大鼠源卡氏肺孢子菌p55抗原基因克隆和序列分析

目的克隆大鼠源卡氏肺孢子菌55kDa抗原（p55）基因。方法取肺孢子菌病大鼠肺组织制备肺孢子菌DNA，并以此模板扩增p55基因，将PCR产物与pGEM—T载体连接．转化E．coli DH5a．在含氨苄青霉素（Amp）的LB培养基上筛选出重组子，提取质粒进行PCR扩增、酶切鉴定、序列测定及序列比较分析。结果p55基因体外扩增产物长度为l286bp，重组质粒经PCR及酶切鉴定结果表明获得正确重组子，测序结果与文献报道同源性为99．8％。结论成功扩增了p55基因，并插入克隆载体pGEM—T中。p55基因的克隆为进一步建立基因分型、疫苗等研究打下基础。     

卡氏肺孢子虫p55抗原基因片段原核表达质粒的构建与表达

目的 构建卡氏肺孢子虫p55抗原基因片段原核重组表达质粒，表达重组蛋白。 方法 SD大鼠皮下注射免疫抑制剂地塞米松14周，建立卡氏肺孢子虫大鼠模型。从感染大鼠肺组织中抽提总RNA，RT-PCR克隆p55基因，测序, 验证扩增产物。利用定向克隆技术将p55基因片段克隆到载体pGEX-4T-1上，重组质粒经酶切分析、PCR鉴定后，用异丙基?鄄β?鄄D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。最后用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 和蛋白质印迹（Western blotting）分析鉴定表达产物。 结果 克隆的p55基因片段为690 bp, 重组质粒pGEX-4T-1/690构建成功； SDS-PAGE显示目的蛋白相对分子质量(Mr)约为62 000，表达产量约占菌体蛋白的11.6%；Western blotting分析结果显示，表达蛋白能分别与谷胱甘肽（GST）抗体、卡氏肺孢子虫感染的大鼠血清发生反应。 结论 构建了卡氏肺孢子虫p55抗原基因的pGEX-4T-1/690重组质粒，诱导表达的蛋白具有良好的抗原性。     

卡氏肺孢子菌p55-v0及p55-v3基因CDS区的克隆与序列比较

目的扩增卡氏肺孢子菌p55-v0及p55-v3基因的CDS区,并对其进行序列分析比较。方法从感染卡氏肺孢子菌的鼠肺组织中提取总RNA,以其为模板采用RT-PCR法分别扩增p55-v0和p55-v3编码基因,然后将相应PCR产物与T载体连接,转化感受态DH5α,在含氨苄青霉素的LB培养基上筛选重组T载体,PCR扩增,酶切,测序并进行序列比较。结果p55-v0的CDS区基因长度为1245bp,编码414个氨基酸,比较发现其与文献报道的同源性分别为99.8%和100%。p55-v3 CDS区基因长度为1053bp,编码350个氨基酸,与GenBank同源性分别为99.9%和100%。然而p55-v0与p55-v3基因之间的同源性仅20.9%。结论本研究成功地克隆了p55-v0和p55-v3基因CDS区,分析发现p55-v0和p55-v3与国外报道的存在很高的同源性,但它们两者之间在基因组成及氨基酸组成上存在很大的差异,这为进一步比较它们的免疫功能从而阐明p55-v3的作用机制提供了基础。     

卡氏肺孢子虫p55抗原片段免疫原性的研究

目的 研究卡氏肺孢子虫p55基因片段重组质粒表达产物的免疫原性。 方法 原核表达质粒pGEX-570的表达产物融合蛋白GST-p55/570,经谷胱甘肽（GST）琼脂糖凝胶纯化后,十二烷基硫酸钠?鄄聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）观察。将33只BALB/c小鼠随机分为3组（每组8~13只）,分别用GST?鄄p55/570（50 μg/只）、GST（50 μg/只）和PBS免疫,每2周1次,共4次。末次免疫后7 d,分离小鼠脾细胞,用噻唑蓝（MTT）法检测淋巴细胞增殖反应;分别于免疫前和初次免疫后14、28、42和49 d,采血分离血清,ELISA检测血清中GST-p55/570抗体水平。用GST-p55/570组初次免疫后49 d的血清分别与GST-p55/570和GST反应,进行蛋白质印迹（Western blotting）分析。 结果 表达产物GST-p55/570的相对分子质量（Mr）约为47 000。MTT法结果显示,GST-p55/570组小鼠淋巴细胞的刺激指数（2.063 0±0.160 2）显著高于GST组（1.134 5±0.073 5）和PBS组（1.124 8±0.041 6）（P值均<0.01）。免疫后14~49 d,GST-p55/570组小鼠的血清抗体水平均显著高于GST组和PBS组（P值均<0.01）。Western blotting结果显示,免疫后血清能与GST-p55/570发生特异性反应。 结论 融合蛋白GST-p55/570能诱导小鼠产生较强的体液免疫和细胞免疫。     

卡氏肺孢子菌肺炎免疫治疗研究进展

免疫治疗已经证实为卡氏肺孢子菌治疗的有效方法。本文综述了近年来国内外在该领域的研究进展。     

人工合成肺孢子菌p55抗原串联基因真核表达载体的构建及表达

目的 研究肺孢子菌p55抗原人工合成串联基因的真核表达载体构建及其表达鉴定。方法 从肺孢子菌p55蛋白5个变异体中选取可能在肺孢子菌肺炎中起重要作用抗原表位,串联合成一段多表位基因,命名为TAG。将TAG双酶切后克隆到pIRES-hrGFP-1a真核表达载体,构建重组质粒pIRES-hrGFP-1a/TAG,将重组质粒转染至感受态TG-1大肠杆菌中进行扩增后,经提取纯化质粒再转染至HEK293细胞,用Western blot鉴定蛋白表达水平。结果 构建的pIRES-hrGFP-1a/TAG重组质粒经酶切后测序鉴定,证明其序列正确,成功转染至HEK293细胞,Western blot检测其在HKE293细胞中能进行有效基因表达。结论 本研究构建了pIRES-hrGFP-1a/TAG重组质粒,并在HEK293细胞中成功表达,为进一步阐明TAG的免疫保护功能以及核酸疫苗的研究奠定基础。     

卡氏肺孢子虫包囊抗原纯化方法的研究

目的 研究卡氏肺孢子虫包囊抗原的纯化方法。方法 肌肉注射地塞米松诱发大鼠卡氏肺孢子虫肺炎，瑞姬氏染液复合染色法获肺组织中的肺孢子虫包囊，用改进的胶原酶消化法，Percoll不连续密度梯度离心分离，超声粉碎纯化卡氏肺孢子虫包囊抗原。结果 采用浓度为0．05％胶原酶消化2次，30min/次，在1.030g/ml密度层可获得相对纯净与而而完整的卡氏肺孢子虫包囊抗原。结论 本研究可提价蒿纯度卡氏肺孢子虫抗原，为进一步建立对卡氏肺孢子虫肺炎的有效诊断方法具有十分重要的意义。     

卡氏肺孢子菌pVAX-p55-v3 DNA疫苗免疫原性研究

目的用构建的pVAX-p55-v3DNA疫苗免疫SD大鼠,以pVAX-p55-v0作为阳性对照,从细胞及体液免疫水平研究其免疫保护作用机制。方法分别将pVAX-p55-v3、pVAX-p55-v0(阳性对照)DNA疫苗免疫SD大鼠(以pVAX1空载体及PBS作为阴性对照),然后按常规方法建立PC动物模型,于第6周处死大鼠,制作肺印片,计数包囊;取脾,做淋巴细胞增殖试验,测定各组大鼠脾T细胞增殖水平;取血,分离血清,采用ELISA法测定血清中细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-2及抗体水平,评价疫苗的免疫水平就其免疫保护作用。结果与pVAX-p55-v0组一样,pVAX-p55-v3免疫组肺印片包囊数较PBS及pVAX1对照组明显减少[(1.75±0.98)个,P<0.05),脾T淋巴细胞显著增殖[(0.1937±0.0156),P<0.05),血清IFN-γ、IL-2水平增高明显[(74.279±2.215)pg/ml,(47.409±3.814)pg/ml,P<0.05),血清IgG显著增高[(1.22±0.09),P<0.05),而免疫下调因子IL-4水平各实验组之间无显著性差异(P>0.05)。结论重组DNA疫苗pVAX-p55-v3可诱导大鼠产生保护性免疫应答。其免疫保护效应与p55-v0DNA疫苗无显著差别。     

卡氏肺孢子菌主要蛋白的研究进展

卡氏肺孢子菌含有大量的蛋白,包括主要表面糖蛋白(Major surface glycoprotein,MSG)、P55蛋白、A12蛋白、主要表面糖蛋白相关抗原(MSG-related,MSR)、PRT1蛋白、Meu10等。肺孢子菌是重要的机会性致病菌,可引起宿主严重的肺炎,卡氏肺孢子菌主要蛋白的研究为开发新疫苗和防控耶氏肺孢子菌肺炎具有重要意义。本文对卡氏肺孢子菌主要蛋白的研究进展进行简要的综述。     

卡氏肺孢子虫包囊抗原纯化方法的研究

目的　研究卡氏肺孢子虫包囊抗原的纯化方法。　方法　肌肉注射地塞米松诱发大鼠卡氏肺孢子虫肺炎 ,瑞 -姬氏染液复合染色法检获肺组织中的肺孢子虫包囊 ,用改进的胶原酶消化法、Percoll不连续密度梯度离心分离、超声粉碎纯化卡氏肺孢子虫包囊抗原。　结果　采用浓度为 0 .0 5 %胶原酶消化 2次 ,30 min/次 ,在 1.0 30 g/ ml密度层可获得相对纯净而完整的卡氏肺孢子虫包囊抗原。　结论　本研究可提供高纯度卡氏肺孢子虫抗原 ,为进一步建立对卡氏肺孢子虫肺炎的有效诊断方法具有十分重要的意义。     

卡氏肺孢子虫MSG抗原基因片段的克隆与分析

目的建立卡氏肺孢子虫动物模型,体外扩增卡氏肺孢子虫MSG基因部分片段,方法取肺孢子虫肺炎大鼠肺组织制备卡氏肺孢子虫(Pc)DNA,并以此模板扩增MSG基因片段,将PCR产物与pGEM-T-easy载体连接,转化E.coli DH5a,在含氨苄青霉素(Amp)的LB培养基上筛选出重组子,提取重组质粒,并通过PCR、酶切及测序验证,并进行序列比较分析;结果PCR扩增获得长度为554bp的序列,测序结果与报道的基因序列相比,碱基序列完全相同。结论本研究从卡氏肺孢子虫DNA中成功获得MSG基因,MSG基因的克隆,为进一步开展MSG蛋白致病机制、基因工程疫苗等研究奠定基础。     

肺孢子虫（菌）p55抗原嵌合基因的克隆及表达产物分析

目的构建肺孢子虫（菌）p55蛋白嵌合基因的原核表达载体,分析、鉴定及纯化表达产物。方法自NCBI网站的蛋白数据库中获取p55抗原及4个变异体信息,运用生物信息学方法预测可能的抗原表位,设计包含多个可能抗原表位的多肽,根据遗传中心法则及大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化,将氨基酸序列转化为核苷酸序列,将人工合成的嵌合基因（CAG）片段连接到质粒pGEX-6p-1（含GST标签）上,构建原核表达载体pGEX-6p-1/CAG,酶切、测序鉴定。pGEX-6p-1/CAG转化大肠杆菌,异丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达重组融合蛋白CAG-GST。表达产物用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）及Western-blotting分析鉴定。结果双酶切及测序结果显示重组质粒pGEX-6p-1/CAG构建成功。SDS-PAGE显示重组融合蛋白相对分子量约为69 000。Western-blotting结果显示,表达的融合蛋白为CAG-GST。结论成功构建表达p55蛋白嵌合基因的原核表达载体pGEX-6p-1/CAG,建立表达重组蛋白的原核表达系统。     

卡氏肺孢子虫P55抗原表位与蛋白特性的分析

目的预测p55抗原表位及蛋白性质。方法运用生物信息学方法推测p55抗原表位及蛋白性质，分析预测结果。结果p55蛋白存在多个潜在的抗原表位，T细胞表位按预测积分高低排列位于141-158，54-68，123-137，349-364，397-414位氨基酸残基；B细胞表位在37-41，74-79，111-119，148-161，199-210，240-250，256-266，295-314，322-360位氨基酸残基等部位。P55重组融合蛋白为可溶性蛋白的概率是92％。结论p55抗原表位可能主要存在于148-161、295-320、337-356氨基酸序列区域内或其附近。该预测p55抗原表位可以有目的地克隆重组基因片段，为研究高效的表位疫苗奠定基础。     

卡氏肺孢子虫特异性DNA探针的制备及其实验应用

目的制备特异、敏感的卡氏肺孢子虫(Pc)DNA探针,用于检测卡氏肺孢子虫肺炎(PCP)患者临床标本中的PcDNA。方法PCR扩增获得Pc的线粒体核糖体RNA大亚基基因,以其为模板,采用随机引物法制备半抗原地高辛标记的探针。检测探针的敏感性和特异性后,用斑点杂交法检测实验大鼠肺组织和PCP患者临床标本中的PcDNA。结果敏感性检测显示该探针可检出2pg水平的PcDNA,特异性检测显示该探针仅与PcDNA杂交,而不与伯氏疟原虫、恶性疟原虫、弓形虫、人白细胞及正常大鼠肺组织DNA反应。斑点杂交检测PCP大鼠肺组织中的PcDNA,检出率为73.7%,低于PCR结合斑点杂交的检出率94.7%。用该探针从1例肾移植术并发PCP患者的支气管肺泡灌洗液中检测到PcDNA。结论制备的PcDNA探针具有敏感性高、特异性好、无放射性污染等优点,对PcDNA有良好的检测效果。