4株蚊媒病毒多重RT-PCR快速检测方法的建立

目的建立登革1、2型病毒、黄热病毒及流行性乙型脑炎病毒的多重RT-PCR快速检测方法。方法参照病毒核酸序列设计多重RT-PCR引物,并检索GenBank国际基因序列数据库初步验证其特异性,随后对Mg2＋、dNTP及引物浓度,RT-PCR反应条件进行优化,建立稳定、特异的多重RT-PCR快速检测4株病毒方法 ,并以同属于黄病毒科的登革3型病毒、登革4型病毒及甲病毒属基孔肯亚病毒、辛德毕斯病毒为对照,验证其特异性。结果应用多重RT-PCR反应体系,对引物的相关性实验结果表明引物之间不会因相互干扰而出现假阳性结果 ;采用多重RT-PCR引物对登革1、2型病毒、黄热病毒及流行性乙型脑炎病毒进行扩增,分别获得574、251、879、422 bp片段,与设计相符,而对照病毒组均无非特异性扩增条带。结论实验证明,所建立的多重RT-PCR方法能够快速地检测登革1、2型病毒、黄热病毒及流行性乙型脑炎病毒,为其检测提供了一种方便易行的方法 。     

黄病毒载体技术应用的研究进展

黄病毒,一般指黄病毒科（Flaviviridae）黄病毒属（Flavi virus）病毒.黄病毒属包括60多种病毒,按照血清学的特征,黄病毒可分为9组,包括登革病毒（Dengue Virus,DENV）、黄热病毒（Yellow fever virus,YFV）、乙脑病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）、昆津病毒（KUNjin virus,KUNV）、西尼罗病毒（West Nile virus,WNV）、蜱传脑炎病毒（Tick-borne encephalitis virus,TBEV）、和墨累河谷脑炎病毒（Murray Valley encephalitis virus,MVEV）等[1].半数以上的黄病毒能够感染人和动物,患病率高而治愈率低,易留下一些严重的后遗症,给人类健康带来很大威胁,且大多数黄病毒引发的病毒病尚无有效疫苗应用于预防,也没有特效的临床药物治疗.随着人们对黄病毒生活周期、分子生物学及其与疾病发生发展关系的深入认识,黄病毒载体技术逐渐成为黄病毒研究的焦点和热点.黄病毒载体作为一种基因导入系统,在载体疫苗研发和基因治疗等领域中发挥着极其重要的作用,本文拟对黄病毒载体技术应用的研究进展作一综述.     

流行性乙型脑炎血清和脑脊液特异性IgM,IgG的检测

对４１例小儿流行性乙型脑炎（乙脑）急性期血清和脑脊液抗乙脑病毒（ＪＥＶ）ＩｇＭ和ＩｇＧ的检测结果进行分析。抗ＪＥＶ－ＩｇＭ检出率，血清（７８．９５％）明显高于在脑脊液（６４．３８％），Ｘ２＝３．９０３２，ｐ＜０．０５，抗ＪＥＶ－ＩｇＭ最早检出时间为第３病日血清和第４病日脑脊液。在不同病日，不同年龄组和病情轻、中、重各组之间，抗ＪＥＶ－ＩｇＭ检出率无明显差异。获取患者双份血清（３５例）和双份脑脊液（３２例），抗ＪＥＶ－ＩｇＧ滴度分别有７７．１４％和４６．８８％明显增长。     

乙型脑炎病毒TaqMan PCR检测方法的建立及初步应用

目的 利用TaqMan PCR技术，建立乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）实时荧光PCR检测方法，初步应用于蚊虫媒介的JEV监测。方法根据GenBank发表的JEV全基因组序列资料分析结果，在其NS5基因区段设计JEV特异的引物与探针；优化Mg^2＋浓度和引物浓度比例，并利用11株JEV和7株相关病毒株考核检测体系的保守性、特异性、灵敏性和稳定性；利用体外转录的病毒RNA和定量的病毒样品，建立相应的定量分析模型；初步应用于蚊虫媒介的监测与检测分析。结果Mg^2＋优化浓度为5mmol／L，上下游引物浓度比例为4：1，引物探针具有良好的保守性和特异性，灵敏度为10PFU／ml，稳定性分析表明，同一样品Ct值的重复检测5次，变异系数均小于5％；绘制两种标准曲线，构建了JEV基因拷贝数、病毒滴度为分析指标的定量分析模型，检测蚊虫标本结果显示，TaqMan PCR方法较病毒分离法敏感、快捷、简便。结论本研究建立了一种灵敏、特异、简便易行的JEVTaqMan PCR检测方法，为蚊虫媒介检测奠定了基础，为乙型脑炎的预防控制和脑炎相关疾病的诊断与鉴别诊断提供了一种技术手段。     

日本脑炎病毒血清学和分子生物学快速诊断技术研究进展

日本脑炎病死率高,后遗症严重;对人类和多种动物的危害非常大,因此日本脑炎病毒的快速诊断尤为重要.本文就日本脑炎病毒的血清学和分子生物学等方面的快速诊断方法的研究进展作一综述.     

炭凝集试验快速检测病毒的研究

目的 探讨炭凝集试验（CAT）快速检测流行性出血热病毒（EHFV）和呼吸道合胞病毒（RSV）的可行性。方法 用单克隆抗体（mAb)制备炭抗体,进行相对应的病毒（标本）检测,同时以免疫荧光（IFA）或细胞培养法为对照。结果 用CAT与IFA对比检测40例EHF患者外周血单个核细胞（PBMC）中的抗原,阳性检出率分别为87．5％和82．5％,两者的符合率为95％。用CAT对已知病毒试验,结果所试18株RSV均产生凝集,其它8种病毒均不凝集。用CAT和细胞培养法,对83份临床标本中的RSV检测,CAT的阳性率为69．88％（58／83）,细胞培养法为39．75％（33／83）,表明CAT较细胞培养法敏感。结论 CAT法的敏感性高于IFA和细胞培养,可用于某些临床标本的检测。     

呼吸道腺病毒快速检测方法探讨

腺病毒(adenovirus，Adv)是引起婴幼儿下呼吸道感染的较为重要的病原之一，引起的肺炎病情危重，具有较强的传染性，故对其进行早期快速诊断，以便临床尽快地进行治疗和隔离显得尤为重要。     

一种快速检测乙型脑炎病毒滴度的荧光灶试验方法的建立、验证及应用

目的:建立快速荧光灶试验(fluorescence focus assay,FFA)滴定乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)的方法,验证该法替代病毒蚀斑法测定乙型脑炎减毒活疫苗(简称乙脑减毒活疫苗)滴度的可行性并将该法作初步应用。方法:利用原核表达方式构建JEV非结构蛋白1(...     

实时荧光PCR方法快速检测空肠弯曲菌方法的建立

目的建立实时荧光PCR快速检测空肠弯曲菌的方法。方法以空肠弯曲杆菌HipO基因的保守序列为模板设计特异性引物探针,建立一种能快速检测样本中空肠弯曲杆菌的实时荧光PCR方法;对方法的特异性和敏感性进行评价,并以正常人粪便为空白样本,添加一定量空肠弯曲菌标准株菌液进行检测,以对方法的检测效果进行初步评价。结果该实时荧光PCR方法只对空肠弯曲杆菌进行特异扩增,同种属的结肠弯曲菌及其他常见食源性病原菌均不能扩增;整个检测过程只需要80min,对空肠弯曲菌菌悬液可检测至5个细菌,对加标粪便样本可检测至10-100个细菌。结论本研究建立的实时荧光PCR检测空肠弯曲菌方法不仅能实现对空弯菌的快速检测,而且还为空弯菌的快速诊断及其引起的食源性疾病的监控溯源提供有意义的参考。     

EHFV微量细胞病变中和试验方法的建立及其在中和抗体检测中的应用

本文报道了一种新的流行性出血热病毒中和抗体检测方法即微量细胞病变中和试验。该法利用流行性出血热病毒在Vero细胞上繁殖时可引起细胞病变的特性，将32－100CCID50病毒液与等量待检出血清混合，37℃中和1．5小时后种入微量培养板孔中的细胞悬液中，培养6－8天后即可判定结果，用该法检测流行性出血热病人血清和灭活疫苗免疫机体后和中和抗体，获得了与空斑减少中和试验法基本一致或者更加敏感的结果。该法简单，特异、准确、敏感、快速、它的推广应用对加我国流行必出血热的血清分型和流行病学调查及疫苗制备毒株的筛选等基础研究工作均有较大的意义。     

人乳头瘤病毒反向点杂交检测方法的研究

目的　通过检测正常孕妇及胎儿HPV的感染情况 ,探索建立一种简便、有效的HPV检测方法。方法　在以GP5 / 6 为引物的人乳头瘤病毒检测方法的基础上 ,利用生物素标记引物 (bio -GPbt) ,进行GP -PCR ,并用此PCR产物与特异性内寡核苷酸探针 (SIOP)进行反向点杂交 (RDBH) ,从而达到检测HPV感染并对其分型的目的。结果　 1 .在对 1 1 9份样品的检测中 ,普通 2 %琼脂糖电泳的阳性率为 30 3 %(36/ 1 1 9) ,而反向点杂交的阳性率为 43 7%(52 / 1 1 9) ,两者之间差别有显著性 (χ2 =4 0 568,0 0 1

相似文献   

枝状DNA信号放大与纸层析杂交检测方法的建立

血清中病原体的核酸 (ＤＮＡ或ＲＮＡ)水平可确切地反映病原体的复制能力。现有诊断方法中多以各种模式的聚合酶链式反应 (ＰＣＲ)为主 ,该方法灵敏度较高 ,但需要依赖一些设备 ,且易出现假阳性。测定分子水平的技术多因要求高 ,一般临床较少开展。近年发展了极为敏感的枝状ＤＮＡ (ｂｒａｎｃｈｅｄＤＮＡ ,ｂＤＮＡ)分析技术 ,通过一系列的杂交反应后 ,由显示探针上的酶催化发光底物发光 ,由光电比色计可定量记录信号 ,从而达到对病原体核酸的定量分析目的。纸层析杂交试验利用了毛细作用力使ＤＮＡ分子在膜上移动 ,通过杂交作用被固定在…     

基于环介导等温扩增的志贺菌快速检测方法的建立

目的 建立基于环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术的志贺菌快速检测方法.方法 针对志贺菌特异保守ipaH基因设计引物,通过引物筛选和反应条件优化,建立检测志贺菌的实时荧光及肉眼目视观测结果的LAMP方法,对方法的检出限、有无交叉反应、符合率和抗干扰...     

聚合酶链反应-反向杂交快速检测巨细胞病毒糖蛋白gB、gH基因型变异

目的 建立一种简便、快速、敏感和特异的检测巨细胞病毒（HCMV）糖蛋白gB、gH基因型变异的方法。方法 以HCMV糖蛋白基因gH、gBn、gBclv为靶序列，设计17条具有型特异性的寡核苷酸探针，聚合酶链反应(PCR)扩增目的片段，反向杂交检测23例中国和6例德国移植患者HCMVgH、gBn、gBclv基因型变异，其结果与直接测序进行比较。结果 23例中国患者HCMV糖蛋白为gH1和2型，gB1、2和3型，未见gB4型；而6例德国患者的HCMV糖蛋白涵盖gH1和2型，gB1、2、3及4型。中、德国两患者均可同时感染2种不同基因型的病毒株。反向杂交技术对检测患者同时感染不同基因型病毒株优于直接测序。结论 PCR－反向杂交技术具有简便、快速、敏感和特异的特点，适用于临床实验室检测HCMV糖蛋白基因型变异。     

荧光定量PCR快速检测粪便中沙门氏菌方法的建立及应用

沙门氏菌属是一群形态和培养特性都类似的肠杆菌科中的一个大属,也是肠杆菌科中最重要的病原菌属。沙门氏菌菌型繁多,分布广泛,是重要的人畜共患病病原体之一。也是引起人类食物中毒最常见的病原菌。然而目前,包括我国在内的许多国家对沙门氏菌的检验普遍采用传统培养方法,报告检验结果大致需（4—7）d,耗时太长,程序繁琐。     

快速检测内皮细胞表面单个核细胞粘附的新方法

动脉粥样硬化的炎症学说认为 ,血中单个核细胞 (包括单核细胞和Ｔ淋巴细胞 )粘附于内皮是发病过程中重要的早期事件之一[1] 。如何快速、准确地检测这种附壁的单个核细胞是研究动脉粥样硬化发病机制或评价某些抗动脉粥样硬化药物疗效时所要面临的课题。Ｒｏｇｅｒｓ等[2 ] 1988年建立的方法较好地解决了这一问题。但其中涉及两种重要试剂 ,即氰化丙烯酸酯 (ｃｙａｒｏａｃｒｙｌａｔｅ)与Ｈｏｅｃｈｓｔ 3334 2 ,在国内不易得到。我们采用另一种染料 ,建立了新的检测方法 ,具有快速、简便、试剂易得等优点。一、材料与方法1.实验动物 :雄性…     

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一种提高基因芯片检测中杂交信号强度的简单方法

目的 改进PCR产物和固定探针杂交效率。提高信噪比，以提高基因芯片检测的灵敏度。方法 以淋球菌隐蔽型质粒pJD1的基因芯片检测为例，在荧光素标记引物的PCR产物中加入不同浓度的Taq酶抑制剂EDTA及位于固定探针所在位点的两翼的荧光素标记探针，一起变性后再进行常规杂交、冲洗。结果 加入EDTA和荧光素标记探针使基因芯片检测的荧光强度能提高6倍以上。结论 加入EDTA和荧光素标记探针是一种提高基因芯片检测的效率的简单而有效的方法。