碱烧伤后3d表达增强,7d达到高峰,14d后明显下降;不同时间点组间比较存在统计学差异(P<0.05)。结论:HIF-1α和EPO与CNV的形成密切相关。