B细胞表位预测的研究进展

表位,又称抗原决定簇,是指免疫应答中被特异的效应 分子或T、B淋巴细胞识别的抗原分子的特定结构位点。B细 胞表位是指抗原中可被B细胞抗原受体(BCR)或抗体特异 性识别并相互结合的线性片段或空间构象型结构。B细胞表 位的预测对免疫原性多肽和新型疫苗分子的设计都有很大 的帮助,并有利于诊断试剂的开发以及临床疾病的诊断。     

梅毒螺旋体TprF蛋白B细胞表位的预测与鉴定

目的 预测和鉴定梅毒螺旋体(Tp) 膜蛋白TprF氨基端保守区(TprF^N)的优势B细胞表位,为深入研究梅毒多价表位疫苗提供依据。方法 从GenBank获取TprF^N的氨基酸序列,采用Mobyle、ABCpred和IEDB在线软件综合分析预测TprF^N的B细胞表位并人工合成多肽;表达重组蛋白TprF^N并经Western blot鉴定后免疫兔,获取血清并测定抗体效价;以TprF^N免疫兔血清、梅毒患者血清(设正常人血清和正常兔血清为阴性对照),间接ELISA测定预测的7条人工合成的B细胞表位多肽的免疫反应性和特异性。结果 软件综合预测TprF^N的P1 (43-62AA)、P2(57-71AA)、P3(81-88AA)、P4(89-103AA)、P5(125-138AA)、P6(231-251AA)、P7(268-279AA)可能为B细胞表位;表达一可溶性蛋白,WB鉴定为目的 蛋白,其免疫抗体效价为1∶12 800以上;ELISA结果显示,预测表位P1、P3与TprF^N免疫兔血清及梅毒患者血清均呈阳性反应,而与对照血清均不反应。结论 P1、P3为TprF潜在的优势B细胞表位。     

人体疟原虫乳酸脱氢酶基因多态性及B细胞表位预测

目的　分析4种人体疟原虫乳酸脱氢酶（Plasmodium lactate dehydrogenase, pLDH）基因多态性并预测pLDH 肽链B细胞抗原表位。方法　收集传染病报告信息管理系统中登记的云南省疟疾病例血样和流行病学等信息。采用巢式PCR技术扩增4种人体疟原虫pLDH基因并测序,应用MEGA 7.0.26和DnaSP 5.10软件分析4种人体疟原虫pLDH基因DNA序列多态性,并采用免疫表位数据库（IEDB）预测pLDH 肽链B细胞抗原表位。结果　分别从153份间日疟、29份恶性疟、17份卵形疟和11份三日疟患者血样中获得间日疟原虫LDH（PvLDH）、恶性疟原虫LDH（PfLDH）、卵形疟原虫LDH（PoLDH）、三日疟原虫LDH（PmLDH）基因测序序列,分别定义15、2、4、2种单倍型,核苷酸多样性指数（π）为0.104。PoLDH基因种内分化程度较高,π为0.012;PvLDH、PfLDH和PmLDH基因π值均 < 0.001。4种人体疟原虫pLDH肽链可预测到4～5个/链的B细胞抗原活性区,活性得分约0.430;其中活性区短肽“86⁃PGKSDKEWNRD⁃96”为4种人体疟原虫共有的B细胞抗原表位,“266⁃GQYGHS(T)⁃271”仅出现在PvLDH和PoLDH肽链,PvLDH、PfLDH肽链特有的B细胞抗原表位分别是“212⁃EEVEGIFDR⁃220”和“208⁃LISDAE⁃213”。结论　PoLDH基因多态性可能来自微弱的负向纯化选择,PvLDH、PfLDH、PmLDH基因则可能维持了相对保守状态。pLDH肽链近C端可能存在可区分间日疟、恶性疟原虫感染的B细胞抗原表位“212⁃EEVEGIFDR⁃220”和“208⁃LISDAE⁃213”。     

粉尘螨3类变应原的B细胞线性表位预测及鉴定

目的 目的 预测并鉴定粉尘螨3类变应原 （Der f 3） 中的B细胞线性表位。方法 方法 运用生物信息学技术, 从抗原性、 表面易接近性、 柔韧性、 亲水性、 β转角等5个方面在线预测Der f 3的B细胞线性抗原表位。同时, 采用人工合成法合成相应B细胞表位肽分别与由12份螨性过敏性哮喘患者血清组成的3个血清池共同作用, 明确其中的强阳性表位肽序列。结果 结果成功预测了Der f 3中的8个B细胞表位肽。其中, 在过敏性患者血清与变应原特异性IgE结合试验中确认了33KAKAG?DCP40、 86HASGGEKIQVAEIYQHENYDSMTID110、 118LKTPMTLDQTNAKPVPLPPQGSDVKVG144、 199DVANGGVDSCQGDSGGPV?VD218和156QEGSYSLP1635个强阳性表位肽序列。结论 结论 成功确认了Der f 3变应原中5个B细胞线性表位序列, 为尘螨过敏性哮喘的诊断和治疗奠定基础。     

日本血吸虫复合B细胞表位抗原的制备和鉴定

目的 制备日本血吸虫复合B细胞表位抗原，并对其抗原性进行鉴定。 方法 用生物信息学软件（BioSun）预测已报告的日本血吸虫Sj22.6、Sj14?鄄3?鄄3、Sj26等3个B细胞表位片段的基因序列（P2、P6、P7），用随机顺序法连接3个片段，克隆入高效融合表达载体pET-32c（+）中，转化大肠埃希菌BL21感受态细胞，经酶切及基因测序鉴定重组子。阳性克隆经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，表达产物用Ni^2＋螯合柱纯化，用蛋白质印迹（Western blotting）分析该表达产物的抗原性。 结果 3个目的表位基因片段按P2-P6-P7和P6-P2-P7的顺序连接为2条复合表位片段（表位间由6个氨基酸组成的柔性接头连接），成功克隆入pET-32c（+）。其重组子均可表达相对分子质量（Mr）约20 400的融合蛋白。亲和层析纯化的融合蛋白经十二烷基磺酸钠?鄄聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）显示为单一条带（Mr 20 400），Western blotting分析显示，这2条重组复合表位蛋白均可被日本血吸虫病患者血清识别，而不与健康者血清反应。 结论 获得2个具有日本血吸虫病诊断潜在价值的复合B细胞表位抗原。     

刚地弓形虫主要抗原B细胞表位的筛选及鉴定

目的筛选刚地弓形虫主要抗原B细胞表位并在原核表达载体中表达,对纯化的表位重组蛋白进行免疫反应性鉴定。方法用计算机软件BioSun、DNAstar综合分析6个弓形虫主要抗原的亲水性、可及性、柔韧性、二级结构、极性参数等,每一抗原分子预测2个最佳表位,设计合成24条共12对寡核苷酸,两端分别引入NocI、XhoI酶切位点,退火形成的双链定向克隆至原核表达载体pET-32c中,EcoRI单酶切鉴定重组质粒Epitope/pET-32c。将含有Epitope/pET-32c的BL21单菌落接种至LB肉汤培养基中培养,导入表达。表达产物用Ni2 螯合柱亲和纯化,免疫印迹试验(Westernblot)分析重组表位蛋白与弓形虫抗原免疫血清的免疫反应性。结果成功构建了12个原核表达质粒Epitope/pET-32c,并经测序证实,在E.coliBL21有11个表位基因能有效表达重组融合蛋白;纯化的表位蛋白大小均在20.0kDa左右;Westernblot结果显示表位蛋白SAG2-A、SAG3-B能被弓形虫抗原免疫血清识别,且反应较强,SAG2-B为弱阳性,其余的则不能被识别。结论成功筛选到3个弓形虫B细胞表位基因,为进一步构建弓形虫复合表位抗原诊断弓形虫病奠定了基础。     

鼠疫耶尔森菌LcrV抗原B细胞表位的预测

目的预测鼠疫耶尔森菌LcrV抗原的B细胞表位,为抗LcrV单克隆抗体的制备提供理论依据,探索适合我国鼠疫耶尔森菌蛋白B细胞表位组研究的可行方案。方法采用EMBOSS网络平台以及DNAStar Protean软件分析LcrV蛋白的二级结构、可塑性、亲水性和抗原性指数等参数,进行B细胞表位的预测和分析。结果LcrV蛋白的B细胞表位可能位于第16～24、26～31、45～50、175～181、208～213和280～289位等氨基酸区域内或附近,其中16～24、26～31、175～181、208～213等4个短肽都与文献报道相吻合。结论预测得到的表位为后续抗LcrV抗原单克隆抗体的制备奠定了理论基础,为进一步表位分析和鉴定提供了参考依据;预测结果的准确性高,有助于利用表位预测法建立鼠疫菌蛋白B细胞表位研究的平台。     

肺炎链球菌StkP蛋白B细胞及T细胞抗原表位的生物信息学分析

目的 运用生物信息学方法对肺炎链球菌StkP基因编码蛋白的理化性质、结构等进行分析,并预测其潜在的B细胞以及T细胞抗原表位。方法 通过NCBI数据库获取StkP蛋白氨基酸序列的相关信息;运用ProtParam软件分析StkP蛋白的理化性质;采用ProScale软件预测StkP蛋白的亲水性、柔韧性、表面可及性、β-转角;使用SOMPA和SWISS-MODEL在线服务器分析StkP蛋白的二级结构并构建其三级结构;分别采用ABCpred及IEDB软件综合预测其B细胞表位,采用SYFPEITHI软件分析确定其T细胞表位。结果 StkP蛋白由659个氨基酸组成,理论pI值8.61,原子组成为C₃₁₉₇H₅₂₃₄N₈₇₂O₉₉₇S₁₄,不稳定指数为40.13,归类为不稳定蛋白,平均亲水系数(GRAVY):-0.294,属于亲水性蛋白;StkP蛋白的二级结构中α螺旋占33.08%,延伸链占19.58%,β-转角占7.74%,无规卷曲占39.61%。ABCpred及IEDB软件预测StkP蛋白...     

粉尘螨3类变应原的T细胞表位预测及鉴定

目的 目的 预测并鉴定粉尘螨3类变应原 （Der f 3） 的T细胞表位。方法 方法 运用生物信息学分析软件预测Der f 3的T 细胞抗原表位, 并人工合成所预测的T细胞表位肽。采用改良MTT法, 用预测表位肽刺激致敏鼠脾淋巴细胞进行脾淋巴 细胞增殖试验; 酶联免疫吸附试验检测脾细胞培养上清液中白细胞介素?2 （IL?2）、 γ干扰素 （IFN?γ）、 IL?4及IL?5水平。结 结 果 果 成功预测了Der f 3的5个T细胞表位肽, 通过脾淋巴细胞增殖试验, 其中3个表位肽序列可促进脾淋巴细胞增殖并 刺激细胞因子IL?2和IFN?γ的分泌, 抑制细胞因子IL?4和IL?5的分泌。其序列分别为37 GDCPYQISLQSSSHFCGG54 、 98 IY? QHENYDSMTIDNDVALIKLKTPMT123 和164 SELQRVDIDVVSREQCDQLYS184 。结论 结论 初步鉴定了Der f 3变应原中3个T细 胞表位序列, 为后续过敏性哮喘的诊断和特异性免疫治疗奠定基础。     

甲型H1N1流感病毒血凝素的B细胞抗原表位预测

目的预测甲型H1N1流感病毒血凝素可能的B细胞抗原表位。方法以甲型流感病毒血凝素的氨基酸序列一级结构为基础,用生物信息学手段预测血凝素氨基酸序列的二级结构并分析其序列的亲水性指数、柔韧性指数、可及性参数、极性参数以及抗原指数,推测B细胞抗原表位的可能位置。结果经综合各种单参数预测,甲型H1N1流感病毒血凝素氨基酸序列的98127、172189、498511肽段或附近可能存在B细胞抗原表位。结论预测B细胞抗原表位对甲型H1N1流感病毒的疫苗研制及其他相关研究奠定了一定的基础。     

日本血吸虫童虫期体被蛋白Th细胞表位预测及初步鉴定

目的预测并鉴定日本血吸虫童虫体被蛋白分子的Th细胞表位。方法利用在线服务器分别对有关序列进行跨膜区与信号肽的预测分析;采用结合基序扫描与计分矩阵等算法,以及基于多种分子动力学算法的配体受体相互对接的分子建模方法等进行Th细胞表位预测;人工合成肽采用以多聚赖氨酸为核心的含4个表位肽分支臂的复合抗原多肽;表位肽刺激免疫鼠脾淋巴细胞增殖效果的鉴定采用改良的MTT法。结果从373条日本血吸虫肝期童虫体被蛋白序列中筛得14条具有开放阅读框及信号肽结构的序列;预测得到至少与小鼠的1个MHCⅡ类分子结合的5个15肽表位序列;淋巴细胞增殖试验初步鉴定获得了1个SSLVISYSTVDRLVC（AY815893）候选体被蛋白Th细胞表位。结论初步鉴定了1个潜在的体被蛋白Th细胞表位,为进一步筛选抗血吸虫保护性Th细胞表位提供了理论和实验依据。     

诱导T细胞免疫反应的日本血吸虫抗原表位的重组表达与免疫原性鉴定

目的  对预测的日本血吸虫T细胞免疫反应表位进行合成与融合表达，并对其免疫原性进行分析。方法根据3个表位(P7、P17、P18)的基因序列，人工合成正、负链寡核苷酸序列，使正链的5 7端带有Nco I酶切位点，负链的3‘端带有Xho I酶切位点。将每条表位肽的正、负寡核苷酸链退火形成双链DNA后，定向克隆人表达载体pET32c(+)，电转化至E．coli DH5a，经PCR、酶切及DNA序列分析鉴定出分别含有P7、P17、P18序列的重组质粒。提取重组质粒转化至E. coli BL21(DE3)中，用异丙基硫代f3-D半乳糖苷对表位肽融合蛋白进行诱导表达，经12%十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳对表达产物进行分析。表位肽融合蛋白用Niz+螯合亲和层析胶纯化。同时根据P7、P17及P18的氮基酸序列人工合成这3个表位肽段。用纯化的表位融合蛋白、人工合成的表位肽体外刺激紫外线致弱尾蚴免疫C57BL/6J小鼠脾细胞，3H-TdR掺入法检测其刺激淋巴细胞的增殖效果。结果P7、P17、P18 3个表位肽基因序列被成功克隆到pET32c(+)中并获得重组质粒，重组质粒均能表达大小约20 kDa的融合蛋白。表达产物用Ni2+亲和层析胶纯化后获得纯化的肽融合蛋白。表位P7、P17重组蛋白或合成肽均能有效刺激小鼠淋巴细胞增殖。结论P7、P17肽段是日本血吸虫的T细胞抗原表位。     

解脲支原体3血清型和14血清型多带抗原B细胞表位预测

目的 预测解脲支原体(Ureaplasma urealyticum,Uu3和14血清型多带抗原(multiple banded antigen, MBA)的优势B细胞表位和Th表位。方法 利用GOR4和HNN方法预测Uu3和Uu14血清型MBA的二级结构,结合其跨膜区域、亲水性、极性、柔韧性、表面可能性和抗原性等方面特征,预测其优势B细胞表位;同时筛选MHC-Ⅱ类限制性Th表位。合成4个富含B/Th细胞多表位肽,免疫小鼠评价其免疫原性。结果 Uu3血清型和14血清型MBA的B、Th表位具有高度同源性,其共同的富含B/Th细胞抗原表位位于N端31-51、55-75、97-115和154-168肽段。MBA aa31～51 ( F1)、MBA aa 55～75( F2)、MBA aa 97～115( F3) 及MBA aa 154～168 ( F4) 4个多表位肽具有良好的免疫原性,其诱导产生的特异性抗体明显高于PBS对照组(P<0.01)。结论 多参数预测Uu MBA B细胞优势表位可为MBA单克隆抗体的制备和Uu表位疫苗设计等研究提供理论依据。     

中国莱姆病螺旋体菌株bmpA基因中人B细胞表位多态性分析

目的 研究我国伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi sensu lato),即莱姆病螺旋体菌株中bmpA基因及其人B细胞表位区的序列多态性。方法 选取61株莱姆病螺旋体分离株,PCR扩增其bmpA基因并测序后,结合4种基因型参考菌株序列,与从免疫表位数据库(Immune Epitope Database,IEDB)中查询到的B细胞表位序列进行比对分析。结果 中国B.garinii基因型菌株的cluster2、cluster3以及B.afzelii和B.valaisiana基因型所有菌株与参考序列比对后发现分别有3、9、5和18个异义突变。B细胞表位改变主要发生在B.afzelii基因型全部分离株和B.garinii基因型的cluster3及5株非成簇菌株。B.afzelii基因型菌株在B细胞表位区的异义突变A125S影响了2个B细胞表位;B.garinii基因型的cluster3和5株非成簇菌株B细胞表位区的3个异义突变导致5个B细胞表位均发生改变。结论 中国莱姆病螺旋体bmpA基因在4种基因型间和B.garinii基因型内存在较大多态性。     

Immunopathology of Schistosoma japonicum and S. mansoni infection in B cell depleted mice

To investigate the role of antibody in the pathogenesis of hepatic granulomas around schistosome eggs, mice were depleted of B cells by treatment from birth with anti-IgM serum and were subsequently infected with Schistosoma japonicum or S. mansoni. Anti-IgM treatment did not affect the development or fecundity of the worms or the larvae within the egg shells. Normal circumoval granulomas were present in the livers of B cell depleted mice 7 or 8 weeks after infection clearly indicating that antibody and immune complexes have no necessary role in the formation of granulomas. Hepatic fibrosis was also similar in B cell depleted and untreated mice at these times. Ten weeks after infection the size of S. japonicum egg granulomas in untreated mice had decreased but no change in the size of granulomas had occurred in B cell depleted mice, and hepatic fibrosis was more marked in treated than in untreated mice. Similar changes were noted in S. mansoni infected mice, assayed at 8 and at 12-13.5 weeks after infection. The effects of B cell depletion in the more chronic infections may be related to the absence of antibody but could also be caused by an influence on B cell-dependent suppressor T cells.     

鼠疫耶尔森氏菌F1抗原的表位预测

目的预测F1抗原的B细胞表位,为抗F1单克隆抗体的制备提供理论依据,探索适合我国鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)蛋白B细胞表位研究的可行性方案。方法采用EMBOSS网络平台以及DNAStar Protean软件分析F1蛋白的二级结构、可塑性、亲水性和抗原性指数等参数,进行B细胞表位的预测。结果F1蛋白的B细胞表位可能位于第106~132和141~155等区域内。结论预测结果为后续抗F1单克隆抗体的制备奠定一定理论基础,表位预测法有利于我国鼠疫菌B细胞表位研究平台的建立。     

肠道病毒71型VP1蛋白二级结构及B细胞表位的预测

目的预测C4基因亚型肠道病毒71型的VP1蛋白二级结构及B细胞表位,为EV71疫苗研制提供理论基础。方法本研究将宁波地区EV71分离株与国内外EV71代表株进行同源性分析和并构建亲缘进化树。以VP1基因序列为材料,应用EX-PASY服务器上的GOR4、SOPMA两种方法分析预测蛋白质二级结构,并结合蛋白质的亲水性、柔韧性、表面可能性等指标综合评价VP1蛋白的B细胞抗原表位。结果同源性分析和亲缘进化分析得出,2010年宁波EV71分离株属于C4a基因亚型,与基因库检索到的C4a基因亚型代表株核苷酸和氨基酸同源性较高,分别为93.6%～99.3%和98.3%～100%。VP1蛋白二级结构以无规则卷曲和β-片层为主,有多处抗原指数较高的区段,结合亲水性、柔韧性、表面可能性等指标,综合预测VP1蛋白的B细胞抗原表位在第39～40、159～167、212～220、287～290位氨基酸残基的可能性较大。结论 EV71VP1蛋白多个区段具有抗原潜力通过生物信息学方法预测VP1蛋白二级结构及B细胞表位为EV71疫苗研制提供理论基础。