重症急性胰腺炎外周血中性粒细胞凋亡及其调控机制的研究

目的初步探讨重症急性胰腺炎（SAP）外周血中性粒细胞的凋亡及凋亡抑制蛋白survivin在SAP中性粒细胞凋亡延迟调控中的作用。方法48只SD大鼠随机分为急性坏死性胰腺炎（ANP）组和假手术（SO）组。采用胰胆管逆行注射4％牛磺胆酸钠（1ml／kg体重）制模，制模后24、48、72h分别处死动物。取胰腺组织评估病理变化；TUNEL荧光标记法检测外周血中性粒细胞的凋亡；RTPCR检测外周血中性粒细胞survivin mRNA的表达。结果ANP组胰腺病理评分较（SO）组明显升高（P〈0．05）。ANP组中性粒细胞凋亡率较SO组明显降低，随时间延长更明显（P〈0．05）。ANP组中性粒细胞survivin mRNA水平均较SO组明显升高，且随时间延长更明显（P〈0．05）。ANP组中性粒细胞凋亡率分别与胰腺病理评分和survivin mRNA水平呈负相关（r=0．97，r=0．99，P〈0．05）。结论ANP时外周血中性粒细胞凋亡明显延迟，survivin mRNA高表达．表明survivin在调控SAP外周血中性粒细胞凋亡延迟机制中可能具有重要作用。     

白介素-18在急性胰腺炎大鼠中性粒细胞凋亡中的作用

目的:探讨白介素-18(IL-18)在重症急性胰腺炎(SAP)时外周血中性粒细胞(PMN)凋亡中的作用.方法:SD大鼠60只,随机分为2组,每组30只,分别建立大鼠急性坏死性胰腺炎组(ANP)及假手术组(SO)模型,在制模后3、6、12h分期分批处死大鼠,抽取下腔静脉血测定血淀粉酶含量及血清中IL-18的含量,作中性粒细胞分离并检测外周血中性粒细胞凋亡率;同时对大鼠胰腺组织行病理切片HE染色,并对胰腺组织进行病理评分.结果:ANP组中性粒细胞(PMN)凋亡率较SO组明显降低,并随着时间的延长逐渐明显(P<0.01),至术后12h降至2.15%±0.45%;ANP组血清中IL-18的含量较SO组明显升高,而且随着时间的延长更明显(P<0.01),在12h达到4705.70±296.30;ANP组PMN的凋亡率与血清中IL-18的水平呈负相关(r=-0.78,P<0.01).结论:ANP组外周血PMN的凋亡明显延迟,血清中IL-18的含量明显增高,IL-18可能在急性胰腺炎外周血的PMN凋亡中发挥作用.     

重症急性胰腺炎与中性粒细胞凋亡蛋白质的相关性

目的:探讨重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)的发生发展与中性粒细胞(polymorpho nuclear neutrophil,PMN)凋亡相关蛋白质是否相关.方法:SD大鼠60只,随机分为2组,每组30只,建立急性坏死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis,ANP)组和假手术(sham-operated,SO)组模型,分别在制模后3、6、12h分批处死大鼠,抽取下腔静脉血密度梯度离心分离PMN,用流式细胞仪测定PMN凋亡比率,对胰腺组织进行病理评分.并对大鼠制模后12h的PMN裂解,应用Labelfree技术对两组PMN进行蛋白定量差异分析,进一步鉴定出与凋亡有关的差异蛋白质.同时收集我院2008-06/2012-06收治的28例SAP患者,随机分为治疗组(14例)和对照组(14例).对照组采用常规综合治疗,治疗组患者在常规综合治疗的基础上加用生长抑素(somatostatin,SST)持续静脉滴注.比较两组患者的平均腹痛持续时间、淀粉酶恢复时间、平均住院天数以及并发症发生率、转手术率、死亡率.分析凋亡相关蛋白质的抗凋亡机制及生长抑素在治疗SAP中的诱导凋亡作用,推断SAP的发生发展是否与凋亡相关蛋白质有关.结果:ANP组PMN凋亡延迟,与SO组各个时间点比较差异有统计学意义(均P<0.01);鉴定出与PMN凋亡有关的4种蛋白质:78kDa葡萄糖调节蛋白、RhoGTPases、L-乳酸脱氢酶A链和血红蛋白α2链(ANP组与SO组的比值分别为1.953614、3.526625、1.766764、0.609825),两组差异有统计学意义(P<0.05).治疗组患者的平均腹痛持续时间、淀粉酶恢复时间及平均住院天数明显短于对照组患者,两组比较差异有统计学意义(P值分别为0.041、0.001、0.000).治疗组患者的并发症发生率、转手术率和死亡率明显低于对照组患者,两组比较差异有统计学意义(P=0.022,0.029,0.029).结论:ANP时,PMN凋亡延迟,与凋亡有关的差异蛋白质可能参与了ANP外周血PMN凋亡延迟;应用生长抑素治疗SAP,能明显缩短患者的临床症状缓解时间,减少并发症,降低患者的死亡率;SAP的发生发展可能与凋亡相关蛋白质有关.     

大鼠急性胰腺炎时胰腺腺泡细胞凋亡及Bax,Caspase-8的表达

目的:研究大鼠急性胰腺炎腺泡细胞凋亡情况,凋亡调控基因Bax与凋亡蛋白酶Caspase-8的表达及其同疾病严重程度的关系.方法:胆胰管逆行注入不同浓度去氧胆酸钠方法制备大鼠急性胰腺炎模型,设假手术(SO)组、急性水肿性胰腺炎(AEP)组和急性坏死性胰腺炎(ANP)组.采用TUNEL技术检测胰腺腺泡细胞的凋亡,RT-PCR与免疫组化方法分别分析胰腺组织Bax,Caspase-8 mRNA及蛋白的表达,对胰腺组织进行病理学评分并测定血清淀粉酶及IL-6,TNF-α含量.结果:与SO组比较,AEP与ANP组胰腺组织显示不同程度的病理损害,血清淀粉酶(63 413±6118,1 532 134±17 654 nkat/L vs 15 736±483 nkat/L,P＜0.01)及TNF-α(1.86±0.13,2.97±0.14μg/L vs 0.95±0.08 μg/L,P＜0.01),IL-6 (47.10±7.05,170.10±7.59 ng/L vs 29.20±4.47 ng/L,P＜0.01)浓度显著升高,且ANP组显著高于AEP组(P＜0.05);AEP与ANP组腺泡细胞凋亡指数显著升高(22.09±3.71,6.50±1.58 vs 0.13±0.05,P＜0.01),但ANP组显著低于AEP组(P＜0.05).同时发现,AEP与ANP组胰腺组织Bax (mRNA:1.530±0.501,1.046±0.337;蛋白:453.7±30.5,339.4±26.7)和Caspase-8(mRNA:0.595±0.17,0.505±0.173;蛋白:3606±337,3134±231) mRNA及蛋白表达水平均显著高于SO组(Bax mRNA:0.613±0.244,Bax蛋白:245.2±30.0;Caspase-8mRNA:0.357±0.130,Caspase-8蛋白:2396±266)(P＜0.01),ANP组Bax mRNA及蛋白表达水平显著低于AEP组(1.046±0.337,339.4±26.7 vs 1.530±0.501,453.7±30.5,P＜0.05),ANP组Caspase-8 mRNA及蛋白表达水平低于AEP组,但差异不具有显著性意义.结论:急性胰腺炎时胰腺腺泡细胞发生凋亡伴随凋亡调控基因Bax与凋亡蛋白酶Caspase-8表达增加,并同病情严重程度呈负相关关系.     

急性胰腺炎大鼠胰腺组织中Smac/DIABLO、XIAP mRNA的表达及其意义

目的 检测急性胰腺炎(AP)大鼠胰腺组织中促凋亡基因Smac/DIABLO和凋亡抑制基因XIAP的mRNA表达,分析其与疾病严重程度的关系.方法 54只SD大鼠按数字表法随机分成假手术组、急性水肿性胰腺炎(AEP)组、急性坏死性胰腺炎(ANP)组.通过胰胆管逆行注射1%、3.5%脱氧胆酸钠方法分别制备AEP、ANP模型.收集制模后3、6、12 h胰腺标本,常规病理检查;TUNEL法检测细胞凋亡;实时定量PCR法检测Smac/DIABLO、XIAP mRNA的表达.结果 胰腺病理改变表示模型制备成功.术后6 h假手术组、AEP组、ANP组胰腺腺泡细胞凋亡指数分别为0.67±0.82、6.62±0.78和4.70±0.82,各组间相差显著(P＜0.05).AEP组Smac/DIABLO mRNA的表达随时间延长而逐渐增加,ANP组则随时间延长而逐渐下降,以假手术组为参考,6 h时AEP组和ANP组的表达量分别为2.41±0.92和1.47±0.53,相差显著(P＜0.05).相反,AEP组XIAP mRNA的表达随时间延长逐渐下降,而ANP组表达逐渐增加,6 h时表达量分别为5.51±1.07和6.99±1.00,相差显著(P＜0.05).结论 AP时胰腺组织Smac/DIABLO mRNA的表达与细胞凋亡指数一致,与病情严重程度相反,而XIAP mRNA的表达与病情严重程度一致.XIAP、Smac/DIABLO基因参与细胞凋亡的调节.     

谷氨酰胺对急性坏死型胰腺炎大鼠肠道衰竭的治疗作用

目的观察谷氨酰胺(Gln)对急性坏死型胰腺炎(ANP)大鼠肠道衰竭的治疗作用,并探讨其作用机制.方法 Spraque-Dawley 大鼠54只,随机分为假手术组(SO)、ANP组、Gln治疗组(ANP+Gln),每组18只.采用5%牛磺胆酸钠溶液经胆胰管内逆行注射诱导大鼠ANP模型.大鼠中心静脉置管,用微量输液泵输注含等氮、等热卡的氨基酸溶液,ANP+Gln组加入3%丙氨酸-Gln双肽(相当于2%Gln溶液,剂量0.5g·kg-1·d-1).术后24、48、72 h分批处死大鼠并留取标本,分别做肠黏膜组织病理检查,肝、胰、脾、肠系膜淋巴结(MLN)和腹水等组织细菌培养,门静脉血内毒素测定,TUNEL法检测肠黏膜上皮细胞凋亡;逆转录-聚合酶链反应研究肠黏膜组织胰岛素样生长因子1(IGF-1)、Gln酶和Gln合成酶mRNA表达.结果 SO组大鼠各组织培养均无阳性细菌,ANP组细菌培养阳性率明显高于SO组,P＜0.05,以MLN阳性率最高;ANP+Gln组细菌培养阳性率则显著低于ANP组,P＜0.05.血浆内毒素在ANP组明显高于SO组(P＜0.05),且随着时间延长而递升;ANP+Gln组血浆内毒素较ANP组显著下降(P＜0.05).ANP组肠黏膜绒毛高度显著低于SO组 (P＜0.05),提示ANP时肠黏膜处于萎缩状态,而ANP+Gln组较SO组则差异无显著性 (P＞0.05).ANP组肠黏膜上皮细胞凋亡指数明显高于SO组(P＜0.05),而ANP+Gln组较SO组差异无显著性(P＞0.05).SO组肠黏膜IGF-1、Gln酶和Gln合成酶 mRNA表达恒定,ANP组三者表达均明显下调,而Gln则能显著上调IGF-1、Gln酶和Gln合成酶 mRNA表达.结论 ANP大鼠肠黏膜屏障处于衰竭状态,并由此导致肠道细菌和内毒素移居.Gln可能通过刺激肠黏膜IGF-1、Gln酶和Gln合成酶 mRNA表达,下调肠黏膜细胞凋亡,从而促进肠黏膜修复,有效地控制ANP并发肠道衰竭.     

银杏苦内酯B治疗大鼠急性坏死性胰腺炎量效关系的实验研究

目的 探讨银杏苦内酯B(BN52021)治疗大鼠ANP的最佳量效关系.方法 70只雄性Wistar大鼠随机分为假手术组(SO组),ANP组,二甲基亚砜对照组(DMSO组),BN52021 2.5 mg、5mg、10 mg/kg体重治疗组(BN1、BN2、BN3组),善宁20 μg/kg体重治疗组(SS组)共7组.胰胆管逆行注射5%牛磺胆酸钠制备ANP模型.SO组、DMSO组和BN治疗组分别于术后15 min股静脉注射等量生理盐水、0.5%DMSO和不同浓度的BN52021,SS组皮下注射善宁.各组分别于制模后6 h取血检测血清淀粉酶和磷脂酶A2(PLA2)含量,记录腹水量,取胰腺组织行病理学检查和检测血小板活化因子受体(PAF-R)mRNA表达.结果 ANP组和DMSO组血清淀粉酶、PLA2、腹水量、胰腺病理分值较SO组显著升高(P＜0.05),各治疗组较ANP组显著降低(P＜0.05),且BN2组血清淀粉酶、PLA2含量的降低又较BN1、BN3和SS组更显著(P＜0.05).ANP组胰腺组织PAF-R mRNA表达较SO组显著降低(P＜0.05),各治疗组较ANP组显著升高(P＜0.05),而各治疗组间无显著差异.结论 静脉注射BN52021 5 mg/kg体重治疗ANP大鼠具有最佳的量效关系.     

血管活性肠肽对急性坏死性胰腺炎大鼠肠黏膜屏障功能的影响

目的 探讨血管活性肠肽(VIP)对ANP大鼠肠黏膜损伤的影响.方法 54只SD大鼠随机分成假手术组(SO)、ANP组和VIP组,每组分制模后1 h、6 h、12 h 3个时间点,各6只.采用4%牛磺胆酸钠胰胆管逆行注射制备ANP模型,VIP组在制模后5 min腹腔内注射VIP 5 nmol.ELISA法检测血浆及肠组织匀浆VIP水平;MB-80微生物快速动态检测系统检测血浆内毒素水平;RT-PCR法检测肠黏膜组织TNF-α、IL-6、IL-10 mRNA表达;肠黏膜行病理学检查.结果 ANP组肠黏膜结构损害明显,VIP组病变减轻.ANP组血浆及肠黏膜VIP水平在制模后6 h分别为(49.582 ±3.735)pg/ml和(87.731 ±4.601)pg/g pro,均显著低于SO组(P＜0.05),制模后12 h分别为(65.192±5.785)pg/ml和(110.978 ±6.420)pg/g pro,高于SO组;ANP组制模后6 h血浆内毒素水平、肠黏膜TNF-α、IL-6、IL-10mRNA表达量分别为(29.570±5.127)pg/ml、0.861±0.081、1.150±0.187和0.786±0.102,均显著高于SO组(P＜0.05).VIP组制模后6 h血浆内毒素水平、肠黏膜TNF-α、IL-6 mRNA表达分别为(20.486 ±2.811)pg/ml、0.707 ±0.095和0.889 ±0.136,均较ANP组下降(P＜0.05);IL-10 mRNA表达为0.992 ±0.126,较ANP组增高(P＜0.05).结论 VIP对ANP大鼠肠黏膜损伤具有明显的保护作用.     

急性坏死性胰腺炎胰腺组织中褪黑激素受体表达及褪黑激素干预作用

目的 探讨急性坏死性胰腺炎(ANP)胰腺组织中褪黑激素受体MT1表达及褪黑激素(MT)干预作用.方法 54只SD大鼠随机分为假手术组(SO组)、急性坏死性胰腺炎组(ANP组)、MT干预组(MT组),每组18只.应用胰胆管逆行注射牛磺胆酸钠的方法诱导ANP模型,MT组于诱导模型前30 min腹腔注射MT.术后4 h、8 h和12 h分批处死大鼠(每个时间点6只),以免疫组化和实时定量PCR分别检测胰腺组织中MT1蛋白及MT1 mRNA的表达;检测血清淀粉酶、胰腺组织中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)及TNFα的含量,并行胰腺病理检查.结果 (1)ANP组胰腺病理损伤呈进行性加重,MT组胰腺病理损伤较ANP组明显减轻(P＜0.05).(2)淀粉酶、MDA、TNFα水平在ANP组较S0组明显增高(P＜0.05或P＜0.01),而MT组较相应时间点ANP组显著降低[12 h,(2348.00±278.90)U/L比(3194.83±538.10)U/L,(2.255±0.472)μmol/L比(2.960±0.722)μmol/L,(102.929±29.399)ng/L比(378.544±183.454)ng/L,P＜0.05].SOD水平在ANP组各时点较SO组显著降低(P＜0.01),而MT组较ANP组显著升高[12 h,(11.448±1.594)U/L比(8.427±1.950)U/L,P＜0.05].(3)与SO组相比,MT1蛋白及MT1 mRNA表达在ANP组胰腺组织中明显下降(P＜0.05),且随ANP病变加重表达减弱,而MT组表达较ANP组明显增多.结论 MT干预可提高SOD活力,降低MDA、TNFα水平,故能显著减轻ANP时胰腺病理损伤,MT1在ANP发病机制中可能具有重要作用,MT对ANP中的干预作用可能与上调胰腺组织中MT1的表达有关.     

褪黑素、维生素C在重症急性胰腺炎脂质过氧化反应中的作用

目的 观察褪黑素(MLT) 、维生素C(Vit C)在实验性急性坏死性胰腺炎(ANP)时对脂质过氧化反应的影响.方法 100只Wistar大鼠随机分为正常对照组(正常组)、ANP + 生理盐水组(ANP组)、ANP + MLT组(MLT组)、ANP + Vit C组(Vit C组)、ANP + MLT + Vit C组(联合组).采用胰胆管末端穿刺逆行注入3%牛磺胆酸钠(1 ml/kg体重)制备ANP模型.MLT组于制模后即刻皮下注射MLT 50 mg/kg体重,Vit C组肌内注射Vit C 1g/kg体重.联合组则合并应用.术后6 h和24 h处死大鼠,取血检测血清淀粉酶(AMY)、血清丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)活性.胰腺病变程度按病理学评分,电镜观察超微结构.结果 MLT组、Vit C组和联合组在各时间点的AMY及MDA含量较ANP组显著降低(P ＜ 0.01),各时间点的SOD活性较ANP组显著升高(P ＜ 0.01).MLT组、Vit C组和联合组各时间点的胰腺炎症、腺泡坏死程度及出血均较ANP组明显减轻,病理分值明显低于ANP组(P ＜ 0.01或P ＜ 0.05).结论 自由基所引发的脂质过氧化反应损伤是SAP发病过程中的重要因素之一,MLT及Vit C可有效地减轻SAP时脂质过氧化反应损伤,明显减轻SAP时胰腺的病理改变,两者联合使用效果更佳.