转染α-突触核蛋白的SH-SY5Y细胞增强对鱼藤酮毒性的耐受

目的探讨α-突触核蛋白(α-synuc le in)在鱼藤酮处理的人类多巴胺能SH-SY5Y细胞内的作用。方法用脂质体转染的方法将-αsynuc le in基因转染入SH-SY5Y细胞内,并筛选稳定表达-αsynuc le in的细胞。经过不同浓度的鱼藤酮处理后,测定细胞活力、细胞内氧化应激和抗氧化能力。结果经鱼藤酮处理后,所有的细胞均表现为细胞活力下降和细胞内氧化应激增强。与正常SH-SY5Y细胞相比,过表达-αsynuc le in的细胞表现为较高的细胞活力和抗氧化能力(P<0.01)。结论α-synuc le in过表达可能通过增强SH-SY5Y细胞活力和抗氧化能力,来部分对抗鱼藤酮的毒性作用。     

人AMPKα2基因pEGFP-N1-AMPKα2表达载体的构建和鉴定

目的 构建表达人单磷酸腺苷激活的蛋白激酶催化亚单位α2(AMPKα2)基因的pEGFP-N1-AMPKα2载体,转染SH-SY5Y细胞系,观测其上调AMPKα2基因的效果.方法 PCR法扩增AMPKα2基因片段,克隆到pEGFP-N1质粒载体上.对重组质粒进行DNA序列测定和酶切分析.用质脂体将重组质粒pEGFP-N1-AMPKα2转染到SH-SY5Y细胞系,经G418筛选阳性克隆后,用RT-PCR和Western blot法检测AMPKα2的mRNA和蛋白表达.流式细胞仪检测转染重组质粒细胞内ROS变化.结果 经DNA测序和酶切鉴定表明,pEGFP-N1-AMPKα2表达载体构建成功.重组质粒pEGFP-N1-AMPKα2转染SH-SY5Y细胞系后,细胞中AMPKα2蛋白表达量明显增高.SH-SY5Y细胞转染pEGFP-N1-AMPKα2后,ROS含量增多.结论 成功构建了人AMPKα2基因的pEGFP-N1-AMPKα2表达载体.pEGFP-N1-AMPKα2能有效上调AMPKα2基因在SH-SY5Y细胞系中的表达,为将来应用其研究AMPK在局麻药致细胞损伤中的作用奠定了基础.     

人野生型和A53T突变型α-突触核蛋白慢病毒表达载体的构建及在PC12细胞中的转染

为构建长期稳定表达人野生型和A53T突变型α-突触核蛋白的PC12细胞株,我们首先制备了慢病毒表达载体,经测序鉴定正确后转染PC12细胞,然后通过细胞的免疫荧光染色检测α-synuclein-V5融合蛋白,PCR法扩增转基因PC12细胞的SNCA片段后进行测序检测突变基因,以及Western blot法检测PC12细胞α-synuclein的表达,从而鉴定转基因细胞能否稳定表达目的基因。结果显示:经测序,pLenti6/V5-SNCA-WT和pLenti6/V5-SNCA-A53T表达质粒构建成功;免疫荧光染色示基因转染后,超过95%的PC12细胞中有α-synuclein-V5融合蛋白表达;转基因细胞的SNCA片段测序结果显示,慢病毒表达载体成功整合入PC12细胞基因组;Western blot法检测结果示转基因PC12细胞能够过表达α-synuclein蛋白。以上结果表明我们已成功构建了人野生型和A53T突变型α-突触核蛋白慢病毒表达载体,并且成功建立了稳定的过表达人野生型和A53T突变型α-突触核蛋白的PC12细胞株,这为进一步研究α-突触核蛋白的生理功能及其在Parkinson病发病机制中的作用奠定了基础。     

α-synuclein在体外培养SH-SY5Y细胞中过表达致自体吞噬

目的：观察α-synuclein转基因细胞内α-synuclein过表达对细胞超微结构的影响。方法：Lipofectamine法转染SH—SY5Y细胞,用G418对转基因细胞进行筛选,免疫荧光细胞化学检测α-synuclein表达,电子显微镜观察转基因细胞超微结构的改变。结果：转基因细胞内出现大小不等、边界明显的自体吞噬体并伴有线粒体结构紊乱。结论：α-synuclein过表达可致细胞出现自体吞噬现象。     

α-synuclein-pEGFP真核表达载体的构建及其在SH-SY5Y细胞中的表达

为了构建 α-synuclein-p EGFP真核表达载体 ,检测其在 SH-SY5 Y细胞内的表达 ,本研究应用下述方法 :PCR扩增 α-synuclein基因并消除终止密码子 ;PCR产物连入 p GEM T-easy载体 ,经测序确认无误后 ,亚克隆入 p EGFP-N1,构建α-synucle-in-p EGF P真核表达载体 ;Lipofect AMINE法转染 SH-SY5 Y细胞 ;荧光显微镜检测报告基因表达产物 EGFP,原位杂交和免疫荧光细胞化学法检测α-synuclein m RNA及其蛋白表达。结果显示 ,该载体转染 SH-SY5 Y细胞后 ,可在细胞内观察到报告基因和目的基因的表达产物。结论 :α-synuclein-p EGFP真核表达载体构建成功 ,并可在细胞内表达。本工作为今后动态观察研究α-synu-clein致 Parkinson病多巴胺能神经细胞损伤机制奠定基础     

病毒硫氧还蛋白基因在Neuro2A细胞中的重组与表达

背景：目前对抗氧化基因硫氧还蛋白的研究逐步受到重视,但从基因治疗的角度对其研究较少。 目的：采用硫氧还蛋白转染Neuro-2A细胞,观察细胞内表达相应蛋白因子对细胞的具体保护效果,并分析其发挥保护作用的可能机制。 方法：以质粒PIRES2-EGFP-TRX转染Neuro-2A细胞,经RT-PCR鉴定,建立能够稳定表达硫氧还蛋白的细胞株。利用不同浓度的H₂O₂处理正常细胞及转染细胞,建立氧化应激模型。观察受到氧化损伤后两组细胞的形态学、存活率、还原型谷胱甘肽的浓度及细胞内DNA链断裂情况。 结果与结论：经H₂O₂作用后,两组细胞形态均出现损伤,但转染组细胞比正常组细胞损伤减轻、细胞存活率升高、细胞内还原型谷胱甘肽水平增高、DNA链断裂程度减轻。说明人类硫氧还蛋白基因可以在Neuro-2A细胞中被重组并顺利表达,对细胞具有一定的保护作用;这一作用可能是通过清除氧自由基,维持细胞内还原型谷胱甘肽水平,从而保护细胞DNA免受氧化性损伤来实现的。     

α-synuclein-EGFP在体外培养SH-SY5Y细胞中过表达对包涵体形成及线粒体结构改变的影响

为了观察 α-synuclein-p EGFP真核载体在 SH-SY5 Y细胞内表达状况及其对细胞的影响 ,本研究用 L ipofect AMINE法转染 SH-SY5 Y细胞 ,用荧光显微镜检测报告基因表达产物 EGFP,用荧光免疫细胞化学法检测α-synuclein蛋白表达以及用 H-E染色、光学显微镜观察转基因表达产物在细胞内的积聚 ,电镜观察转基因细胞超微结构形态学变化 ,rhodamine12 3染色、荧光显微镜检测线粒体跨膜电位变化。结果证明 ,该载体转染 SH-SY5 Y细胞后 ,在细胞内同时表达报告基因和目的基因 ;外源基因的表达产物可在细胞内积聚形成包涵体并引起线粒体结构和功能改变。本研究结果提示 ,本实验获得的细胞模型可模拟 Parkinson病发生过程中一些基本的神经病理学特点 ,可为进一步探讨 Parkinson病患者多巴胺能神经元变性缺失机制提供依据     

DARPP-32基因对SH-SY5Y细胞药物敏感性的调节作用

目的：探讨DARPP-32基因对人神经母细胞瘤细胞药物敏感性的调节作用。方法：构建DARPP-32基因的真核表达载体和小干扰RNA载体，并将它们转导入人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y，G418筛选后获得稳定转染的阳性克隆后，应用RT-PCR和Western blotting进行鉴定；MTT法检测细胞转染前后药物敏感性的变化；流式细胞仪检测细胞转染前后对阿霉素的蓄积浓度的变化；RT-PCR和Western blotting检测细胞转染前后耐药相关蛋白P-gp、MRP和凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达变化。结果：成功构建了DARPP-32基因的真核表达载体和小干扰RNA载体；筛选到稳定的DARPP-32高/低表达的神经母细胞瘤细胞模型；MTT试验和流式细胞仪检测结果显示，上调DARPP-32的表达能够显著增强神经母细胞瘤细胞对长春新碱、阿霉素、5-氟尿嘧啶和顺铂的敏感性，提高细胞内阿霉素的蓄积（P<0.05），转染DARPP-32小干扰RNA后的细胞对化疗药物的敏感性降低，细胞内的阿霉素蓄积量显著减少（P<0.05）；RT-PCR和Western blotting结果显示，DARPP-32能够下调 P-gp 和Bcl-2的表达。结论：DARPP-32基因能够调节神经母细胞瘤细胞对化疗药物的敏感性，具有较好的临床应用前景。     

过表达促红细胞生成素脐带间充质干细胞抑制缺血缺氧SH-SY5Y细胞凋亡及机制

背景：前期研究成功构建过表达促红细胞生成素的脐带间充质干细胞(erythropoietin-overexpressed umbilical cord mesenchymal stem cells,EPO-MSCs),发现其可以显著减少缺血缺氧人神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y)细胞的凋亡。目的：探究EPO-MSCs对缺血缺氧SH-SY5Y细胞可能的神经保护机制及其相关表观遗传学机制。方法：用氧-葡萄糖剥夺法缺血缺氧诱导SH-SY5Y细胞损伤,分别与慢病毒转染空载质粒的脐带间充质干细胞(NC-MSCs)、EPO-MSCs共培养后进行转录组测序,根据组间差异基因进行相关分析。同时应用多因子法检测缺血缺氧性脑病患者和对照组脑脊液上清及共培养细胞上清炎性因子表达水平。蛋白组学检测NC-MSCs、EPO-MSCs差异表达蛋白。应用染色体靶向切割和标签化(CUT&Tag)测序技术检测基因组H3K4me2修饰情况,并与转录组测序联合分析。慢病毒载体感染构建稳定敲低REST的SH-SY5Y细胞,应用qRT-PCR、Western blot检测REST的表达水平,然后再缺血缺氧处理并与EPO-...     

α硫辛酸抑制6-羟基多巴胺诱导的PC12细胞中α突触核蛋白(α-synuclein)表达及机制

目的研究α硫辛酸(α-LA)对6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导的帕金森病细胞模型中α突触核蛋白(α-syn)表达的影响及其机制。方法采用6-OHDA诱导PC12细胞建立帕金森病细胞模型,用α-LA处理。噻唑蓝(MTT)法检测细胞活性,比色法检测细胞内铁含量和细胞内丙二醛(MDA)含量,荧光探针2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)染色法检测细胞内活性氧(ROS)水平,Western blot法检测α-syn蛋白表达水平。结果与正常对照组相比,模型组细胞活性显著降低,细胞内铁含量、MDA含量、ROS水平均显著增高,α-syn蛋白水平显著增加;与模型组相比,α-LA处理的细胞活性显著升高,细胞内铁含量、MDA含量、ROS水平显著降低,α-syn蛋白水平显著降低。结论α-LA能抑制α-syn过表达,减轻6-OHDA诱导所致的PC12细胞损伤,这可能与α-LA降低细胞内铁含量、氧化应激水平有关。     

突变型APP基因转染对神经细胞尼古丁受体的影响

目的 探讨阿尔茨海默病(AD)发病机制中的重要物质淀粉样蛋白前体蛋白(APP)高表达对神经型尼古丁受体(nAChR)的影响.方法 将含有瑞典家族性AD双突变的APP670/671基因(APP_(SWE))转入神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞和原代培养的大鼠神经细胞,得到体外构建的高表达APP_(SWE)细胞模型;用即时荧光定量PCR和Western blot方法分别测定APP mRNA、可溶性APP和总APP蛋白表达水平以及nAChR mRNA和蛋白表达水平;用放射性配体[~3H]epibatidine进行nAChR-配体结合试验.结果 转染APP_(SWE)质粒的SH-SY5Y细胞和原代培养的神经细胞中APP mRNA和总APP蛋白表达水平显著升高,在SH-SY5Y细胞的培养液中检测到αAPP分泌量下降;SH-SY5Y细胞转染组α7 nAChR蛋白和mRNA表达水平显著升高,而α3 nAChR蛋白和mRNA表达水平明显下降,并且[~3H]epibatidine配体结合位点明显减少;原代培养的神经细胞转染组α4 nAChR蛋白水平明显下降,但其mRNA水平无明显变化.结论 APP蛋白高表达使体外培养神经细胞中nAChR发生改变,其中α7 nAChR表达水平升高,而含α3和α4亚单位的nAChR表达水平降低,表明APP代谢紊乱可对nAChR产生一定的影响,在AD的发病机制中有重要作用.     

Fraxetin prevents rotenone-induced apoptosis by induction of endogenous glutathione in human neuroblastoma cells

Fraxetin belongs to an extensive group of natural phenolic anti-oxidants. In the present study, using a human neuroblastoma SH-SY5Y cells, we have investigated the protective effects of this compound on modifications in endogenous reduced glutathione (GSH), intracellular oxygen species (ROS) and apoptotic death on rotenone-mediated cytoxicity. Incubation of cells with the fraxetin led to a significant elevation dose-dependent of cellular GSH and this was accompanied by a marked protection against rotenone-mediated toxicity, which was also significantly reversed in the cells with buthionine sulfoximine (BSO) co-treatment. Taken together, this study suggested that intracellular GSH appeared to be an important factor in fraxetin-mediated cytoprotection against rotenone-toxicity in SH-SY5Y cells. Fraxetin at 10-100 muM inhibited the formation of ROS, cytochrome c release, activation of caspase-3 and 9, and suppressed the up-regulation of Bax, whereas no significant change occurred in Bcl-2 levels. Our results indicated that the anti-oxidative and anti-apoptotic properties render this natural compound potentially protective against rotenone-induced cytotoxicity.     

Neuroglobin and cytoglobin overexpression protects human SH-SY5Y neuroblastoma cells against oxidative stress-induced cell death

Although reactive oxygen species (ROS) at physiological concentrations are required for normal cell function, excessive production of ROS is detrimental to cells. Neuroglobin and cytoglobin are two globins, whose functions are still a matter of debate. A potential role in the detoxification of ROS is suggested. The influence of neuroglobin and cytoglobin on cell death after oxidative stress in human neuroblastoma SH-SY5Y cells was evaluated. Exposure of SH-SY5Y cells to paraquat or H₂O₂ resulted in a concentration- and time-dependent induction of apoptotic and necrotic cell death. H₂O₂ was 16 times more potent to induce cell death as compared to paraquat. SH-SY5Y cells transfected with plasmid DNA containing the neuroglobin or cytoglobin sequence showed enhanced survival after exposure to 300 μM H₂O₂ for 24 h as compared to untransfected controls. This finding suggests that neuroglobin and cytoglobin protect SH-SY5Y cells against oxidative stress-induced cell death.     

The use of nitroxide radical-containing nanoparticles coupled with piperine to protect neuroblastoma SH-SY5Y cells from Aβ-induced oxidative stress

The antioxidant effect and potential mechanism of nitroxide radical-containing nanoparticles (RNPs) coupled with piperine (PI) were investigated in human neuroblastoma SH-SY5Y cells. The effects of RNP/PI on SH-SY5Y cell lines was determined by WST assay for cell viability, nitroblue tetrazolium and deoxyribose assay for reactive oxygen species generation, ELISA assay for reactive oxygen species products and apoptotic cell death, and biochemical techniques for catalase and glutathione peroxidase activity. The RNP/PI significantly reduced the reactive oxygen species level and reactive oxygen species products compared with those of cells treated with RNPs alone. The RNP/PI treatment enhanced catalase and glutathione peroxidase activity. The combination of RNP/PI has been found to have an augmented antioxidant effect on an Alzheimer's model in vitro. The mechanism of the protective effect of this combination therapy was correlated in this study with its ability to reduce the generation of reactive oxygen species and prevent apoptosis via scavenging enzyme action pathways.     

花姜酮通过抑制氧化应激减轻MPP~+诱导的SH-SY5Y细胞损伤

目的:探讨花姜酮(zerumbone,ZER)对1-甲基-4-苯基-吡啶鎓离子(1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP~+)诱导的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞损伤的作用及其可能的分子机制。方法:采用CCK-8法检测MPP~+对SH-SY5Y细胞的毒性作用以及ZER的保护作用,采用流式细胞术检测活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)含量和细胞凋亡情况,采用短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰技术抑制人帕金森病蛋白7(Parkinson disease protein 7,PARK7)基因的表达,采用Western blot法检测PARK7、核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)和血红素氧合酶1(heme oxygenase-1,HO-1)的蛋白表达水平。结果:MPP~+可显著抑制SH-SY5Y细胞活力(P0.05),并呈剂量和时间依赖性;ZER可使经600μmol/L MPP~+处理24 h的SH-SY5Y细胞活力升高,PARK7和Nrf2蛋白表达水平显著升高(P0.05),ROS含量和细胞凋亡明显减少(P0.05),抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)具有相似的作用;沉默PARK7基因后,Nrf2和HO-1蛋白的表达水平明显下降(P0.05),ROS含量和细胞凋亡显著增加(P0.05)。结论:ZER可在体外剂量依赖性地减轻MPP~+对SH-SY5Y细胞的毒性作用,这可能与ZER激活PARK7/Nrf2/HO-1通路,继而抑制MPP~+诱导的ROS生成和细胞凋亡有关。     

RUNX3小干扰RNA对SH-SY5Y细胞生长和药物敏感性的作用

目的：探讨RUNX3基因对人神经母细胞瘤细胞生长和药物敏感性的调节作用。方法:构建RUNX3基因的小干扰RNA载体并将其转导入SH-SY5Y细胞，G418筛选后获得稳定转染的阳性克隆后，应用RT-PCR和Western blotitng进行鉴定；MTT法和流式细胞仪检测细胞转染前后生长速度和细胞周期的变化；MTT法和流式细胞仪检测细胞转染前后对阿霉素敏感性的变化；Western blotting检测细胞转染前后细胞周期相关蛋白cyclin D1、CDK4、CDK6、p21、 p27和凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax以及耐药相关蛋白P-gp、MRP的表达变化。结果:成功构建了RUNX3的小干扰RNA载体并将其转染SH-SY5Y细胞；筛选到稳定的RUNX3低表达的神经母细胞瘤细胞模型；MTT和流式细胞仪检测结果显示，转染RUNX3小干扰RNA后的细胞的生长速度显著快于对照组（P<0.05），且G1期的细胞比率显著低于对照组（P<0.05）；MTT法和流式细胞仪结果显示, 转染RUNX3小干扰RNA后的细胞对化疗药物的敏感性降低，细胞内的阿霉素蓄积量显著减少（P<0.05）；Western blotting显示，转染RUNX3小干扰RNA后的细胞中Bcl-2、P-gp和cyclin D1的表达明显增高，p21的表达明显降低。结论:下调RUNX3基因能促进神经母细胞瘤细胞生长，降低细胞对化疗药物的敏感性，提示RUNX3在神经母细胞瘤的发生和发展中可能扮演重要角色。     

Bcl-xl基因克隆及其在SH-SY5Y细胞中的表达

目的研究Bcl-xl基因在SH-SY5Y细胞中的表达。方法构建真核表达载体pIRES2-EGFP/Bcl-xl,采用脂质体介导将重组质粒导入SH-SY5Y细胞,RT-PCR和Western-blot检测外源基因表达。结果本实验成功构建了真核表达载体pIRES2-EGFP/Bcl-xl,并用脂质体介导的方法高效转染SH-SY5Y细胞,RT-PCR显示有Bcl-xlmRNA表达增加,Western-blot显示有32kD的蛋白质表达增加。结论重组质粒pIRES2-EGFP/Bcl-xl经转染能够在SH-SY5Y细胞中高效表达,为进一步研究Bcl-xl对SH-SY5Y细胞的生物学功能奠定了基础。     

Actinomycin D enhances TRAIL-induced caspase-dependent and -independent apoptosis in SH-SY5Y neuroblastoma cells

Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) has attracted great attention as a promising anti-cancer reagent. Recombinant soluble TRAIL (rsTRAIL) derivatives induce apoptosis in various cancer cells, but not in most normal cells. However, a number of cancerous cell types are resistant to TRAIL cytotoxicity, limiting its application in cancer therapy. In the present study, we report that actinomycin D (Act D) pretreatment increases apoptosis in human neuroblastoma SH-SY5Y cells treated with rsTRAIL. Both caspase-9 and caspase-7, but not caspase-3, were activated during the apoptosis process. z-VAD-fmk, a pan-caspase inhibitor, only partially suppressed apoptosis of the cells, suggesting that the Act D-enhanced apoptosis of SH-SY5Y occurred via caspase-dependent and -independent manners. In cells pretreated with Act D, we found decreased mitochondrial transmembrane potential, high levels of reactive oxygen species (ROS), and up-regulated apoptotic-inducing factor (AIF). Cell death was blocked in cells stably transfected with AIF-siRNA plasmid. Taken together, these data indicate that Act D sensitizes SH-SY5Y cells to rsTRAIL-induced apoptosis via caspase activation, impairment of the mitochondrial membrane, release of ROS, and up-regulation of AIF expression. This study provides a novel strategy for the therapy of malignant neuroblastoma resistant to rsTRAIL cytotoxicity.     

小泛素样修饰蛋白-1对α-突触核蛋白基因突变或过表达诱导的细胞包涵体形成及细胞凋亡的影响

目的 探讨α-突触核蛋白(α-synuclein)的小泛素样修饰蛋白(small ubiquitin-like modifier,SUMO)-1对α-synuclein基因过表达或突变诱导的细胞包涵体形成及细胞凋亡的影响.方法 构建野生型(WT)、A53T突变型和缺失SUMO-1互作氨基酸的K96R突变型、K96R-A53T突变型α-synuclein真核表达质粒.应用脂质体介导转染方式将构建好的质粒转入HEK293细胞;48 h后Hoechst 33258染色,采用Axiovert200型倒置荧光显微镜观察对细胞的影响,应用四甲基偶氮唑盐检测细胞活力,Annexin V-PE流式细胞仪检测细胞凋亡.结果 将构建所得真核表达质粒经双酶切鉴定及DNA测序证实;将WT型、A53T型、K96R型、K96R-A53T型α-synuclein真核表达质粒转染HEK293细胞,48 h后伊红染色显示转染野生型α-synuclein- pEGFP组及A53T突变型组某些细胞胞浆内出现圆形的嗜酸性小体(类Lewy小体)形成,分别占细胞总数的9.4％和11.7％,转染K96R及K96R-A53T融合表达载体组细胞内嗜酸性小体形成比率为10.2％和9.8％,两两相比差异无统计学意义(P＞0.05).Hoechst染色结果显示,WT组、A53T组细胞核变大,出现着色不均,染色质聚集成斑点状,未见核浓缩或核碎裂.K96R组及K96R-A53T组胞核着色基本均匀.采用四甲基偶氮唑盐法结果显示转染空质粒组细胞活力为96.2％,转染WT组、A53T组细胞活力下降至53.4％及56.1％,转染K96R组及K96R-A53T组细胞活力为72.3％和69.8％;转染48 h后,WT组、A53T组细胞凋亡率分别为32.2％和34.1％,转染K96R组及K96R-A53T突变组细胞凋亡率下降为19.4％和20.3％,两两相比差异有统计学意义(P＜0.05).结论 SUMO-1对α-synuclein基因过度表达及α-synuclein基因致病突变A53T诱导的细胞包涵体的形成无明显影响;SUMO-1可加强α-synuclein基因过度表达及α-synuclein基因致病突变A53T诱导的细胞毒性及细胞凋亡,提示SUMO-1参与了细胞凋亡过程.