人肽抗生素hPAB-β分子的同源模建及其突变体设计

目的 :获得肽抗生素hPAB β的分子结构 ,设计其突变体。　 方法 :在序列比较的基础上 ,利用同源分子对hPAB β进行同源模建 ,并以此为基础设计其突变体 ,通过PCR引入突变法获得突变体基因序列 ,将其克隆到原核融合蛋白表达质粒 pQE CP4中 ,转化JM 10 9大肠杆菌进行表达。　 结果 :模建结果表明 ,hPAB β由一个α螺旋和3个 β片层构成 ,二级结构保守 ,具有两亲性结构 ;其α螺旋推测与活性寡聚体形成有关 ;Asp4带负电 ,可能通过削弱寡聚体中央微孔口处阳电荷富集区而降低目的分子的生物学活性。利用PCR成功克隆了所设计的突变体基因 ,通过构建融合蛋白表达质粒 ,实现了突变体融合蛋白在大肠杆菌中的表达。　结论 :基于分子同源模建的肽抗生素hPAB β突变体的设计、克隆和成功表达 ,为筛选肽链更短、抗菌活性保持不变或更强的新分子创造了前提     

改良人源LL-37杀菌肽的融合表达及其杀菌活性

目的:将改良LL-37多肽以融合肽形式表达、纯化,并初步研究其杀菌活性. 方法:将编码改良的LL-37多肽的DNA序列放入载体pET-30a( ),转入工程菌BL21 star(DE3)中,用IPTG诱导表达得到含6×His标记的改良融合蛋白LL-37. 再以TALON柱芯亲和层析、SDS-PAGE和Western blot鉴定后,用FXa裂解融合肽. 将裂解后多肽进一步用强阳离子交换柱Macro-Prep High S纯化、收集各洗脱峰, 脱盐、冻干. 采用抑菌圈法检测改良LL-37的抗菌活性. 结果:改良的LL-37多肽于载体pET-30a( )在杆菌BL21 star(DE3)中高效融合表达,用凝胶扫描显示融合蛋白的表达量约占全菌蛋白的35%. 融合蛋白经纯化后用SDS-PAGE鉴定在Mr 4000处见单一条带. 经抑菌圈法检测改良的LL-37多肽对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都具有很好的杀菌力. 结论:改良的人源性LL-37多肽以原核细胞进行融合表达是可行的,并具有较强的杀菌活性.     

人胰岛素突变体基因的融合表达

目的　以 pTXB1作为融合表达载体 ,构建人胰岛素突变体 (M insulin)的基因表达克隆 ,表达及纯化。 方法　基因合成胰岛素突变体的cDNA序列 ,酶切后装入融合表达质粒 pTXB1,基因测序正确后转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,诱导表达 ,初步纯化。结果　融合蛋白的分子量约为 330 0 0 ,表达量占菌体总蛋白的 5 0 %以上。融合蛋白主要以包涵体的形式存在 ,洗涤包涵体后融合蛋白的纯度达到 85 %以上。Western blot表明表达蛋白具有胰岛素抗原活性。活性测定显示 ,每升诱导培养后的菌液表达产物中 ,具有的放射免疫活性为 0 .5U。结论　成功地构建了人胰岛素突变体的融合表达体系 ,为进一步的研究奠定了基础。     

流动状态下ADAMTS13羧基端的功能研究

目的研究ADAMTS13及其突变体于体外流动状态下裂解血管性血友病因子(VWF),降低血小板粘附形成血栓能力的差异。方法将全长ADAMTS13(FL)及缺失TSP2-8CUB1+2(MDTCS)和缺失CUB1+2(delCUB)cDNA质粒瞬时转染COS7细胞,Western blot检测各瞬时表达细胞分泌的蛋白。利用流体力学装置平板流动小室(FlowChamber)培养人脐静脉内皮细胞,并通过蠕动泵加压流动培养液模拟人体血管内流动状态,荧光显微镜观测加入AD-AMTS13或其突变体蛋白后荧光标记的血小板聚集状态的差异。结果成功在真核表达细胞内瞬时表达ADAMTS13及其突变体蛋白,简单纯化并经Western blot检测各表达蛋白相对分子量与预期一致。Flow Chamber模拟人体血管内剪切力作用下,FL蛋白和MDTCS蛋白可以不同程度地抑制血小板凝集,delCUB蛋白抑制血小板凝集的能力显著下降。结论成功瞬时表达全长ADAMTS13及其突变体蛋白。初步证实流动状态下ADAMTS13羧基端是参与裂解VWF以抑制血小板凝集的主要区域。     

基于增殖诱导配体新型抗肿瘤分子的构建及初步筛选

目的构建针对APRIL的免疫抑制分子,并对其原核表达蛋白进行纯化及活性筛选.方法将可溶性增殖诱导配体(sAPRIL)cDNA进行突变并插入TEL Th表位序列,突变体用pQE-80L/DH5α原核表达系统进行表达,表达蛋白经SDS-PAGE鉴定、Ni-NTA亲和层析纯化及Western印迹分析,最后检测纯化蛋白对Raji细胞增殖的影响.结果成功构建并表达了4种sAPRIL突变体:C端引入HEL Th表位的sAPRIL突变体(Ⅰ)、N端引入HELTh表位的sAPRIL突变体(Ⅱ)、C端缺失45bp序列并引入HELTh表位的sAPRIL突变体(Ⅲ)、N端缺失45 bp序列并引入HELTh表位的sAPRIL突变体(Ⅳ).SDS-PAGE电泳、Western印迹分析均检测到相应的特异蛋白带.用Ni-NTA系统成功纯化表达的突变体蛋白.细胞试验表明,突变体Ⅰ、Ⅱ纯化蛋白具有明显的促细胞增殖活性,而突变体Ⅲ、Ⅳ纯化蛋白没有促细胞增殖活性.结论在4种sAPRIL突变体中初步筛选到不具有促细胞增殖活性的APRIL免疫抑制分子,为下一步确定该分子的免疫抑制功能奠定了物质基础.     

硒蛋白P同功型突变体短肽hSel P82m分析

目的: 切割硒蛋白P同功型突变体活性肽hSel P137m,以得到可能具备相同生物学活性而氨基酸数目更少的短肽.方法: 利用生物信息学技术分析hSel P280m,hSel P137m的活性功能域,用羟胺切割hSel P137 m,并用SDS-PAGE及蛋白质印迹加以分析验证.结果: 切割hSel P137m后得到了82(28aa-109 aa)个氨基酸的多肽,在特定的位置出现了预期的目的蛋白条带.利用生物信息学技术加以分析,认为hSel P82m基本具备hSel P137m的生物学活性.结论: 经切割硒蛋白P同功型突变体活性肽hSel P137m,成功得到82个氨基酸的短肽hSel P82m,并且认为其基本具备hSel P137m的生物学活性.     

结缔组织生长因子特异性结合肽的表达及分离纯化

目的:利用基因工程技术获得与结缔组织生长因子(CTGF)特异性结合的小肽。方法:设计并合成带有肠激酶切割位点的基因片段,插入pET-32(a) 质粒载体中硫氧化还原蛋白基因下游,构建重组质粒,转入E.coliBL21表达菌中,用终浓度1mmol.L-1的IPTG诱导表达融合蛋白;用热变性和硫酸铵分级沉淀对融合蛋白进行初步纯化,然后用亲和层析进一步纯化,经肠激酶切割,最后用凝胶过滤层析分离获得目的小肽;用反相色谱对所获小肽进行纯度鉴定。结果:所构建的重组质粒测序结果与预期一致;诱导表达后用SDS-PAGE鉴定,发现在相对分子质量20 000处有浓密的表达条带出现,与预期一致;融合蛋白用热变性和硫酸铵分级沉淀进行初步纯化,得率分别为78.6%和52.3%;用亲和层析纯化得率为50.5%;经肠激酶切割后用凝胶过滤层析分离获得目的小肽,用反相色谱鉴定其纯度大于95%;最终每升发酵液获得3.4 mg目的肽。结论:成功制备CT-GF特异性结合肽,为进一步研究该小肽的生物学活性打下基础。     

8R-MUC1核心肽融合蛋白的原核表达及纯化

目的：构建蛋白质转导结构域8个精氨酸聚合体（8R）与MUC1核心肽融合蛋白的原核表达载体,并表达、纯化出具有生物学活性的8R-MUC1核心肽融合蛋白。 方法：以PCR法从HSP65-MUC1-pET28a质粒中钓取MUC1核心肽2个重复序列片段,连入pMD18-T载体,然后用酶切、连接的方法从T载体上获得MUC1核心肽6重复序列片段(MUCPT),将其克隆入含8R的pET26b⁺原核表达载体中构建8R与MUCPT融合蛋白（8R-MUCPT）表达载体。用IPTG诱导转化8R-MUCPT表达载体的大肠杆菌BL21(DE3),并以镍螯合层析法纯化8R-MUCPT融合蛋白。 结果：构建了8R与MUC1核心肽6个重复序列片段的融合蛋白原核表达载体8R-MUCPT-pET26b⁺,并在BL21(DE3)中表达了8R-MUCPT融合蛋白,经镍螯合层析获得纯度为95.5%的8R-MUC1核心肽融合蛋白。 结论：构建了8R-MUC1核心肽融合蛋白原核表达载体并成功表达与纯化出具有生物学活性的融合蛋白。     

降糖抗栓肽的构建及其功能活性研究

目的 构建一种具有降糖和抗栓活性的双功能降糖抗栓肽（HAP），并研究其功能活性。方法 通过重组聚合酶链反应克隆5rolGLP-1-NK融合肽基因，构建其高表达工程菌株并制备HAP样品，采用链唑霉素诱导法构建的糖尿病小鼠模型和K型角叉菜胶腹腔注射法构建的小鼠尾部血栓模型，研究其降糖和抗栓活性。结果 成功构建了HAP融合肽基因及其高效表达大肠杆菌工程菌株，通过对小鼠尾部血栓模型灌服HAP多肽，实验证明HAP能显著延缓模型小鼠的血栓形成；用构建的糖尿病小鼠模型对HAP降血糖活性的实验表明，经15 d HAP灌胃治疗的小鼠空腹血糖几乎降低到接近正常水平。结论 HAP具有显著的降糖和抗栓双重功能，为研发降糖抗栓肽双功能药物奠定了基础。     

人血清白蛋白与PTH(1-34)融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达及鉴定

目的在毕赤酵母中高效分泌表达人血清白蛋白与PTH(1-34)融合蛋白.方法利用PCR技术获得HSA和PTH(1-34)基因,以柔性连接肽相连插入到表达载体pPIC9,重组质粒线性化后,用化学法转化毕赤酵母GS115,经组氨酸缺陷型培养板和PCR鉴定筛选得到转化子.在启动子AOX1和α交配因子信号肽的作用下,分泌表达融合蛋白HSA-PTH(1-34).PCR法和电泳鉴定表达验证阳性转化子,并观测不同时间点的表达量.Western blot验证其免疫活性,在兔肾皮质细胞膜中测定腺苷酸环化酶的激活产生cAMP的量来检测融合蛋白的生物学活性.结果PCR鉴定重组转化子验证了融合基因的成功整合,用甲醇诱导表达,蛋白电泳分析表明融合基因得到高效表达,HSA-PTH(1-34)同时具有HSA和PTH(1-34)的抗原性,且能激活兔肾皮质细胞中的腺苷酸环化酶产生cAMP,但活性低于PTH(1-34).结论在毕赤酵母中成功表达了具有生物学活性的人血清白蛋白与PTH(1-34)融合蛋白.     

承载分子PaP3.30在小分子活性肽融合表达中的应用

目的：筛选并克隆—个承载分子，研究其在肽抗生素及其他小分子活性肽融合表达中的应用。方法：根据肽抗生素为小分子活性肽，通常带正电荷的特性，从绿脓杆菌噬菌体(PaP3)基因组中筛选一承载分子，构建其与肽抗生素hPAB-β的融合蛋白表达载体，确认该承载分子能在大肠杆菌中融合表达肽抗生素后，再选择一组不同来源、不同大小、不同等电点的小肽分子作为研究对象，分别构建它们与承载分子的融合蛋白表达载体，转化大肠杆菌进行表达。根据表达情况，分析所选择的承载分子融合表达生物活性小肽的能力。结果：从PaP3基因组中成功地筛选到ORF-30编码的162个氨基酸组成的蛋白作为承载分子(PaP3．30)；构建该承载分子与肽抗生素hPAW-β的融合蛋白表达质粒pQE-PaP30-hPAB-β，在大肠杆菌中表达的融合蛋白占细菌总蛋白的30％以上；对所选择的不同来源(人、蜜蜂、爪蟾、大肠杆菌)、不同大小(相对分子质量为700—5300)、不同等电点(pⅠ2．9—12)的六种小肽分子PaP3．30，均能实现其在大肠杆菌中高效融合表达，表达量为细菌总蛋白的35％-44％。结论：所筛选的承载分子PaP3．30具有很强的融合表达小分子活性肽的能力，为建立高效表达和制备活性小肽的技术平台创造了条件。     

PRAK不同突变体的构建、表达及细胞内定位的研究

目的:构建p38调节/激活蛋白激酶(PRAK)不同突变体的绿色荧光蛋白融合表达载体,并在真核细胞中表达后,观察这些突变体在细胞内的定位情况.方法:将克隆在绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2上的野生型PRAK通过定点突变技术构建其无活性突变体PRAK(T182A)、活性突变体PRAK(T182D)、无激酶活性突变体PRAK(KM)、核定位信号缺失突变体PRAK(NLSm)及核输出信号缺失突变体PRAK(NESm),随后转染NIH3T3细胞,并在荧光显微镜下观察其表达和细胞内定位情况.结果:经测序鉴定各种PRAK不同突变体正确无误后,在NIH3T3细胞中得到高量表达;融合蛋白发出的绿色荧光表明,在静息状态下,野生型PRAK(WT)、PRAK(182A)、PRAK(182D)、PRAK(KM)和PRAK(NESm)主要分布于细胞核内,而PRAK(NLSm)在细胞中均匀分布;在受到NaAsO2刺激后,PRAK(WT)和PRAK(KM)移位出核,而PRAK(182A)、PRAK(182D)和PRAK(NESm)失去了移位出核的能力,PRAK(NLSm)则与刺激前无明显差异.结论:成功构建了PRAK不同突变体的绿色荧光蛋白融合表达载体并在真核细胞中进行了表达,且不同的突变体能够影响PRAK的细胞内定位.     

Max作用蛋白1-0缺失突变体的构建、表达及细胞内定位的研究

目的:构建Max作用蛋白1-0(Max interacting protein1-0,Mxi1-0)缺失突变体的真核表达载体并观察这些突变体在细胞内的定位情况,为研究Mxi1-0细胞内定位与其功能的关系奠定基础。方法:以野生型Mxi1-0真核表达质粒为模板,聚合酶链式反应扩增出5种类型Mxi1-0缺失突变体的基因片段,克隆至增强绿色荧光蛋白真核表达载体,经酶切和测序鉴定后,利用脂质体将重组质粒转染小鼠胚胎成纤维细胞株(NIH3T3)。Western blot检测融合蛋白的表达,荧光显微镜下观察融合蛋白细胞内定位情况。结果:各种Mxi1-0缺失突变体经测序鉴定正确后,在NIH3T3中得到表达。免疫荧光结果表明,脯氨酸富集结构域(PRD)突变体在细胞质和细胞核中均有分布,与Sin3结合域高度同源结构域(tSID)突变体主要分布于细胞质,在细胞核中有少量分布;PRD-tSID突变体及△PRD突变体分布于细胞质,而△PRD-tSID突变体主要分布于细胞核。结论:成功构建了5种人Mxi1-0缺失突变体的真核表达载体,并初步观察这些突变体在细胞内的定位情况,为探寻Mxi1-0在细胞内定位机制及功能奠定了基础。     

大鼠Myostatin蛋白成熟肽的原核表达及纯化

目的:利用谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白表达系统在大肠杆菌中表达纯化Myostatin成熟肽。方法:应用RT-PCR从大鼠的腓肠肌mRNA中逆转录扩增Myostatin成熟肽编码序列,克隆入原核表达载体pGEX-4T1中,IPTG诱导其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,采用Western-blot用抗-GST抗体验证融合蛋白表达。融合蛋白经Glutathione-agarose色谱纯化。结果:PCR扩增的Myostatin基因序列与GenBank数据库中的序列一致;30°C,0.1mmol/LIPTG诱导16小时,GST-Myostatin融合蛋白获得优化表达,表达效率为25%;Western-blot证实融合蛋白的特异性表达。结论:成功构建融合蛋白GST-Myostatin重组基因,并在大肠杆菌中获得有效表达,为Myostatin抗体的制备及进一步研究该蛋白的功能奠定基础。     

血小板生成素突变体融合蛋白表达及纯化研究

目的：用大肠杆菌融合蛋白表达载体pMAL—c2构建人血小板生成素突变体融合蛋白表达质粒pMAL-TPOM。方法：采用基因重组和表达、SD-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白纯化技术。结果：SDS-PAGE分析表明，IPTG诱导5h后大肠杆菌JM109表达到最高水平，约占大肠杆菌菌体总体蛋白的36．6％。除了大肠杆菌RR1不表达以外，大肠杆菌DH5a、H101均有较高水平的表达，表达产物血小板生成素突变体融合蛋白经SephacyIS-200和DEAE-SepharoseFF层析纯化后，蛋白纯度约为87．6％。结论：人血小板生成素突变体融合蛋白在大肠杆菌JM109、DH5a和H101中均获得高效表达。     

PTD-eGFP-△ E250 mFoxp3融合蛋白的表达与穿膜能力鉴定

目的:构建、表达并纯化含有蛋白转导结构域(protein transduction domain,PTD)、eGFP的小鼠Foxp3突变体(PTD-eGFP-△E250 mFoxp3)融合蛋白,为研究小鼠Foxp3的功能奠定基础.方法:利用重叠延伸PCR方法构建pET28a-PTD-eGFP-△E250 mFoxp3原核表达载体,并在大肠埃希菌Rosetta(DE3)中表达此融合蛋白,经Ni2柱纯化,通过流式细胞仪和激光共聚焦显微镜观察其穿膜效率.结果:成功构建了pET28a-PTD-eGFP-△E250 mFoxp3原核表达载体,并表达和纯化了PTD-eGFP-△E250 mFoxp3融合蛋白,流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测结果显示融合蛋白能很好地穿过细胞膜进入细胞内,并定位于细胞质和细胞核.结论:成功制备了具有穿膜活性的PTD-eGFP-△E250 mFoxp3融合蛋白,为更好地研究小鼠Foxp3的功能与特性奠定了实验基础.     

重组日本七鳃鳗毒素蛋白rLj-RGD3及其4种突变体抗血小板聚集活性的比较

目的：初步探讨rLj-RGD3分子中3个RGD模体对野生型rLj-RGD3抗血小板聚集活性的作用。方法全序列人工合成并重组表达、纯化4种rLj-RGD3缺失突变体蛋白。制备富血小板血浆( PRP),与不同浓度各重组突变体蛋白共温浴,采用Born氏比浊法测定ADP诱导的血小板聚集率,并计算血小板聚集抑制百分率,以评价野生型rLj-RGD3及其4种突变体蛋白的抗血小板聚集活性。结果成功重组表达纯化4种可溶性rLj-RGD3缺失突变体蛋白, rLj-RGD3抗血小板聚集活性最高, rLj-RGD3-0不具有抗血小板聚集功能, rLj-RGD3-1、rLj-RGD3-2及rLj-RGD3-3活性相当。结论3个RGD模体在rLj-RGD3抗血小板聚集功能中均十分重要,并不分伯仲,而rLj-RGD3因分子中含有3个RGD模体而活性最强。     

人胰高血糖素样肽-1突变体基因原核表达质粒的构建

目的:对人胰高血糖素样肽-1(hGLP-1)进行基因突变,构建GST融合蛋白原核表达质粒pGEX-4T/(Val8)hGLP-1,并在大肠杆菌中诱导表达。方法:选择大肠杆菌偏爱密码子,将hGLP-1(7～37)第2位的丙氨酸(Ala8)定点突变为缬氨酸(Val8),直接生物合成4个寡聚核苷酸片段并进行基因拼接,形成完整的hGLP-1突变体基因(Val8)hGLP-1,并连接到载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL21,BamH I与Xho I双酶切电泳鉴定与序列测定,然后诱导表达其融合蛋白。结果:经酶切电泳鉴定与测序分析,证实所合成的突变体基因(Val8)hGLP-1已克隆到pGEX-4T-1中,经SDS-PAGE分析可以诱导表达出融合蛋白。结论:成功地构建了GST融合蛋白原核表达质粒pGEX-4T/(Val8)hGLP-1,为进一步获得重组hGLP-1蛋白奠定基础,为产业化规模制备hGLP-1突变体提供实验依据。     

新型重组纤维蛋白原受体拮抗剂的表达、纯化及活性研究

目的:构建两个预期能够成为纤维蛋白原受体拮抗剂的重组融合蛋白.方法:人工合成北美水蛭素Decorsin的基因序列,利用基因工程的方法构建两个重组蛋白,分别是AnnV-D39:Annexin V加上Decorsin全序列和AnnV-D27:Annexin V加上Decorsin的羧基端27个氨基酸序列.在AnnV-D39的Annexin V和Decorsin序列之间加入了由10个氨基酸组成的连接肽GGGGSGGGGS.利用质粒pET-28(a )作为载体,将上述融合蛋白在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中以包涵体的形式进行高效表达,纯化后,进行抗血小板聚集活性测试.结果:基因表达的产物在变性条件下用DEAE-Cellulose52和SepharoseCL-4B层析纯化.随后进行的血小板聚集分析表明,AnnV-D39具有良好的抗血小板凝集活性,而AnnV-D27没有显示相似活性.结论:AnnV-D39作为一种新的纤维蛋白原受体抑制剂显示了良好的活性,而Annv-D27需要进行进一步的修饰.     

乳铁蛋白抗菌-免疫调节融合肽的载体构建及在大肠杆菌中的表达和纯化

目的构建乳铁蛋白抗菌-免疫调节融合肽(LIFP)表达载体,在E.coli BL21中诱导高表达并进行纯化。方法以乳铁蛋白抗菌肽(LfcinB)与乳源免疫调节肽(PGPIPN)的序列为参照,以连接臂(GGGGS)连接两种肽,设计LIFP基因,并在其5’端设计凝血酶FXa识别的酶切位点。将融合肽基因构建到表达载体pGEX-KG中,转化到E.coli BL21中,用IPTG低温诱导表达,通过AKTA层析系统纯化融合蛋白,Western blot进行鉴定。结果成功构建pGEX-KG-LIFP原核表达载体,并诱导其高表达。通过AKTA蛋白纯化系统,用亲和层析方法纯化,得到高纯度的融合蛋白。结论成功构建了LIFP表达载体,制备并纯化了LIFP,为进一步研究该肽功能和药物开发奠定基础。