椎体终板软骨细胞凋亡与椎间盘退变的相关性研究

目的 探讨椎体软骨终板内软骨细胞凋亡和椎间盘退变之间的关系.方法 40只成年新西兰白兔,随机平均分为实验组和对照组.实验组采用阻断椎体软骨终板营养途径的方法制作椎间盘退变模型,对照组不做任何处理.术后4周和8周,每组各处死10只动物,切取软骨终板和相应的椎间盘组织.TUNEL法检测终板软骨细胞的凋亡数,免疫组织化学方法检测椎间盘内Ⅱ型胶原阳性细胞数,并对两组数据进行相关性分析.结果 实验组软骨终板内凋亡的软骨细胞在4周、8周时分别为9.9±O.88个/视野和12.4±0.71个/视野,较对照组明显增加,4周、8周组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).相关分析显示,术后4周和8周终板软骨细胞凋亡与Ⅱ型胶原表达之间有高度的相关性,相关系数分别为0.86和0.82(均P＜0.05),表明椎体终板软骨细胞凋亡与椎间盘退变之间存在有高度的相关性.结论 阻断椎体软骨终板营养途径可导致椎间盘退变的发生,椎体终板软骨细胞凋亡增加可导致椎问盘内Ⅱ型胶原表达进一步减少.     

大鼠椎间盘软骨终板退变与细胞凋亡的形态计量学研究

 目的 观察研究增龄和负重对椎间盘软骨终板（cartilage endplate,CEP）形态与细胞凋亡的影响。方法 通过手术截肢及特殊饲养建立双后肢大鼠模型（n=45）,取同龄正常大鼠作为对照组（n=40）。在3、6、9、12月龄时实验组和对照组分别随机选取8只处死观察,取出L4-5椎间盘及相邻上下椎体组织。椎间盘取材后,行苏木精-伊红染色以及TUNEL染色。计数软骨终板区活细胞以及凋亡细胞数目,并且测量软骨终板厚度,计算软骨终板缺损程度。结果凋亡首先显著出现于软骨终板中,随着年龄的增加凋亡逐渐加剧,并直接导致细胞密度的显著降低。实验组软骨终板内软骨细胞的凋亡率在6月龄时较对照组明显增加,实验组6、9月龄组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。相关分析显示,软骨终板活细胞数目与椎间盘软骨终板破损程度具有相关性,相关系数为-0.97（P<0.05）,呈高度相关。实验组的软骨终板结构较对照组发生更严重的退变,软骨终板钙化层明显增厚、非钙化层变薄并出现裂隙。结论除增龄因素外,负重是增加细胞凋亡、加重椎间盘软骨终板破损和退变的重要因素。     

The relationship between cartilage end-plate calcification and disc degenerat ion: an experimental study

目的　研究椎体软骨终板钙化在椎间盘退变过程中的作用。方法　 2 0只新西兰兔随机分为造模与对照组 2组 ,每组再分 3个月和 8个月 2个观察亚组。切除造模组动物颈棘上、棘间韧带及分离颈椎后旁两侧肌肉 ,造成颈椎力学上的失衡而诱导兔颈椎间盘退行性改变。在术后 3个月和 8个月时分别处死动物 ,取颈椎间盘组织 ,行病理学检查在形态学上评定颈椎间盘退变程度 ,测定不同退变程度椎间盘软骨终板钙化层厚度。结果　退变程度较轻或基本正常的颈椎间盘 ,软骨终板结构良好 ,潮标清晰 ;退变程度较重的颈椎间盘 ,软骨终板发生明显纤维化 ,潮标前移 ,钙化软骨和软骨下骨板增厚。软骨终板钙化层厚度与椎间盘退变程度呈非常明显的相关性。结论　颈椎软骨终板的不断钙化和骨化导致颈椎间盘营养发生障碍可能是启动颈椎间盘退变的关键因素     

大鼠椎间盘软骨终板软骨细胞体外自然退变模型的建立

目的：建立大鼠椎间盘软骨终板软骨细胞体外自然退变模型，为椎间盘退变的机制研究提供载体。方法：酶消化及自然传代法分离培养大鼠椎间盘软骨终板软骨细胞，观察其形态学变化。采用MTT法测定第Ⅲ代软骨细胞的生长曲线。采用免疫细胞化学法检测其特征性Ⅱ型胶原的表达情况，对该模型进行鉴定。结果：大鼠椎间盘软骨终板软骨细胞表达特征性Ⅱ型胶原。第Ⅲ代细胞培养在生长第13天后，细胞分裂能力明显下降，核仁不清，细胞变形明显，以梭形为主，折、旋光性弱，细胞间隙变大，轮廓增强，胞浆内可见空泡、脂滴；Ⅱ型胶原合成明显下降，细胞增殖率显著降低；呈现自然退变过程。结论：建立椎间盘软骨终板软骨细胞体外自然退变模型，为椎间盘退变机制研究提供较好的细胞学基础。     

软骨终板细胞凋亡与颈椎间盘退变关系的研究

目的：探讨脊柱软骨终板细胞凋亡与颈椎间盘退变之间的关系。方法：24只清洁型wista大鼠,随机分为实验组和对照组。实验组沿C1-C7棘突做正中切口,剥离椎旁肌,切除C1-C7的棘上、棘间韧带及两侧关节突关节后外1/2,诱发加速脊柱退变;对照组仅切开皮肤后缝合。分别于第9周、18周、36周对两组动物施行过度麻醉处死,完整取下包含上下椎体的椎间盘。对颈椎标本行矢状位切片,分离软骨终板和椎间盘。颈椎间盘按Thompson椎间盘退变病理分级标准进行分级评定;将软骨终板石蜡包埋,切片。HE染色和Tunnel染色后,计数椎间盘软骨终板凋亡数量,评估软骨终板消失状况。结果：两组软骨终板细胞凋亡随时间进展而加速。与对照组相比,18周实验组软骨终板细胞凋亡率明显增高（P〈0.05）;在9周和27周时,实验组与对照组软骨终板细胞凋亡率无统计学差异。结论：脊柱退变模型显著增加了软骨终板细胞凋亡数量,加速了脊柱退变;随年龄增加,软骨终板凋亡细胞数量逐渐增加,软骨终板破坏程度增加,颈椎间盘退变过程加速;年龄是颈椎间盘退变的重要因素;软骨终板细胞凋亡是椎间盘发生退行性变的重要原因。     

退变颈椎间盘中的IL-1β、TNFα含量变化及软骨终板钙化的动物实验研究

目的 观察退变颈椎间盘内细胞因子的含量变化情况和颈椎软骨终板钙化与颈椎间盘退变的关系,研究中西药治疗退变颈椎问盘对细胞因子含量及软骨终板钙化的影响.方法 选用25只4月龄新西兰兔,体重2-3kg,随机分为正常对照组、模型浅层组、模型全层组、药物治疗浅层组、药物治疗全层组.建立家兔颈椎动力平衡失调模型,诱导颈椎间盘退变(正常对照组不作处理).术后7个月,药物治疗组(浅层、全层)给予抗骨增生胶囊和葡立胶囊(剂量按体重折算),灌胃2次/日,连用1个月.1个月后用耳缘静脉气栓法处死各组动物,用双抗夹心ELISA法检测颈椎间盘中IL-1β、TNFα抗体含量,并在形态学上评定颈椎间盘退变程度,测定各组动物颈椎软骨终板钙化层厚度,进行组间比较.结果 模型浅层组、模型全层组与正常对照组相比较,颈椎间盘中IL-1 β、TNFα含量明显升高(P<0.01),颈椎软骨终板钙化层明显增厚(P<0.01).而抗骨增生肢囊与葡立胶囊联合应用治疗退变颈椎间盘对IL-1 β、TNFα含量及软骨终板钙化有明显抑制作用(P<0.05).结论 退变颈椎间盘组织释放多种细胞因子和炎症介质.它们可加速颈椎间盘退变:而软骨终板钙化是颈椎间盘退变的始动因素,二者呈高度正相关.抗骨增生胶囊与葡立胶囊联合作用治疗退变颈椎间盘对IL-1β、TNFα含量及软骨终板钙化有明显的抑制作用.     

手法干预对实验性兔退变颈椎间盘Ⅱ型胶原的影响

目的:观察手法干预对实验性兔退变颈椎间盘Ⅱ型胶原的影响。方法:建立兔颈椎间盘退变模型,25只成年新西兰家兔随机分为正常对照组、模型组、手法预防组、手法治疗组,应用免疫组织化学方法观察手法干预对实验性兔退变颈椎间盘Ⅱ型胶原的影响。结果:与正常对照组比较,在模型组兔颈椎间盘中,髓核与软骨终板中Ⅱ型胶原阳性表达信号明显减弱。手法治疗、预防组均能不同程度的抑制髓核和软骨终板中Ⅱ型胶原的阳性表达程度下降,且手法早期干预效果优于晚期干预。结论:手法干预能不同程度的延缓颈椎间盘Ⅱ型胶原的退行性改变。     

溶髓方对颈椎间盘退变大鼠软骨终板细胞凋亡的影响

[目的]观察溶髓方对大鼠颈椎间盘退变中椎间盘组织形态软骨终板细胞凋亡的影响。[方法]选取健康wistar大鼠36只,随机分为空白组、对照组和实验组各12只。实验组和对照组建立wistar大鼠动静力失衡性颈椎间盘退变模型;空白组做假手术,仅切开皮肤后即缝合。术后1周开始灌胃,实验组给予溶髓方汤剂,对照组和空白组分别给予生理盐水,每日1次,持续喂药1个月,分别于术后9周、18周、36周处死两组动物,取下包含上下椎体的椎间盘。颈椎间盘按Thompson椎间盘退变病理分级标准进行分级评定。分离软骨终板和椎间盘,做椎间盘HE染色和软骨终板TUNEL染色,观察病理切片,并通过TUENL检测法计算椎间盘软骨终板细胞凋亡率。[结果]术后18、36周时,对照组和实验组软骨终板凋亡细胞较术后9周明显增加(P0.05),其中对照组较实验组凋亡细胞数量显著增多,两组细胞凋亡率比较有显著性差异(P0.05);HE染色和TUNEL染色结果显示:随着实验时间的延长,实验组和对照组中均出现椎间盘及软骨终板细胞数量减少、细胞形态变化的退变情况,但对照组的退变情况更明显。[结论]终板细胞凋亡是椎间盘发生退变的重要原因。溶髓方可以抑制软骨终板凋亡细胞的增加,减慢软骨终板细胞的凋亡速度,延缓椎间盘退变过程。     

姿势对椎间盘退变影响的实验研究

目的 通过建立压力可控型椎间盘退变模型,探讨不同的姿势对椎间盘退变的影响.方法 80只成年大鼠随机分为A,B,C,D 4组,分别模拟人类在站立(A组)、坐位直立(B组)、坐位前屈(C组)3种状态下椎间盘内的压力情况,应用恒定加压装置对第9,10尾椎加压,D组为对照组.A,B,C组每日加压4h,对照组仅在尾椎穿针,不加压;4组分别在7,14d后取标本进行组织学观察,应用免疫组化和阿利新蓝分析测量Ⅱ型胶原纤维和蛋白多糖含量,观察椎间盘退变情况.结果 ①A组、D组类似,椎间盘组织形态、基质胶原和蛋白聚糖(PG)含量和成分无明显变化;②C组椎间盘发生软骨细胞变性、坏死,髓核皱缩,纤维环胶原纤维变性、排列紊乱,软骨终板钙化、断裂,胶原纤维排列紊乱等组织形态学改变.髓核和软骨终板中PG总量和Ⅱ型胶原表达下降(P<0.05<0.05)③B组14d时形态学未观察到软骨细胞坏死等退变表现,但Ⅱ型胶原以及PG含量比对照组明显减少(P<0.05),退变程度较C组轻.结论 椎间盘承受的压力越大,持续时间越长,退变越明显,因此不同的姿势对椎间盘退变影响不同,其中以坐位前屈时对椎间盘退变影响最大,从而提醒人们在生活工作中注意良好的姿势.     

TNF-α椎间盘注射对软骨终板β-catenin与Adamts-5表达影响

目的探讨TNF-α椎间盘注射对大鼠软骨终板β-catenin与Adamts-5蛋白表达的影响与意义。方法取SPF级12周龄SD大鼠30只,随机分成空白对照组(A组)、假手术组(B组)、TNF-α椎间盘注射组(C组),每组10只(n=10)。C组大鼠在X线透视下穿刺椎间盘并注射TNF-α25μL(10 ng/μL),B组大鼠椎间盘穿刺成功后注射生理盐水25μL,A组大鼠椎间盘不做任何干预。术后4周采用组织病理学观察软骨终板退变情况,并采用Western-Blot检测软骨终板β-catenin与Adamts-5蛋白表达。结果 HE染色显示C组大鼠椎间盘软骨终板出现明显退行性改变。Western-Blot检测显示C组大鼠椎间盘软骨终板β-catenin与Adamts-5表达均显著上调,与A组及B组相比,差异有统计学意义(P0.05)。结论 TNF-α椎间盘注射可诱发椎间盘软骨终板退变,同时上调软骨终板β-catenin及Adamts-5表达,提示TNF-α上调β-catenin及Adamts-5表达在软骨终板退变中可能发挥了重要作用。     

Correlation between osteoporosis and degeneration of intervertebral discs in aging rats

This study examined the correlation between osteoporosis and the degeneration of in-tervertebral discs. Sprague-Dawley rats were maintained up to 22 or 28 months. The femoral bone, tibial bone and lumbar vertebra were histologically studied and the expression of collagen type Ⅱ and Ⅹ in intervertebral discs was immunohistochemiscally determined. Several indices for the de-generation of intervertebral discs and osteoporosis and the correlation among them were then ana-lyzed. Close correlations were found among the indices for the degeneration of intervertebral discs, including the relative area of the vascular bud, the ratio of the uncalcified and the calcified layers, the expression of collagen type Ⅱ and Ⅹ. The correlation with collagen type Ⅹ was negative. There existed positive correlations among the indices for osteoporosis, including the thickness ratio of cor-tical bone, the relative area of bone trabecula, the density of femoral and vertebral body bones, and the maximum stress and strain on bone. Analysis on the relationship of osteoporosis and the disease on disc showed that the indices of osteoporosis were negatively correlated with the indices of the de-generation of intervertebral discs but the expression of collagen type Ⅹ was positively correlated, with the density of vertebral body bones having the strongest dependence on collagen type Ⅹ. The maximum stress and strain bore no correlation with the degeneration of intervertebral discs. These results suggest that osteoporosis was negatively correlated with the degeneration of intervertebral discs.     

Effect of pcDNA3.1- vascular endothelial growth factor 165 recombined vector on vascular buds in rabbit vertebral cartilage endplate

Background  This study aimed to investigate the effect of pcDNA3.1-vascular endothelial growth factor (VEGF)165 vector on vertebral cartilage endplate vascular buds and intervertebral discs.

Methods  Rabbits were randomly assigned to the control and experimental groups with 10 in each. In the experimental group, we anesthetized the rabbits and exposed the front vertebral body. Using the mark of the longitudinal ossature of the front vertebral body of the lumbar vertebrae, we advanced a needle at the central point of the front fourth and fifth lumbar intervertebral discs and injected 20 µl pcDNA3.1-VEGF165. Similarly, in the control group, we injected 20 µl pcDNA3.1. At 4 and 8 weeks post-injection, we examined the changes of the vertebral cartilage endplate using X-ray radiograph, histology, and scanning electron microscopy.

Results  The vertebral cartilage endplate calcification and degeneration in the experimental group were less than those in the control group at 8 weeks post-operation. The average number and diameter of vascular buds obviously increased in the experimental group at 4 and 8 weeks post-operation. The number of vascular buds and the diameter in the region of the inner annulus increased when compared to those in the area near the nucleus pulposus.

Conclusions  The pcDNA3.1-VEGF165 plasmid can increase the average number and diameter of vascular buds and decelerate intervertebral disc degeneration.

     

X型胶原基因在特发性脊柱侧凸患者顶椎椎间盘内表达的初步研究

目的　研究X型胶原基因在椎间盘内的分布及其在特发性脊柱侧凸发病中的作用。方法　收集 14例特发性脊柱侧凸患者顶椎及中间椎椎间盘共 2 8个 ,13例已知病因的脊柱侧凸患者顶椎及中间椎椎间盘共 2 6个为对照。 3例突然死亡的正常青少年椎间盘共 6个作为正常对照。采用免疫组织化学技术和RNA探针原位杂交技术研究X型胶原基因mRNA在椎间盘内不同部位的分布。终板软骨内X型胶原原位杂交图像输入图像分析系统 ,比较X型胶原mRNA含量在不同部位的分布。结果　X型胶原主要分布于肥大的软骨细胞周围 ,mRNA分布于终板软骨内肥大的软骨细胞。在少量侧凸患者髓核内也可见其少量阳性表达 ,但与病因无关。特发性侧凸组顶椎及中间椎 ,已知病因组顶椎及中间椎X型胶原mRNA含量均高于正常对照组 (P <0 0 5 ) ,而特发性侧凸组与已知病因组间差异无显著意义 (P >0 0 5 )。结论　X型胶原主要分布于终板软骨内肥大软骨细胞 ,髓核内部分类软骨细胞也具有分泌作用。侧凸患者X型胶原表达量显著增高主要由于长期应力引起了软骨的早期钙化。X型胶原在侧凸患者髓核内的表达可能是髓核内类软骨细胞异常应力下分泌的结果     

颈椎间盘退变动物模型的制备及终板软骨细胞迁移规律的研究

目的制备双后足大鼠增龄颈椎间退变的动物模型并研究颈椎间盘自然老化及退变过程中髓核中软骨样细胞的来源及其规律。方法4周龄SD大鼠76只,随机分成两组。实验组40只大鼠通过截除前肢制备双后肢大鼠颈椎间盘退变的动物模型,按术后3、6、9、12个月4个时间段分组,每组10只;对照组36只大鼠未予处置,按实验开始后4、8、12、16个月分4组,每组9只。每组大鼠处死后摄颈椎正侧位X线片并制备C4～5、C5～6和C6～7椎间盘中矢状面组织学切片,行HE、番红．0染色,研究观察颈椎间盘退变情况及终板软骨细胞向髓核迁移的规律。结果截除双前肢后,双后肢大鼠全部存活,实验组大鼠术后9、12个月影像学及组织学检查均出现颈椎间盘退变的典型征象。颈椎间盘老化的过程中,终板的软骨细胞向髓核不断迁移,在髓核、终板与内纤维环的交界区,软骨细胞沿胶原纤维排列的方向向髓核边缘迁移;在髓核的中央区域,软骨细胞平行或垂直于终板向髓核迁移,脊索性髓核向心性皱缩并最终完全被纤维软骨性髓核取代。在颈椎间盘退变的过程中,这一过程完成得更快、更早。结论双后足大鼠颈椎间盘退变模型不损伤动物靶器官正常的解剖结构,成功率高、重复性好,符合人类颈椎间盘退变规律;髓核中的软骨样细胞由终板软骨细胞迁移而来,在髓核的不同部位及椎间盘老化和退变的不同时期表现出不同的迁移规律。     

颈椎软骨终板Ank表达的变化

目的 观察ANK/ANKH(ANK/ANKH)在正常颈椎软骨终板和退变软骨终板中的表达变化,探讨软骨终板中ANK/ANKH的表达与椎间盘退变的相关性.方法 选择2007年11月至2009年2月45例颈椎骨折、脱位及颈椎病患者术中取出的颈椎软骨终板,其中实验组28例,男17例,女11例;对照组17例,男10例,女7例.对照组术前MRI检查软骨终板均为Miller分级0级,术后病理证实椎间盘无明显退变或Thompson椎间盘退变病理分级1级;实验组Miller分级1～3级,Thompson病理分级3～5级.VON KOSSA染色观察标本的钙化情况,免疫组织化学SABC染色法、逆行聚合酶链反应和免疫印迹方法检测ANK的表达.结果 VON KOSSA染色显示实验组可见较多的矿化结节,对照组出现少量或无矿化结节.免疫组织化学染色显示终板软骨细胞有Ankh蛋白表达,主要定位于细胞膜.实验组ankh基因mRNA表达(0.682±0.154)低于对照组(0.805±0.171),差异有统计学意义(P＜0.05).实验组Ankh蛋白表达(0.172±0.030)低于对照组(0.196±0.028),差异有统计学意义(P＜0.05).结论 伴随软骨终板的退变,ANK/ANKH的表达明显降低且与椎间盘的退变程度呈正比,提示调节ANK在终板软骨细胞中的表达有可能会阻止椎间盘的退变.     

IL-6对体外培养的兔软骨终板细胞生物学行为的影响

目的 探讨IL-6对体外培养的兔软骨终板细胞生物学行为的影响.方法 分离培养兔软骨终板细胞,通过甲苯胺兰染色等方法鉴定后,分别加入不同浓度的IL-6,MTT法测定不同时间点软骨终板细胞增殖活性的变化;流式细胞仪检测软骨终板细胞生长周期的变化;RT-PCR检测蛋白聚糖、Ⅱ型胶原mRNA的表达变化.结果 10、50、100 ng/ml IL-6对软骨终板细胞的增殖无影响,50 ng/ml IL-6对软骨终板细胞细胞周期无影响,10、50 ng/ml IL-6均对Aggrecan mRNA的表达无影响,仅50 ng/ml浓度时IL-6可降低Collagen Ⅱa mRNA的表达.结论 较大剂量IL-6时可抑制软骨终板基质合成,从而促进椎间盘的退变.     

腰椎软骨终板细胞凋亡与椎间盘退变的关系

目的:建立脊柱退变的动物模型,确定脊柱软骨终板细胞凋亡在脊柱退变过程中的意义。方法:选取健康大白鼠24只,随机分为实验组和对照组。建立模型后,在不同时间段对腰椎标本行矢状位切片,分离软骨终板和椎间盘。计数椎间盘软骨终板细胞凋亡数量,评估软骨终板消失状况。结果:腰椎间盘退变的组织学表现,HE染色观察腰椎间盘细胞凋亡状况,TUNEL染色比较对照组和实验组在18周均有明显差别。结论:脊柱退变模型显著增加了软骨终板细胞凋亡数量,腰椎间盘退变过程加速,所以软骨终板细胞凋亡是椎间盘发生退行性变的重要原因。