重组人肝细胞生长因子α的纯化与活性测定

目的纯化重组人肝细胞生长因子α(rhHGFα)包涵体,复性并测定其活性。方法大肠杆菌中表达的rhHGF琢以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的25%。离心分离包涵体,用8mol/L尿素溶解,梯度稀释复性。经SephadexG75凝胶过滤和POROSHQ阴离子交换纯化,噻唑蓝法(MTT)测定活性。结果rhHGF琢纯度达到90%以上,其刺激肝细胞生长的活性达到rhHGF标准品的80%。结论建立了纯化rhHGF琢的技术路线,rhHGF琢具有刺激原代培养大鼠肝细胞生长的作用。     

龙眼参多糖对四氯化碳诱导大鼠原代肝细胞损伤的保护作用

目的:研究龙眼参多糖(LYS)对大鼠原代肝细胞损伤的保护作用及其机制。方法:用四氯化碳(CCl4)体外诱导大鼠原代肝细胞损伤,检测培养上清液中天门冬氨酸转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平,测定肝细胞中丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)含量,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞活性。结果:与模型组比较,LYS组AST和ALT水平及肝细胞MDA含量明显降低,肝细胞存活率和GSH含量升高。结论:LYS对大鼠原代培养肝细胞损伤有直接保护作用,机制可能与其抗氧化作用有关。     

玉郎伞多糖对四氯化碳诱导大鼠原代肝细胞损伤的保护作用

目的:研究玉郎伞多糖(YLS)对大鼠原代肝细胞损伤的保护作用及其机制。方法:采用IV型胶原酶灌流法分离大鼠肝细胞进行原代培养,用四氯化碳(CCl4)体外诱导肝细胞损伤,检测培养上清液中天门冬氨酸转换酶(AST)和丙氨酸氨基转换酶(ALT)水平,测定肝细胞中丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)含量,MTT法检测细胞存活和增殖活性。结果:YLS(0.125~1.000g.L-1)可明显降低由CCl4升高的肝细胞培养上清液中AST和ALT水平及肝细胞MDA含量,还可提高CCl4降低的肝细胞存活率和GSH含量。结论:提示YLS对大鼠原代培养肝细胞损伤有直接保护作用,该作用可能与其抗氧化作用有关。     

牛磺酸对原代培养大鼠肝细胞的促凋亡作用研究

目的探索分离培养原代正常大鼠肝细胞的条件和方法,研究牛磺酸对原代培养的正常大鼠肝细胞的促凋亡作用。方法使用经典的两步灌注法分离原代肝实质细胞后贴壁培养,记录细胞生长状况,台盼蓝拒染法测定细胞活率、绘制生长曲线。经用不同浓度的牛磺酸培养24 h后,用TUNEL法测定牛磺酸对原代培养大鼠肝细胞致凋亡作用,测定细胞凋亡率(AI)。结果两步灌注分离取得的肝细胞活率>70%,贴壁生长良好,从生长曲线可看出培养第3天进入对数生长期;TUNEL实验3个给药组AI分别为:3.71%,29.72%,42.56%。结论两步灌注法是一种细胞产量高,损伤小,纯度高的分离原代正常大鼠肝细胞的方法;高浓度的牛磺酸对体外培养肝细胞有一定致凋亡作用。     

牛磺酸对原代培养大鼠肝细胞的促凋亡作用研究

目的探索分离培养原代正常大鼠肝细胞的条件和方法,研究牛磺酸对原代培养的正常大鼠肝细胞的促凋亡作用。方法使用经典的两步灌注法分离原代肝实质细胞后贴壁培养,记录细胞生长状况,台盼蓝拒染法测定细胞活率、绘制生长曲线。经用不同浓度的牛磺酸培养24 h后,用TUNEL法测定牛磺酸对原代培养大鼠肝细胞致凋亡作用,测定细胞凋亡率(AI)。结果两步灌注分离取得的肝细胞活率>70%,贴壁生长良好,从生长曲线可看出培养第3天进入对数生长期;TUNEL实验3个给药组AI分别为:3.71%,29.72%,42.56%。结论两步灌注法是一种细胞产量高,损伤小,纯度高的分离原代正常大鼠肝细胞的方法;高浓度的牛磺酸对体外培养肝细胞有一定致凋亡作用。     

3-甲基胆蒽对大鼠肝细胞细胞色素P450 1A的诱导作用

目的　研究 3 甲基胆蒽 (3 methylcholanthrene,3 MC)对原代培养大鼠肝细胞细胞色素P450 1A(CYP 1A)酶活力的诱导作用 ,并探讨其时间 效应和剂量 效应关系。方法　原位 2步胶原酶灌流法分离大鼠肝细胞 ,无血清条件下培养细胞 ,并用不同剂量的 3 MC诱导肝细胞 2 4h或 48h。乙氧基试卤灵 (ethoxyresorufin,EOR)为CYP 1A酶活力探针药 ,高效液相色谱法 (HPLC)测定试卤灵 (resorufin,RSF)浓度。结果　实验条件下对照组和 3 MC诱导组的RSF均可被检测 ,与对照细胞相比 ,除 0 0 0 5μmol L的 3 MC对原代培养大鼠肝细胞EROD无显著诱导作用外 ,其余剂量 (0 0 5 ,0 5 ,5μmol L)的 3 MC均明显诱导酶活力 ,酶活力分别被上调至对照组的 5 0 8,2 3 3 ,33 6倍 (P <0 0 1 ) ,3 MC的诱导作用在 2 4h达最强 ,而其在 48h的诱导作用与 2 4h相似。3 MC对原代培养大鼠肝细胞CYP 1A酶活力的诱导作用呈明显的剂量依赖性。结论　 3 MC对大鼠原代培养肝细胞CYP 1A酶活力有明显的诱导作用     

3—甲基胆蒽对原代培养大鼠肝细胞细胞色素P4501A1／2的诱导作用

目的：研究3—甲基胆蒽(3—methylcholanthrene，3—MC)对原代培养大鼠肝细胞细胞色素P4501A1／2的诱导作用，并探讨其时间—效应和剂量—效应关系。方法：原位两步胶原酶灌流法分离大鼠肝细胞，无血清条件下培养细胞，并用不同剂量的3—MC诱导肝细胞24h或48h。乙氧基试卤灵(ethoxyresomn，EOR)为CYP1A酶活性探针药，高效液相色谱法(HPLC)测定试卤灵(resomfin，RSF)浓度。Taqman RT—PCR法测定CYP1A1基因表达，Westem bolt法分析CYP1A酶蛋白表达。结果：实验条件下对照组和3—MC诱导组的CYP1A1基因和酶蛋白，CYP1A1／2酶活性均可被检测。3—MC对原代培养大鼠肝细胞CYP1A1／2基因及蛋白表达、酶活性的诱导作用呈明显的剂量依赖性。结论：3—MC对大鼠原代培养肝细胞的CYP1A1／2有明显的诱导作用。     

硝普钠抑制脂多糖诱导的大鼠原代培养肝细胞表面细胞间粘附分子-1的表达

目的　评价模拟肝脏急性炎症期一氧化氮与细胞间粘附分子 1(ICAM 1)表达的关系。方法　用免疫细胞化学技术检测加入不同浓度NO供体硝普钠 (SNP)和 (或 )细菌内毒素 (LPS)后 ,原代培养大鼠肝细胞ICAM 1的表达情况。结果　当培养时间达4h ,各组肝细胞均未见ICAM 1显著表达 ;但当培养至 8,2 4h ,LPS组的肝细胞ICAM 1表达强度明显升高 (P <0 .0 5 ) ,SNP则可呈浓度依赖性地抑制LPS诱导的大鼠肝细胞ICAM 1的表达。结论　SNP可显著抑制LPS诱导的原代培养大鼠肝细胞ICAM 1表达。     

南沙参多糖对四氯化碳损伤原代培养大鼠肝细胞保护作用的研究

目的:探讨南沙参多糖(RAPS)对四氯化碳(CCl4)损伤原代培养大鼠肝细胞的保护作用及其机制。方法:通过原位灌流法分离大鼠肝细胞,培养36h后加入RAPS,同时造成CCl4损伤,分别于损伤24h和48h时检测培养液中丙二醛(MDA)的含量、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的活性,48h后用MTT法测定肝细胞存活率。结果:RAPS对CCl4引起的ALT、AST活力的升高有抑制作用,同时抑制MDA的产生及肝细胞损伤造成的SOD活性及GSH-PX活性的降低。而且能明显改善肝细胞存活率。结论:RAPS能有效抑制CCl4造成的原代培养大鼠肝细胞损伤,机制可能与其抗氧化作用有关。     

类叶升麻苷对大鼠原代肝细胞免疫性肝损伤的保护作用

目的观察类叶升麻苷对大鼠原代肝细胞免疫性肝损伤的保护作用。方法采用卡介苗(BCG)联合脂多糖(LPS)建立大鼠原代肝细胞免疫性损伤模型,测定并比较各组肝细胞培养上清液中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的活性和一氧化氮(NO)在不同培养时间点(3,6,12和24h)的含量。结果与模型组相比较,类叶升麻苷在不同时间点均能明显降低ALT、AST和NO水平(P<0.01),且呈剂量依赖关系。结论类叶升麻苷对卡介苗联合脂多糖诱导的大鼠原代肝细胞免疫性肝损伤具有保护作用。     

肝细胞生长因子对结缔组织生长因子刺激下肾小管上皮间质纤维化的影响

目的 探讨重组人肝细胞生长因子(rhHGF)对结缔组织生长因子(CTGF)刺激下肾小管上皮间质纤维化的影响.方法 体外培养人肾小管上皮细胞(HKC),在CTGF培养的HKC中加入不同浓度rhHGF分别刺激96 h,提取细胞总RNA,运用RT-PCR技术检测纤维化指标IV型胶原(COL4A1)、纤连蛋白(FN)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)等的基因表达;并以Western印迹法检测α-SMA的蛋白表达改变.结果 rhCTGF加rhHGF组纤维化指标FN和α-SMA表达均较rhCTGF组明显下降(P< 0.01).结论 HGF可抑制CTGF所致HKC间质纤维化.     

大鼠原代肝细胞药物相互作用模型的建立

目的 建立并考察适用于药物相互作用研究的体外大鼠原代肝细胞模型。方法 用改良Seglen两步灌流法分离肝细胞,以高糖DMEM为基础培养基培养细胞。通过检测细胞上清液中白蛋白(ALB)和尿素氮(BUN)水平、用底物探针法检测大鼠原代肝细胞中5种细胞色素P450(rCYP450)和葡萄糖醛酸转移酶(rUGT)代谢活性,考察培养时长对肝细胞功能和代谢酶活性水平的影响。原代肝细胞与利福平(RIF)、奥美拉唑(OMP)、β-萘黄酮(BNF)、苯巴比妥钠(PB)和地塞米松(DMS)共培养60 h,通过底物探针法检测代谢物的变化,用实时荧光聚合酶链反应法检测各组细胞代谢酶mRNA的表达水平,筛选多种代谢酶的阳性诱导剂。结果 改良后的分离方法可得到活率大于90%,能正常分泌ALB和BUN的原代肝细胞,培养至第9天仍可维持基本功能和正常形态。rCYP1A2、rCYP2B1和rCYP3A1随培养时长活性下降迅速,48和72 h下降至20.54%～23.15%和0～7.80%。rCYP2D2和rUGT酶活性下降较缓,48和72 h可维持在57.41%～76.77%和25.25%～35.24%。诱导剂筛选结果...     

大鼠肝实质细胞原代培养模型的研究及其功能鉴定

目的:为肝细胞功能及相关的研究提供一种客观的、简便的大鼠肝细胞原代培养模型,并鉴定肝细胞的功能。方法:在传统的两步灌流法的基础上进行改良分离培养肝实质细胞;流式细胞术测定原代肝细胞的细胞周期和细胞凋亡情况;SRB法测定不同培养基对原代肝细胞的生长和功能的影响。结果:分离得到的肝细胞成活率可达90%以上,纯度可达95%以上;流式细胞术结果表明原代肝细胞大多处于G0/G1期,且基本无凋亡;SRB法和白蛋白分泌量检测结果显示,低糖DMEM组原代肝细胞生长和白蛋白分泌功能在短期内(1~5 d)与高糖DMEM组没有明显差异;RPMI1640组肝细胞的生长和功能则明显低于前两组(P<0.05)。结论:体外培养的肝细胞活力和纯度均较高,体外培养后细胞功能正常,是一种实用的体外研究肝细胞良好的细胞学模型。     

胰岛素对大鼠肝细胞损伤的保护作用

目的:探讨胰岛素对大鼠肝细胞损伤是否具有保护作用。方法:胶原酶原位灌流分离大鼠肝细胞并原代培养,分别用脂多糖(LPS)及胰岛素处理肝细胞,12 h后检测肝细胞损伤及存活率。结果:LPS可引起肝细胞损伤,使丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)增高;胰岛素可减轻上述肝细胞损伤(ALT活性降低55.5%、AST活性降低24.4%,P<0.01),提高肝细胞存活率(P<0.01)。结论:胰岛素可减少ALT和AST释放,促进肝细胞存活,减轻LPS直接诱导的肝细胞损伤,保护受损的肝细胞。     

氟他胺和2—羟基氟他胺对大鼠原代培养肝细胞毒性及CYP1A2mRNA的影响

目的:比较氟他胺及其活性代谢产物2-羟基氟他胺对原代培养大鼠肝细胞毒性及对CYP1A2 mRNA的影响.方法:分离大鼠肝细胞,原代培养4h,台酚蓝拒染法检测肝细胞活力.氟他胺和2-羟基氟他胺在培养液中浓度分别为10、20和50mg/L.肝细胞毒性检测包括台酚蓝拒染法,乳酸脱氢酶(LDH)释放量,谷丙转氨酶(AST)和谷草转氨酶(ALT)释放百分比,谷胱甘肽(GSH)含量.同时采用Northern blot方法进一步研究两药对CYP1A2 mRNA的影响.结果:药物作用8h后,氟他胺三个剂量组和2-羟基氟他胺50mg/L组出现肝细胞损伤,表现为ALT和AST释放百分比增加,GSH含量下降.氟他胺三个剂量组使CYP1A2 mRNA水平分别升高2,5和7.5倍,而2-羟基氟他胺仅在50mg/L时使CYP1A2mRNA水平升高3.5倍.结论:氟他胺对原代培养大鼠肝细胞的毒性大于其活性代谢物2-羟基氟他胺,且明显增加CYP1A2 mRNA水平.     

TGF-β对原代培养肝细胞及肝癌细胞BEL7401生长作用的影响

目的 研究转化生长因子－β（ＴＧＦ－β）对正常大鼠肝细胞和肝肿瘤细胞的影响。方法 分离和培养原代大鼠肝细胞,培养ＢＥＬ４０１肝癌细胞,通过测定细胞ＤＮＡ合成、细胞活性（ＭＴＴ）及碱性磷酸酶活性,研究ＴＧＦ－β对正常大鼠肝细胞和肝肿瘤细胞的影响方式及可能的作用途径。结果 实验发现,ＴＧＦ－β可以刺激ＢＥＬ７４０１肝癌细胞的增生,促进其ＤＮＡ合成,并增强其活性ＳＴＧＦ－β对原代培养肝细胞ＤＮＡ合成无明显影响,对其活性有明显的抑制作用。实验还发现,ＴＧＦ－β明显刺激ＢＥＬ７４０１肝癌细胞中的碱性磷酸酶增高,同时抑制原代培养肝细胞的碱性磷酸酶活性。结论ＴＧＦ－β对正常细胞和肝癌细胞ＢＥＬ７４０１的生长有不同的影响作用,这种结果可能是通过不同的细胞信号传导途径实现的。     

高CYPs酶活性大鼠原代肝细胞模型的建立及其在药物肝毒性评价中的应用

目的 建立一种灵敏、快速的高细胞色素P450(CYPs)酶活性的大鼠原代肝细胞模型,用于评价经CYPs酶代谢后产生肝毒性的药物。方法 分别采用苯巴比妥和β-萘黄酮两种CYPs酶广谱诱导剂构建大鼠原代肝细胞模型;应用“cocktail”探针底物法考察两种诱导剂对CYPs酶的影响;以基于CYPs酶代谢导致肝毒性的药物他克林(TAC)、双氯芬酸钠(DIC)和对乙酰氨基酚(PAR)为模型药物,评价所构建的高CYPs酶活性大鼠原代肝细胞模型与普通大鼠原代肝细胞间灵敏性的差异;应用所构建的高CYPs酶活性大鼠原代肝细胞模型评价维拉帕米(VER)的肝毒性。结果 与普通大鼠原代肝细胞相比,3种模型药物在高CYPs酶活性大鼠原代肝细胞中,在较低剂量时可使细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)、细胞中活性氧(ROS)水平升高,线粒体膜电位(MMP)水平下降,或相同剂量下得到更严重的损伤结果,CYPs酶抑制剂1-aminobenzotriazole(ABT)和metyrapone(MET)能抑制这3种损伤的发生;100 μmol/L维拉帕米在普通大鼠原代肝细胞中并未引起LDH、ROS和MMP的改变,但在高CYPs活性大鼠原代肝细胞模型中,会引起细胞损伤,ABT和MET能抑制这种损伤。结论 经诱导建立的两种高CYPs酶活性大鼠原代肝细胞模型能更灵敏的评价基于CYPs酶代谢致毒药物的肝毒性;两种诱导剂诱导得到的高CYPs酶活性大鼠原代肝细胞模型对经不同CYPs酶亚型代谢的药物评价结果有各自优势。应用高CYPs酶活性大鼠原代肝细胞模型证实维拉帕米的致毒机制是经CYPs酶代谢产生肝毒性。     

曲格列酮对大鼠肝细胞氧化性损伤的研究

目的:研究曲格列酮的肝细胞毒性及其可能的机制.方法:在原代大鼠肝细胞模型和其他3种不同来源非肝细胞系,用WST-1法、乳酸脱氢酶释放法、荧光检测法、生物发光法等方法,观察曲格列酮对肝细胞的损伤作用.结果:不同剂量曲格列酮作用后,其在原代培养大鼠肝细胞的IC50值最低,即其对原代肝细胞毒性最大.曲格列酮诱导活性氧(ROS)生成,并引起还原型谷胱甘肽(GSH)和ATP水平比对照细胞显著降低.不同剂量的曲格列酮作用5h后诱发肝细胞凋亡、坏死.结论:曲格列酮对大鼠肝细胞的毒性作用强于对其他非肝细胞来源细胞的毒性作用.曲格列酮可以引起肝细胞氧化性损伤,肝细胞凋亡和坏死.     

肝细胞刺激因子对肝癌细胞和大鼠肝细胞增生作用的研究

目的探讨肝细胞刺激因子 (HSS)对正常大鼠肝细胞和人肝癌细胞的作用特点。方法应用自制的HSS分别与正常大鼠肝脏细胞和人传代肝癌细胞共同培养不同时间 ,以促进肝细胞增生的IL 6为对照组 ,采用3 H TdR掺入法 ,观察HSS对大鼠肝细胞和人肝癌细胞分裂增生和细胞形态变化的影响。结果在培养早期HSS对正常大鼠肝细胞和人肝癌细胞均具有刺激增生的作用 ,随后HSS对这些细胞的增生具有明显的抑制作用 ,并伴随着细胞的死亡形态改变。结论HSS对人肝癌细胞和正常大鼠肝细胞的增生不仅有促进作用 ,而且具有较强的抑制作用 ,此对进一步研究HSS的生物学活性和临床应用具有重要意义     

非诺贝特对凝胶包埋培养的原代大鼠肝细胞的毒性

目的研究非诺贝特对凝胶包埋培养的原代大鼠肝细胞内氧化压力和脂质含量的影响。方法将收获得到的新鲜原代大鼠肝细胞进行胶原凝胶包埋,构建肝细胞体外凝胶包埋培养模型,同时构建传统平板模型作为对照。在肝细胞培养过程中加入非诺贝特25和100μmol.L-1,分别于培养3和7 d后,检测细胞内活性氧类(ROS)、丙二醛(MDA)、甘油三酯(TG)含量,并用尼罗红和油红O对细胞内中性脂滴进行定量分析和染色观察。结果平板模型非诺贝特各组之间没有显著性差异,而凝胶包埋模型非诺贝特各组之间差异明显。对于凝胶包埋模型,非诺贝特25和100μmol.L-1均导致细胞内ROS增加,其中非诺贝特处理3 d组细胞内ROS分别为对照组的(131±19)%和(149±10)%,非诺贝特处理7 d组细胞内ROS分别为正常对照组的(121±8)%和(117±5)%(P<0.01);非诺贝特还导致了胞内MDA含量、TG和中性脂含量的显著增加(P<0.05)。结论凝胶包埋培养原代大鼠肝细胞作为体外培养模型相对于平板模型能更好地反映非诺贝特的肝毒性作用。