人白细胞介素24真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的 构建人白细胞介素24(human interleukin-24,hIL-24)真核表达载体,并在HepG2细胞中稳定表达,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),从植物血凝素活化的人外周血单个核细胞中克隆得到hIL-24基因目的 片段.应用DNA重组技术将IL-24PCR产物双酶切后定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),转化大肠杆菌DHSα获得重组载体,进行PCR、酶切及测序鉴定.应用脂质体将鉴定正确的重组质粒转染至HepG2细胞,用G418筛选稳定转染细胞株.采用RT-PCR检测稳定转染细胞HepG2中IL-24 mRNA的表达.结果 通过RT-PCR获得与预期大小一致约600 bp的IL-24基因片段;重组载体pcDNA3.1(+)-IL-24经PCR、双酶切及测序证实,IL-24 eDNA片段已正确插入真核表达载体中;在稳定转染的HepG2细胞株中可见到IL-24 mRNA表达.结论 成功构建了hIL-24真核表达载体pcDNA3.1(+)-IL-24,并获得了稳定转染该重组质粒的HepG2细胞株.     

Claudin-1荧光真核表达载体的构建及其在HepG2肝癌细胞中的表达

目的构建pDsRED1-Claudin-1重组质粒,并在HepG2肝癌细胞中进行表达。方法采用基因重组技术构建含Claudin-1开放读码框(ORF)基因的红色荧光蛋白报告基因载体pDsRED1-Claudin-1。经PCR、酶切和DNA测序鉴定,通过脂质体法转染HepG2肝癌细胞后,进行荧光检测和Western blot分析。结果成功构建真核表达质粒pDsRED1-Claudin-1,转染HepG2细胞后,经荧光检测和Western blot分析可见Claudin-1红色荧光融合蛋白正确表达。结论成功构建含Claudin-1 ORF基因的红色荧光蛋白报告载体,并在HepG2肝癌细胞中正确表达。     

真核表达载体介导白细胞介素24在HepG2细胞的表达及其体外抗肿瘤效应研究

目的  研究真核表达载体pcDNA3.1(+) 介导白细胞介素（interleukin, IL）24在肝癌细胞系HepG2细胞中表达的可行性,以及IL-24体外对HepG2细胞的抗瘤效应和可能机制。方法 采用脂质体转染法将重组质粒pcDNA3.1(+)-IL-24 及空质粒分组转染HepG2细胞,在倒置显微镜下观察细胞形态变化。用噻唑蓝比色方法测量细胞增殖指数,流式细胞仪研究细胞早期凋亡率及其细胞周期分布。结果  IL-24 mRNA成功表达于HepG2细胞中。重组质粒转染组可见明显的凋亡细胞形态,48 h增殖抑制率（F=27.058,P<0.01）、72 h增殖抑制率( F=63.481,P<0.01)和早期细胞凋亡率( F=326.220,P<0.01)与对照组的差异均有统计学意义。细胞分布呈明显的G2/M周期阻滞。结论 真核表达载体pcDNA3.1(+)可以有效地介导IL-24在HepG2细胞的表达。IL-24对HepG2细胞有明显的增殖阻滞和凋亡诱导效应,G2/M细胞周期阻滞或许是IL-24抗瘤效应的机制。       

含绿色荧光蛋白及人胰岛素基因的真核表达载体的构建

目的构建含绿色荧光蛋白(GFP)基因与人胰岛素基因的重组真核表达载体。方法将人胰岛素基因插入到真核表达载体pIRES2-EGFP的EcoRⅠ和BamHⅠ位点中,构建重组质粒pIRES2-EGFP-INS。酶切鉴定,测序证实。结果重组真核表达载体pIRES2-EGFP-INS经限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ酶切,电泳后显示360bp的INS的目的片段和5.3kb的pIRES2-EGFP载体片段,进一步测序并证明重组质粒连接正确。结论成功构建了pIRES2-EGFP-INS重组质粒,为简便快速了解胰岛素基因的转染效率奠定了基础。     

信号转导和转录激活因子基因表达的抑制及其对HepG_2细胞增殖的影响

目的探讨应用RNAi技术沉默信号转导和转录激活因子(STAT3)基因对肝癌HepG2细胞的影响。方法针对STAT3 mRNA序列设计合成3对编码小干扰RNA(SiRNA)的DNA模板,构建pGenesil-1-shRNA-STAT3重组质粒,转染人肝癌细胞HepG2细胞。通过半定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot检测STAT3基因mRNA和蛋白水平的表达情况,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验检测转染后细胞增殖的变化。结果成功构建了pGeneSil 1-shRNA-STAT3重组质粒,并转染HepG2肝癌细胞;半定量RT-PCR、Western blot结果显示,重组质粒转染组细胞的STAT3基因表达在mRNA及蛋白水平上显著低于对照组;MTT实验结果显示,重组质粒转染组细胞的增殖明显受到抑制。结论pGeneSil 1.0-shRNA-STAT3转染HepG2肝癌细胞后,可有效抑制STAT3的表达,并抑制肝癌细胞的生长及增殖。     

真核表达质粒pEGFP-N1-Bex2的构建及其在U251细胞中的表达

目的 构建pEGFP-N1-Bex2真核表达质粒,并探索其在U251神经胶质瘤细胞中的表达.方法 以正常人脑组织总RNA为模板,采用RT-PCR法获得Bex2的cDNA,并与pEGFP-N1载体连接,构建pEGFP-N1-Bex2真核表达质粒.对pEGFP-N1-Bex2重组质粒的菌液行PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定.在U251细胞中用脂质体转染法转染pEGFP-N1-Bex2真核表达载体过表达Bex2,分别于转染后12、24、48、72 h收集细胞,用Western blot检测Bex2基因的表达情况.结果 真核表达质粒pEGFP-N1-Bex2经PCR及双酶切鉴定,均可见387 bp的目的基因条带,并单倍正向克隆至质粒中.转染质粒pEGFP-N1-Bex2后荧光显微镜下观察U251细胞内有绿色荧光蛋白表达,Western blot检测见47 KD和26 KD分别有清晰的外源性Bex2-GFP融合蛋白和GFP蛋白的表达.pEGFP-N1-Bex2在转染U251细胞后12h即有表达,48 h达到高峰.结论 成功构建pEGFP-N1-Bex2真核表达质粒,瞬时转染后在U251细胞中顺利表达.     

环氧化酶2特异性siRNA真核表达质粒的构建与鉴定

目的 构建环氧化酶2(COX-2)特异性小干扰RNA(siRNA)真核表达质粒,研究其对人结肠癌细胞COX-2的阻抑作用.方法 设计短发夹结构的COX-2 siRNA对应模版DNA序列,退火处理后克隆至pGPH1-GFP-Neo质粒,构建重组质粒pGPH1-GFP-Neo-COX-2.将重组质粒转染人结肠癌HT-29细胞,采用RT-PCR、Western blot分别从mRNA和蛋A水平检测COX-2表达.结果 酶切及测序证实质粒pGPH1-GFP-Neo-COX-2构建成功.转染重组质粒72h后可以显著抑制HT-29细胞COX-2mRNA和蛋白表达(P<0.05).结论 成功构建的COX-2siRNA真核表达质粒pGPH1-GFP-Neo-COX-2可以抑制人结肠癌HT-29细胞COX-2基因表达.     

重组CEA和IL-2抗肿瘤基因疫苗的构建及其抗肿瘤作用研究

目的成功构建重细CEA、CEA／IL-2抗肿瘤基因疫苗,并检测其激活的淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。方法将CEA、CEA／IL-2基因导入真核表达质粒pcDNA3．1,并转染入DC细胞,通过转染DC细胞活化淋巴细胞,将活化的淋巴细胞与人CEA＋肝癌细胞共培养,检测其对肿瘤细胞的杀伤作用。结果重组CEA、CEA／IL-2组均检测出较强的抗肿瘤效应,且重组CEA／IL-2组与重组CEA组差异具有统计学意义（P〈0．05）。结论联合CEA／IL-2基因疫苗具有抗肿瘤作用,且其抗肿瘤作用明显优于单基因CEA基因疫苗,证实了重组肿瘤基因疫苗对肿瘤细胞的杀伤作用。     

Bcl-xl和IGF-1受体特异性siRNA真核表达载体的设计、构建及鉴定

目的:构建能表达靶向Bcl-XL mRNA和IGF1RmRNA的siRNA真核表达质粒。方法:从GeneBank中搜索Bcl-XL(NM_138578)和IGF-1R(NM_000875)基因组标准序列,根椐siRNA设计原理各基因选取两段19bp的碱基序列作为靶目标,根据其序列构建siRNA真核表达质粒:psiBcl-XL1和psiBcl-XL2以及psiIGF1R1和psiIGF1R2。随机选取一段与人类基因无同源性的碱基序列,构建表达siRNA的真核表达质粒作为质粒对照psiHK。所构建的质粒均含有增强绿色荧光基因作为报告基因和SalI的酶切位点。质粒经酶切后,电泳鉴定酶切片段;基因测序分析质粒的碱基序列;用脂质体转染鼻咽癌CNE2细胞。转染后培养48h,做流式细胞仪检测转染率并采用共聚焦显微镜检测质粒绿色荧光蛋白的表达,通过RT-PCR检测各组质粒对其基因的干扰率。结果:质粒psiBcl-XL1、psiBcl-XL2、psiIGF1R1、psiIGF1R2和psiHK酶切后均可见400bp小带,与预期插入的目的基因大小一致,基因测序证实碱基序列与模板序列相符;经荧光显微镜下摄片计算转染效率发现:在转染48小时达最高(45%～50%之间);流式细胞仪检测转染后48小时的转染率为48.45%,并在共聚焦显微镜下观察均见大量的细胞表达绿色荧光;psiBcl-XL1、psiIGF-1R1、psiB-clXL2和psiIGF1R2干扰率分别是:22.1%、50%、70.6%、61.8%。结论:本实验构建了靶向Bcl-XLmRNA和IGF1R mRNA、表达短发夹RNA(short hairpin ribonucleic acid,shRNA)的真核表达质粒。重组质粒能有效转染人鼻咽咽癌细胞,psiBcl-XL2和psiIGF-1R2与psiBcl-XL1和psiIGF1R1相比,转染CNE2 48h后其对mRNA的干扰率相对较高。     

VEGFA基因重组真核表达载体的构建与表达

目的 构建VEGFA基因重组真核表达载体pEGFP-VEGFA,并检测其在人胚胎肾细胞(HEK293T)中的表达.方法 以人脐血单核细胞的RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增VEGFA基因,并将其定向插入真核表达载体pEGFP-Nl中,构建重组真核表达载体pEGFP-VEGFA.经限制性核酸内切酶BglII和SalI酶切和DNA测序鉴定后,用脂质体法将pEGFP-VEGFA转染HEK293T细胞,转染后24 h和48 h采用荧光显微镜观察pEGFP-VEGFA的表达.结果 pEGFP-VEGFA被双酶切为4 697 bp和1 251 bp两条条带,测序结果证实VEGFA序列与GenBank公布的VEGFA mRNA序列完全一致.在经转染的HEK293T细胞内观察到较强的绿色荧光,表明pEGFP-VEGFA成功转染HEK293T细胞,并在其中得到了表达.结论 成功构建重组真核表达载体pEGFP-VEGFA,为进一步研究VEGFA基因的生物学功能奠定了基础.     

白细胞介素7基因转染口腔癌细胞株的免疫调节效应的研究

目的：探讨IL-7基因转染人舌鳞癌Tca8113细胞株的免疫调节效应。方法：将已构建的原核／真核表达载体pBK—CMV／IL-7转染到癌细胞株中，采用MTT法检测转染前后肿瘤细胞培养上清对鼠脾细胞增殖的影响；ELISA法检测细胞培养上清转移生长因子β1（TGF-β1）、血管内皮生长因子（VEGF）和IL-10的浓度。将pPK—CMV／IL-7癌细胞株移植于小鼠腹腔，观察肿瘤细胞的成瘤性；并采用MTT法检测其NK杀伤活性。结果：IL-7基因转染癌细胞株的培养上清对鼠脾细胞的增殖抑制作用与对照组比较显著下降（P〈0．05），并且IL-7基因转染的肿瘤细胞产生TGF-β1、VEGF和IL-10三种免疫抑制因子明显降低（P〈0．05）；IL-7基因转染组鼠腹腔瘤结节明显小于对照组（P〈0．05）；NK的杀伤活性与对照组比较，具统计学差异（P〈0．05）。结论：IL-7基因转染人舌鳞癌细胞株具有抑瘤作用，其机理可能是通过降低肿瘤细胞产生免疫抑制因子，进而促进淋巴细胞增殖，提高NK的杀伤活性．     

白消安与人参皂苷Rb1协同促进肝癌细胞分泌HSP70及其增强NK细胞杀伤功能的研究

目的探讨化疗药物白消安与中药人参皂苷Rb1协同促进肝癌细胞(HepG2)分泌HSP70,进而增强NK细胞杀伤功能的免疫调节作用。方法 HepG2经过白消安、人参皂苷Rb1以及白消安联合人参皂苷预处理后分别收集培养上清,其对照为未经过药物处理的HepG2培养上清。通过ELISA方法检测上清中HSP70的表达水平;并将上清分别作用于NK细胞,随后检测其对靶细胞的杀伤率。结果 HepG2的培养上清能显著抑制NK细胞的杀伤功能;但是经过白消安、人参皂苷Rb1以及白消安联合人参皂苷预处理的HepG2的培养上清作用于NK细胞后,NK细胞杀伤功能显著恢复,其中以白消安联合人参皂苷组的作用最显著(P<0.05),同时NK细胞杀伤功能的恢复程度与上清中HSP70的浓度呈正相关(P<0.01)。结论肝癌细胞(HepG2)的培养上清对于NK细胞的杀伤功能有免疫抑制效应。白消安和人参皂苷Rb1能拮抗这种免疫抑制,二者联合应用有协同效应,其机制可能与增强癌细胞分泌免疫调节物质HSP70有关,提示适当联用化疗药物与传统中药能更有效的提高NK细胞的抗癌效应从而发挥免疫调节作用。     

pIRES-IL-24-PTEN双表达载体的构建及鉴定

目的构建携带人IL-24和10号染色体缺失的磷酸脂酶与PTEN双基因的真核表达载体,为研究其表达产物的抑癌机制提供基础。方法通过PCR方法获得PTEN、IL-24基因片段,进行T-A克隆,再酶切亚克隆到pIRES载体,酶切、测序鉴定正确后命名为pIRES-IL-24-PTEN载体。脂质体转染A549细胞,提取细胞的总蛋白,Western blot检测IL-24和PTEN蛋白的表达。结果酶切、测序显示pIRES-IL-24-PTEN载体序列正确,Western blot检测到IL-24和PTEN蛋白表达。结论成功构建pIRES-IL-24-PTEN载体,为后续研究奠定基础。     

重组人白细胞介素-21的原核表达及其复性与纯化

目的构建工程菌BL21/pET30a(+)-IL-21表达体系,表达并纯化出具有生物学活性的目的蛋白质。方法用基因工程方法构建表达质粒pET30a(+)-IL-21;在BL21大肠杆菌中诱导表达基因重组人白细胞介素-21(rhIL-21);提取包涵体并建立复性条件;用Ni-NTA凝胶纯化出rhIL-21;以NK92为效应细胞,观察rhIL-21对NK92的生物学作用,以此检测其活性。结果构建了重组质粒pET30a(+)-IL-21,工程菌BL21/pET30a(+)-IL-21能大量表达目的蛋白质;经复性和纯化得到具有生物学活性的rhIL-21。结论成功建立了人IL-21的原核表达体系,得到了有生物学活性的rhIL-21蛋白质。     

SiRNA沉默 HBx对 HepG2.2.15细胞人端粒酶逆转录酶基因表达的影响

目的探讨应用RNA干扰技术沉默HBx对HepG2．2．15细胞中hTERT基因表达的影响。方法（1）将pSIHBV／X质粒转染HepG2．2．15细胞,RT-PCR法评估沉默效率。（2）MTT法检测转染24h、48h、72h后细胞增殖情况。（3）Real-timePCR和Westernblot检测hTERT表达情况。结果测序结果显示pSIHBV／X质粒构建正确;RT-PCR检测HBVX基因的沉默效率为53．6％;MTT检测结果显示转染24h、48h、72h后H印G2．2．15细胞的增殖受抑制,与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05）;Real-timePCR和Western blot检测结果均显示,转染pSIHBV／X质粒后HepG2．2．15细胞中hTERT基因的mRNA水平和蛋白水平表达分别有不同程度的下调,与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论siRNA沉默HBx基因可抑制HepG2．2．15细胞中癌症标志基因hTERT的表达。     

逆转录病毒载体介导的白细胞介素-1Ra基因体外转染兔膝关节软骨细胞表达的研究

目的探讨运用重组逆转录病毒载体介导白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1Ra)体外转染兔膝关节软骨细胞,观察其在关节软骨细胞中的表达情况及其对软骨细胞生物学性状的影响。方法将构建含有目的基因的表达载体PLNCX2-IL-1Ra-GFP体外转染到兔膝关节软骨细胞,采用一氧化氮(NO)检测试剂盒检测基因转染对软骨细胞的影响,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养上清液中hIL-1Ra的表达情况。结果酶切和测序表明构建成功预期的真核表达载体PLNCX2-IL-1Ra-GFP;稳定转染软骨细胞后免疫荧光倒置显微镜观察到绿色荧光,证明转染成功;培养液中NO含量检测发现基因转染组比非基因转染组高,并且差异有统计学意义(P<0.05);ELISA检测发现基因转染组有一定量的hIL-1Ra表达,未转染组与空载体组均无基因表达,基因转染组与非基因转染组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论逆转录病毒载体PLNCX2介导的IL-1Ra能有效地转染到兔膝关节软骨细胞并获得稳定表达,同时转染后的软骨细胞增生活跃。为目的基因IL-1Ra转染治疗骨关节炎提供了理论基础。     

共表达人PUMA和HGF／NK4基因的重组腺病毒的制备及在胰腺癌细胞中的表达

目的制备同步表达HGF／NK4基因和PUMA基因的重组腺病毒,感染胰腺癌细胞后检测基因的有效表达。方法将PUMA基因和HGF／NK4基因以串联方式依次克隆至腺病毒穿梭载体,构建重组穿梭载体pAdTrack-PUMA-NK4,转化大肠杆菌BJ5183并在细菌内与腺病毒载体同源重组制备重组腺病毒载体pAd-PUMA-NK4。PacⅠ酶切后转染至HEK293细胞包装得到重组腺病毒。一定滴度的腺病毒感染人胰腺癌细胞株,荧光定量RT-PCR检测细胞中NK4和PUMA基因mRNA表达水平。结果双酶切重组pad-PUMA-NK4穿梭载体鉴定证实目的基因PUMA和HGF／NK4正确克隆;重组腺病毒载体经PacⅠ酶切得到特异的酶切产物转染HEK293细胞后成功包装出重组腺病毒;病毒感染胰腺癌细胞后3-9d内PUMA和NK4基因的表达水平较高,整体持续表达可维持2w。结论成功构建了同时表达NK4和PUMA基因的重组腺病毒载体并包装出相应的重组腺病毒颗粒,该腺病毒能有效感染胰腺癌细胞并高表达NK4和PUMA基因,这为进一步确定NK4和PUMA基因的功能及指导双基因联合治疗胰腺癌提供了理论依据和必要的材料。