利用脱细胞骨软骨纤维支架形成可修复软骨缺损的软骨-骨复合组织

【立论依据】 目前,因自体软骨组织修复力极其有限,故对软骨缺损的治疗是临床上的一大难题。现在的治疗方式多为手术移植治疗,包括自体骨移植,单一软骨组织移植以及高分子材料支架移植,但存在损伤大,细胞存活率低和机体相容性差等不足。对此,体外构建一种克服传统治疗缺点的新的组织工程材料显得极其重要。 【设计思路】 因自体骨移植损伤大,故设计体外构建组织材料;因单一软骨组织移植机体相容性差,故设计构建软骨骨复合组织;因软骨细胞存活率低,故设计构造脱细胞骨软骨纤维支架种植细胞,提供骨、软骨细胞最佳生长微环境。所以,实验设计体外利用异体脱细胞骨软骨纤维支架构建软骨-骨复合组织,再移植到动物体内生长,从而提供一种治疗软骨缺损性疾病的新的组织工程材料。 【实验内容】 (1)分离、纯化与培养兔骨髓中的间充质干细胞。(2)体外脱细胞处理家兔髌骨股骨侧的骨软骨块构建骨软骨纤维支架,对支架进行力学测试、镜下观察、异体免疫性观测等。(3)将间充质干细胞移植到脱细胞支架上,利用支架双层存留细胞外基质的诱导作用在骨和软骨层分别诱导干细胞分化形成成骨细胞和软骨细胞。(4)将得到的复合组织移植到裸鼠背部皮下,跟踪观测组织直径大小变化、生长状况、组织构成等。(5)构建兔膝关节股骨关节面软骨缺损模型,进行移植手术,持续观测实验对象膝关节活动度及应力性、影像学表现,最后做缺损修补处切片镜下观察对比,分析评估实验构建组织工程材料是否优于传统移植材料。 【材料】 实验动物家兔、裸鼠;30 g/L戊巴比妥钠、胎牛血清、0.35 mmol/L苯甲基磺酰氟、1% TritonX-100等。 【可行性】 实验动物和相关试验方法为常规操作,且已有相关实验基础。 【创新性】 实验设计的骨软骨复合组织克服了传统移植所用单一软骨组织机体相容性低和细胞存活率低的缺点,可以实现从试验台到临床的转化医学概念,为软骨缺损性疾病的移植治疗提供思路,有重要的临床意义。     

组织工程化皮瓣的构建

目的应用脂肪组织来源干细胞(ASCs)在体外构建组织工程脂肪并与已构建的复合皮组装培育,试构建出含脂肪层的组织工程化皮瓣。方法(1)构建组织工程脂肪从脂肪组织中分离培养ASCs并进行三系分化诱导鉴定。ASCs与胶原凝胶混合并进行体外成脂诱导,诱导15 d后分别进行倒置显微镜、油红O染色及HE染色观察。(2)构建复合皮从包皮组织中分离培养表皮细胞(Kc)和成纤维细胞(Fb)。Fb与胶原凝胶混合后培养5 d,将Kc接种到含有Fb的凝胶表面,在液面下培养4 d后移至气-液界面继续培养10 d形成复合皮。(3)构建含皮下脂肪组织的3层结构的皮肤复合组织将培养的复合皮与脂肪组织按正常皮肤结构顺序组装后继续培养3 d并行HE染色观察。结果(1)ASCs具有成脂、成软骨和成骨分化能力。ASCs凝胶复合物体外成脂诱导15 d后,可见细胞内充满圆形脂滴,呈单房或多房形,油红O染色及HE染色均显示为成熟脂滴。(2)经过气-液界面培养后,Kc成层分化,形成基底上层。(3)组装培育后的皮肤复合组织分3层,表层Kc成层分化并形成基底上层;中层和底层连接处细胞聚集;成脂分化的ASCs位于底层。结论分别应用Kc、Fb和ASCs三种细胞,在体外构建出组织工程化脂肪和复合皮,且按序组装培育,可构建出组织工程化皮瓣。     

组织工程化皮瓣构建的初步研究

应用脂肪组织来源干细胞（ASCs）在体外构建组织工程脂肪并与已构建的复合皮组装培育,试构建出含脂肪层的组织工程化皮瓣。方法（1）构建组织工程脂肪从脂肪组织中分离培养ASCs并进行三系分化诱导鉴定。ASCs与胶原凝胶混合并进行体外成脂诱导,诱导15 d后分别进行倒置显微镜、油红O染色及HE染色观察。（2）构建复合皮从包皮组织中分离培养表皮细胞（Kc）和成纤维细胞（Fb）。Fb与胶原凝胶混合后培养5 d,将Kc接种到含有Fb的凝胶表面,在液面下培养4 d后移至气-液界面继续培养10 d形成复合皮。（3）构建含皮下脂肪组织的3层结构的皮肤复合组织将培养的复合皮与脂肪组织按正常皮肤结构顺序组装后继续培养3 d并行HE染色观察。结果（1）ASCs具有成脂、成软骨和成骨分化能力。ASCs凝胶复合物体外成脂诱导15 d后,可见细胞内充满圆形脂滴,呈单房或多房形,油红O染色及HE染色均显示为成熟脂滴。（2）经过气-液界面培养后,Kc成层分化,形成基底上层。（3）组装培育后的皮肤复合组织分3层,表层Kc成层分化并形成基底上层;中层和底层连接处细胞聚集;成脂分化的ASCs位于底层。结论 分别应用Kc、Fb和ASCs三种细胞,在体外构建出组织工程化脂肪和复合皮,且按序组装培育,可构建出组织工程化皮瓣。     

脱钙骨基质支架构建组织工程骨的实验研究

目的以同种异体骨脱钙骨基质(demineralized bone matrix,DBM)为支架材料,复合体外诱导培养的人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs),构建组织工程骨并通过裸鼠皮下异位成骨实验及裸鼠皮下致瘤性实验验证其成骨效果及安全性.方法贴壁法培养hMSCs,体外诱导培养扩增,以1.857×106/ml的密度与DBM复合构建组织工程骨,体外培养,并在扫描电镜下观察细胞与材料复合情况,进行组织学观察.同时进行了裸鼠皮下异位成骨实验.结果细胞与支架复合后3 d,细胞与DBM表面及孔隙可实现良好复合;复合后5 d,扫描电镜观察到细胞基质分泌旺盛,充满支架孔隙.裸鼠皮下成骨实验证明其成骨效果良好.结论以本实验中使用的细胞培养方法扩增、诱导分化的种子细胞生物安全性好,自制的DBM具有良好的生物相容性,可为种子细胞生长提供较好的三维空间,按照标准化工艺流程制备的组织工程骨安全、有效.     

微球化骺板细胞构建兔异位骺软骨实验

目的探讨海藻酸钙-多聚赖氨酸微球复合骺板细胞,在兔体内异位构建组织工程化骺软骨的可行性。方法将兔异体骺板软骨细胞接种于海藻酸钙-赖氨酸凝胶微球中,体外培养后植入兔背部皮下,分别于2、4、8周取材进行大体及组织学观察。结果体外培养时微球中骺板细胞生长、增殖情况良好;移植皮下后第4周取材可见外形呈类骺软骨样组织块,行HE、甲苯胺蓝、番红“O”及Ⅱ型胶原等染色,镜下观察可见大量软骨细胞及类软骨陷窝样结构,植入的海藻酸钙微球周围组织无明显炎症反应。结论海藻酸钙-赖氨酸具有良好的组织相容性,复合异体骺板细胞形成微球,植入同种异体动物体内可以构建类骺软骨样组织。     

组织工程化皮瓣的构建

摘要：目的应用脂肪组织来源干细胞（ASCs）在体外构建组织工程脂肪并与已构建的复合皮组装培育,试构建出含脂肪层的组
织工程化皮瓣。方法（1）构建组织工程脂肪从脂肪组织中分离培养ASCs并进行三系分化诱导鉴定。ASCs与胶原凝胶混合并
进行体外成脂诱导,诱导15 d后分别进行倒置显微镜、油红O染色及HE染色观察。（2）构建复合皮从包皮组织中分离培养表皮
细胞（Kc）和成纤维细胞（Fb）。Fb与胶原凝胶混合后培养5 d,将Kc接种到含有Fb的凝胶表面,在液面下培养4 d后移至气-液
界面继续培养10 d形成复合皮。（3）构建含皮下脂肪组织的3层结构的皮肤复合组织将培养的复合皮与脂肪组织按正常皮肤结
构顺序组装后继续培养3 d并行HE染色观察。结果（1）ASCs具有成脂、成软骨和成骨分化能力。ASCs凝胶复合物体外成脂
诱导15 d后,可见细胞内充满圆形脂滴,呈单房或多房形,油红O染色及HE染色均显示为成熟脂滴。（2）经过气-液界面培养后,
Kc成层分化,形成基底上层。（3）组装培育后的皮肤复合组织分3层,表层Kc成层分化并形成基底上层;中层和底层连接处细胞
聚集;成脂分化的ASCs位于底层。结论分别应用Kc、Fb和ASCs三种细胞,在体外构建出组织工程化脂肪和复合皮,且按序组
装培育,可构建出组织工程化皮瓣。
     

不同支架材料构建组织工程化口腔黏膜回植动物的比较

目的 以不同支架材料聚羟基乙酸(PGA)和脱细胞真皮基质材料(Alloderm)构建组织工程化口腔黏膜后回植裸鼠,观察其存活及生长情况.方法 人口腔黏膜成纤维细胞(OFC)接种至PGA支架上培养7 d后,将口腔黏膜上皮细胞分别与PGA-OFC和Alloderm复合,液面下培养4 ～ 7 d后,进行气-液界面培养7 d,然后回植裸鼠背部皮下.回植后7、14 d分别取材观察.结果 以PGA和Alloderm为支架构建的组织工程化口腔黏膜均可在裸鼠体内至少存活2周,并与裸鼠自身组织融合生长;在观察的第2周,以PGA为支架构建的组织工程化口腔黏膜出现血管化,以Alloderm为支架构建的组织工程化口腔黏膜上皮分化较为明显.结论 PGA孔隙有利于细胞和血管的生长,但其强度随降解而降低;以Alloderm为支架的构建物显示出较清晰的组织学结构.     

鸵鸟羟基磷灰石陶瓷支架负载骨髓基质细胞异位成骨性能

目的:观察鸵鸟羟基磷灰石陶瓷支架负载骨髓基质细胞后植入裸鼠皮下的成骨性能. 方法:获取兔髂骨松质骨骨髓基质细胞,体外分离、扩增、诱导后接种于鸵鸟羟基磷灰石支架. 支架/细胞复合物植入裸鼠背部皮下,支架单纯植入作为对照. 植入后3, 6 wk取材,通过大体、组织学观察评价成骨活性. 结果:支架/细胞复合物植入后3 wk,以软骨为主的大量未成熟骨在材料表面及孔隙内形成;植入后6 wk,更多的成熟骨形成. 在支架材料和骨组织的邻接区域见成骨细胞及破骨细胞,部分区域有血管和多核巨细胞分布,可见软骨内成骨方式. 结论:支架/细胞复合物显示良好的成骨活性,鸵鸟羟基磷灰石陶瓷可以用于骨组织工程支架材料.     

同种异体骨髓基质细胞移植修复兔膝关节骨软骨缺损

目的 探讨同种异体骨髓基质细胞(BMSCs)作为种子细胞在软骨组织工程中的应用.方法 同种异体BMSCs与丝素蛋白-异体松质骨共培养构建组织工程化骨软骨复合体,移植修复兔膝关节骨软骨缺损,术后2、4、12周取材,行组织学观察及Ⅱ型胶原、Brdu免疫组化染色.结果 BMSCs能在丝素蛋白和松质骨支架上较好的黏附、生长,共培养后成功地构建了组织工程化骨软骨复合体;体内移植后生成透明软骨样组织并修复了骨软骨缺损.结论 同种异体BMSCs可作为软骨组织工程的种子细胞,丝素蛋白-松质骨双相支架负载同种异体BMSCs可用于骨软骨缺损的修复.     

可注射型骺板软骨水凝胶的制作及特性研究

目的 构建具有良好可塑性和生物特性的组织工程化骺软骨。 方法 制备胎牛骺软骨细胞外基质（cattlearticular cartilage extracellular matrix,CACECM）,复合藻酸钙（ 加10% 葡萄糖酸钙） 制备成可注射性水凝胶材料,行DNA 及糖胺聚糖（glycosaminoglycan,GAG） 定量检测。再与体外扩增的2 周龄新西兰白兔第二代骺软骨细胞复合培养,并植于实验兔背部脊柱两旁皮下,8 周后取材进行形态学观察及组织学检测。 结果 制备的可注射型水凝胶材料有较好的生物性能,培养出的组织工程化骺软骨组织细胞生长良好,具有分泌软骨基质功能。 结论 将异体脱细胞骺软骨细胞外基质与藻酸钙及葡萄糖酸钙结合,可以作为良好的可注射型水凝胶材料应用于组织工程化骺软骨的构建。     

脂肪干细胞构建组织工程化角膜基质组织

 目的 探讨以可降解高分子材料聚羟基乙醇（polylactic-co-glycolic acid,PLGA）为支架,复合自体脂肪干细胞构建组织工程角膜基质修复角膜基质层缺损的可行性。方法 兔脂肪干细胞（rabbit adipose derived stem cells,rASCs）培养至第4代接种在PLGA载体支架上,扫描电镜观察细胞在支架上生长黏附情况。体外培养7天后将rASCs-PLGA复合物回植到角膜基质缺损模型的兔角膜基质层间,术后第12周和24周取材行组织学和透射电镜超微结构观察。未接种细胞的PLGA材料移植基质层间作为对照组。结果 细胞在PLGA支架上生长增殖良好,实验组移植术后12周材料降解,角膜基本恢复透明。组织学检查显示移植后24周新生角膜基质样组织与正常角膜基质组织相似,电镜下胶原纤维直径与正常角膜基质组织比较,差异无统计学意义（P>0.05）。结论 脂肪干细胞可作为种子细胞来源用于构建组织工程角膜基质。     

以胶原凝胶为支架构建可植入工程化肝组织的实验研究

目的探讨肝细胞与液态Ⅰ型胶原复合构建可植入的工程化肝组织的可行性。方法SD大鼠肝细胞与液态Ⅰ型胶原及DMEM复合,形成肝细胞／胶原凝胶复合物。该复合物被接种在培养板中培养,采用相差显微镜和HE染色方法对培养肝细胞形态特征进行观察,并采用MTT法和免疫组化染色方法分别对肝细胞的活性和功能进行检测。肝细胞／胶原复合物同时被植入皮下腔中观察肝细胞的分化及工程化肝组织的形成情况,采用HE染色和免疫组织化学染色方法对植入的工程化肝组织进行评价。结果肝细胞与液态Ⅰ型胶原复合后形成凝胶状复合物,可见肝细胞均匀分布在整个复合物中,呈三维立体生长。在整个体外培养过程中,肝细胞始终保持圆形的形态;肝细胞在培养初期活性稍有下降,直至第7天时仍然保持活性的87％,之后随培养时间延长而活性逐渐降低。经过2周培养,肝细胞仍具有白蛋白的合成功能。皮下植入后1周,肝细胞／胶原复合物形成工程化灶性肝组织,免疫组化染色证实这种工程化的肝组织具有白蛋白的合成功能。结论采用胶原凝胶作为肝细胞生长和分化的支架可在体内构建类肝样的工程化肝组织。这种可植入的工程化肝组织提供了一种基于肝细胞治疗的新途径,并有望用于损伤肝组织修复和重建。     

组织工程软骨修复软骨缺损的研究进展

各种原因引起的关节软骨损伤在临床工作中非常常见,由于软骨组织的修复再生能力有限,传统的治疗方法难以获得满意的疗效,因此组织工程软骨的构建对修复软骨缺损有重大意义。现对近年组织工程软骨修复软骨缺损的研究成果,对种子细胞的获得,细胞体外培养条件的研究,生物支架材料的研究,组织工程软骨的临床初步应用简要综述。     

生物珊瑚人工骨支架材料生物相容性检测

目的评价生物珊瑚人工骨(BCAB)材料作为骨组织工程支架材料与小鼠胚胎干细胞(MESCs)构建组织工程骨的有效性及材料生物相容性。方法设MESCs与BCAB支架材料混合黏附培养为实验组,单纯MESCs培养为对照组,分别于第2、4、6、8天进行MTT法检测细胞增殖活性,特异性胚胎抗原-1检测细胞对材料的黏附性。于第8日对接种细胞材料片行成骨诱导,诱导培养10 d后行茜素红染色及电镜扫描检测成骨诱导及体外组织工程骨构建情况。取12只大鼠,脊柱左侧皮下植入空白BCAB支架片状材料,右侧植入黏附细胞BCAB片状材料,随机分4、8、12周3组行影像学检查,并取双侧标本行病理切片观察局部炎症反应,四环素标记下荧光显微镜观察成骨情况。第12周组取心、肝、肾病理切片及评估心、肝、肾毒性反应。结果 MTT法检测细胞增殖活性结果显示,在培养2 d和4 d时实验组与对照组间MTT值差异无统计学意义(P>0.05),在6 d及8 d时实验组MTT值明显高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。特异性胚胎抗原-1检测证实MESCs对BCAB支架材料具有良好的黏附性,在其三维微孔隙内能较快增殖。茜素红染色及电镜扫描检测证实黏附细胞材料成骨诱导有效,体外组织工程骨构建成功。材料植入局部组织炎症反应轻,空白支架材料于第8周开始降解,12周达初步降解,无异位成骨;黏附细胞支架材料则有明显异位成骨现象,且较对侧空白支架材料降解时效延长。第12周组实验动物心、肝、肾标本病理切片未见异常损害。结论 BCAB支架材料具有良好的生物相容性,其降解周期与新骨重建周期大致相当,是一种良好的骨组织工程支架材料。     

构建组织工程血管的支架材料和种子细胞研究进展

国内外学者已对用于构建组织工程血管的支架材料和种子细胞进行了较多的研究,以期研制出能代替自体血管用于临床的血管移植物,它应具备良好的生物相容性、适应性重塑和生长的潜能。虽然组织工程研究已开展30多年并取得一定成果,但是仍有许多问题亟待解决。如何研制出理想的支架材料和选择合适的种子细胞有待进一步研究。综述近年用于构建组织工程血管的支架材料和种子细胞的研究进展。     

利用成体干细胞体外小口径血管的构建

设计了一套血管生物反应器系统,采用有限元的方法对组织工程小血管托架材料进行了分析,从而开发完成了一套用于构建直径为2 mm的小血管托架;通过收集人的原代骨髓基质干细胞（hBMSCs）和脂肪基质干细胞（ADSCs）进行体外扩增和培养,并选用第3代细胞与聚羟基乙酸酯（PGA）复合后置于血管生物反应器中动态培养;在生物反应器中动态培养4周后,对材料复合物进行取材,分别进行大体观察、HE染色和扫描电镜等指标检测。结果表明：血管色泽明亮,有一定的弹性,细胞分泌的胶原基质排列较规则,免疫组化结果表明血管含有平滑肌弹性肌动蛋白的成分。说明改进的血管生物反应器能模拟血管的力学环境,并能利用人骨髓间充质干细胞和脂肪基质干细胞成功构建组织工程小血管组织。     

组织工程化尿路细胞-支架复合体的制备及其体外培养的初步研究

目的利用组织工程方法在体外构建尿路细胞一支架复合体。方法采用角朊细胞培养基用组织块法获得人尿路上皮细胞（UEC）和泌尿平滑肌细胞（USMC）,以免疫荧光鉴定。制备胶原材料支架,以扫描电镜评价。经过体外培养和扩增后,将P3代UEC和USMC接种在胶原支架上。结果胶原支架上的UEC和USMC经过体外培养1周后即可形成沿基膜排列的复层上皮结构。扫描电镜显示细胞-材料复合良好,免疫组化检测支架上的UEC和USMC的广谱角蛋白表达阳性。结论运用组织工程方法能够在体外快速进行尿路复合细胞支架的初步构建,为进一步临床修复尿道缺损奠定技术基础。     

可降解组织工程血管支架材料的细胞相容性

目的对可降解材料聚乳酸-羟基乙酸共聚物和聚氨酯体外评价,初步探讨其作为血管支架材料的可行性。方法通过血红蛋白的释放对溶血进行评价;采用细胞增殖度法(MTT法)、细胞形态学观察方法研究聚乳酸-羟基乙酸共聚物和聚氨酯材料的细胞毒性。结果 PLGA和PU组的溶血率均小于ISO规定的5%,可认为这两种材料无溶血作用。MTT比色法结果显示细胞毒性为0～1级;细胞形态学观察显示L929细胞在聚氨酯材料浸提液中呈梭形或三角形,贴壁良好。结论这两种材料溶血低,细胞相容性良好,符合组织工程血管支架材料的应用要求。     

肌腱修复的组织工程研究进展

对于肌腱缺损,传统的手术方法虽然可以减轻患者的痛苦,但是其功能重建并不乐观。随着肌腱组织工程的发展,用工程化肌腱来修复肌腱缺损正在成为一个新兴的治疗方法。目前,组织工程肌腱的研究涉及种子细胞、支架、生长因子和改进策略等各方面。组织工程化肌腱临床应用的关键是如何模拟体内环境,在体外成功构建肌腱组织。因此,在体外模拟体内环境进行组织工程的构建是未来的研究方向之一。     

小肠黏膜下层复合骨髓间充质干细胞体外构建心肌组织薄片的实验研究

目的 探讨利用小肠黏膜下层（SIS）复合骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外构建心肌组织薄片的可行性。方法 将自大鼠骨髓分离培养的BMSCs经5-氮胞苷（5-Aza）诱导培养3周后种植在经脱细胞处理的SIS浆膜面,在体外动态条件下共培养2周,构建组织工程心肌组织薄片,并进行病理组织学、超微结构和免疫组织化学染色观察。结果 与BMSCs体外共培养2周的SIS经苏木精-伊红（HE）染色显示,细胞在SIS上不只局限于材料表层,呈多层分布,部分细胞逐步向深层迁移和渗透。扫描电子显微镜观察发现,细胞较好地在SIS上黏附、生长和迁移,细胞分泌大量的细胞外基质。免疫组织化学染色结果显示,SIS上的细胞为表达α-actin、cTnⅠ和connexin-43的心肌样细胞。结论 在体外将SIS复合经5-Aza诱导的BMSCs,成功地初步构建出组织工程化心肌组织薄片。SIS是一种良好的心肌组织工程生物支架材料。