重症肌无力抗乙酰胆碱受体单链抗体基因的构建

[目的 ]构建重症肌无力抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7基因 .[方法 ]应用PCR技术及基因克隆技术分两步完成重链和轻链可变区基因的克隆 ,再对构建的单链抗体A 7基因进行序列测定检测其核苷酸序列 .[结果 ]构建的重组质粒经序列分析 ,重链可变区基因长度为 36 9bp ,轻链可变区基因长度为 32 1bp ,单链抗体基因长度为 735bp ;单链抗体A 7基因正确地插入在载体质粒pHEN 2开放读码框架内 .[结论 ]成功地构建重症肌无力抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7基因 ,为进一步制备基因工程抗体奠定了基础 .     

单链抗体A7基因真核表达载体的构建

[目的]构建抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7基因的真核表达载体,为单链抗体A 7基因的真核表达及基因治疗重症肌无力奠定基础.[方法]应用PCR技术,从已构建的含有抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7基因的重组原核表达载体pHEN 2单链抗体A 7上扩增单链抗体A 7基因并纯化,将纯化后的PCR产物经EcoRⅠ和AvrⅡ双酶切后,用低熔点琼脂糖凝胶电泳回收并纯化,再与经同样酶切并纯化的真核表达载体pPIC 9 K连接,将其产物转化至大肠杆菌DH 5α后扩增,再用AvrⅡ和EcoRⅠ酶切和测定序列检查ScFv A 7基因插入的准确性.[结果]构建pPIC 9 K-ScFv A 7重组载体,经序列测定检查核苷酸序列正确,且ScFv A 7基因准确地克隆至载体开放读码框架内.[结论]成功地构建了抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7基因的真核表达载体.     

重症肌无力单链抗体A7基因在毕赤酵母中的表达

[目的]将抗乙酰胆碱受体单链抗体(ScFv)A 7基因转化至毕赤酵母GS 115,筛选阳性转化子并诱导蛋白表达,制备单链抗体A 7蛋白.[方法]将构建的含有抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7基因的重组真核表达载体pPIC 9 K-ScFv A 7经SalⅠ酶切线性化后,利用电转化方法转化受体毕赤酵母菌GS 115,以甲醇诱导蛋白表达,应用鼠抗c-myc单克隆抗体进行斑点杂交试验,检查所表达的单链抗体A 7蛋白.[结果]在酵母菌的培养上清液中发现单链抗体A 7蛋白的表达,而阴性对照菌中未见表达产物.[结论]抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7蛋白已成功地在真核表达系统中表达.     

单链抗体A7基因的原核细胞表达

[目的]制备抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7基因,为基因治疗重症肌无力奠定基础.[方法]构建含有抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7基因的重组原核表达载体pHEN 2-单链抗体A 7,将其转化至大肠杆菌HB 2151中,以异丙基--βD-硫代半乳糖苷(IPTG)为诱导剂,在外周质中进行表达,以硼酸钠裂解细菌细胞壁,制备含有单链抗体的裂解液,应用鼠抗c-myc单克隆抗体的斑点杂交试验检测表达的单链抗体A 7基因.[结果]在大肠杆菌的外周质中可见单链抗体A 7基因表达,培养上清液中未见单链抗体A 7基因表达.[结论]抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7基因在原核细胞成功表达.     

抗人乙酰胆碱受体单链抗体融合人血清白蛋白基因的构建

[目的]提高抗人乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体(ScFv)的稳定性，构建单链抗体-人血清白蛋白(HSA)融合基因。[方法]应用聚合酶链反应扩增人血清白蛋白基因，并克隆到含有抗人乙酰胆碱受体单链抗体(ScFv637)的载体pHEN2(pHEN2-ScFv637)上。将重组质粒pHEN2-ScFv637-HSA转化至大肠杆菌(E．coli DH5a)中，分离提纯重组质粒后再经酶切、琼脂糖凝胶电泳检查以确认融合基因的正确性。[结果]电泳检查发现了大小分别为1770bp和7054bp的人血清白蛋白基因和融合基因。且发现位置正确。[结论]成功地构建了单链抗体scFv637与人血清白蛋白融合基因。     

单链抗体骨架1区在与抗原结合中的作用

[目的 ]探讨单链抗体可变区骨架 1区对抗体特异性的影响 .[方法 ]应用分子克隆技术 ,以分离自重症肌无力患者胸腺的抗原结合片段Fab 6 37为亲本 ,构建了完整序列的单链抗体ScFv 6 37以及在重链和轻链可变区骨架 1区N端各缺失 8个氨基酸的单链抗体ScFv6 37Δ8aa ,在大肠杆菌表达后 ,应用放射免疫测定法检查单链抗体与抗原 人乙酰胆碱受体的结合活性 .[结果 ]单链抗体ScFv 6 37Δ8aa不能与人乙酰胆碱受体结合 ,然而在同一试验中 ,单链抗体ScFv 6 37能高亲合性地与人乙酰胆碱受体结合 .[结论 ]单链抗体骨架 1区的结构可影响抗体与抗原表位的结合特异性 .     

抗鼻咽癌单克隆抗体BAC5单链抗体原核表达载体的构建和表达

[目的]构建抗鼻咽癌单克隆抗体BAC5单链抗体的原核表达载体并观察其表达,为开展抗鼻咽癌单链抗体的进一步研究奠定基础.[方法]应用RT-PCR技术,扩增出鼻咽癌单克隆抗体BAC5的轻链、重链可变区基因,通过一段编码肽的序列进行连接,构建BAC5单链抗体表达载体pET22b-scFv,导人BL21(DE3)表达菌,并进行诱导表达.SDS-PAGE凝胶电泳鉴定融合蛋白的表达.[结果]克隆基因序列符合小鼠轻、重链可变区基因特征;pET22b-scFv表达质粒拼接正确;表达产物以包涵体形式为主.[结论]成功构建了能表达BAC5单链抗体的原核表达载体.     

乙酰胆碱受体单克隆抗体A49的序列分析

[ 目的 ]探讨重症肌无力自身抗体分子结构及其在发病机理中的作用 .[方法 ]利用聚合酶链反应从分泌乙酰胆碱受体单克隆抗体A49的杂交瘤细胞株扩增抗体的可变区基因 ,经转化受体菌大肠杆菌DH 5α克隆后 ,进行核苷酸序列分析 .[结果 ]A49的重链可变区基因由小鼠VHNP族基因编码 ,轻链可变区基因由小鼠Vk2组基因编码 ,与致病性乙酰胆碱受体抗体可变区核苷酸序列比较 ,其同源性均在 70 %以下 .[结论 ]A49分子结构与致病性乙酰胆碱受体抗体不同 ,A49诱导大鼠实验性自身免疫性重症肌无力的测定将有助于揭示抗体分子结构与致病性的关系     

抗人免疫缺陷病毒I型(HIV-1)外膜蛋白gp120单链抗体基因的构建及测序鉴定

目的　构建抗HIV 1gp120单链抗体基因,为进一步用于HIV 1感染的诊断和治疗奠定基础。方法　利用 RT PCR法,从抗HIV 1gp120单克隆抗体杂交瘤细胞扩增得到抗体轻链和重链的可变区基因,经重叠延伸反应, 在体外随机合成单链抗体基因(ScFv),并克隆到pGEM Easy T载体中,经测序及Blast同源性分析。结果　该 ScFV基因全长为666bp,为VH Linker VL结构,VH基因为396bp,编码132个氨基酸;Linker为(Gly4Ser)3短 肽;VL基因为270bp,编码90个氨基酸。VH基因与小鼠IgG2a重链可变区的同源性达95%,VL基因与小鼠免 疫球蛋白κ轻链可变区的同源性达98%。结论　成功构建了抗HIV 1gp120单链抗体基因。     

抗人免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-1）外膜蛋白gp120单链抗体基因的构建及测序鉴定

目的 构建抗HIV-1gp120单链抗体基因，为进一步用于HIV-1感染的诊断和治疗奠定基础。方法 利用RT-PCR法，从抗HIV-1gp120单克隆抗体杂交瘤细胞扩增得到抗体轻链和重链的可变区基因，经重叠延伸反应，在体外随机合成单链抗体基因(ScFv)，并克隆到pGEM-Easy-T载体中，经测序及Blast同源性分析。结果 该ScFV基因全长为666bp．为VH-Linker-VL结构，VH基因为396bp，编码132个氨基酸；Linker为(Gly4Ser)3短肽；VL基因为270bp，编码90个氨基酸。VH基因与小鼠IgG2a重链可变区的同源性达95％，VL基因与小鼠免疫球蛋白κ轻链可变区的同源性达98％。结论 成功构建了抗HIV-1gp120单链抗体基因。     

抗乙酰胆碱受体单链抗体在大肠杆菌中的表达

[目的 ]使构建的抗人乙酰胆碱受体单链抗体基因在大肠杆菌中表达 .[方法 ]将含有单链抗体基因的载体 pHEN2 (含有 pelB引导肽和c myc)转化大肠杆菌HB 2 15 1,在细菌外周质中表达单链抗体 .应用鼠抗c myc单链抗体的斑点杂交试验检查细菌外周质裂解物中单链抗体的表达 .[结果 ]单链抗体表达在细菌外周质中 ,培养液上清及对照大肠杆菌外周质和培养液上清均未发现单链抗体 .[结论 ]已成功地在大肠杆菌中表达了抗人乙酰胆碱受体单链抗体 .     

利用噬菌体表面展示技术克隆抗人DR5抗体可变区基因

目的:利用噬菌体表面展示技术制备抗人DR5单链抗体.方法:从抗DR5杂交瘤细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增VH和VL基因,并利用重叠扩增PCR将VH和VL拼接为scFv基因.将scFv与PAK100载体通过相同的酶切位点连接后,转化大肠杆菌XL1-Blue,经VSCM13辅助噬菌体拯救,构建成鼠抗人DR5单链抗体库...     

用于大容量人源天然噬菌体抗体库的表达载体的构建及鉴定

目的构建一个应用于大容量Fab段天然噬菌体抗体库的表达载体。方法用定点突变技术将表面呈现噬菌粒载体pDF上的BssHⅡ酶切位点改为BglⅡ酶切位点,然后分别在抗体轻链和重链位置插入自杀基因SacB,构建含自杀基因的噬菌粒载体pDF-D-SacB;利用抗乙肝表面抗原抗体的基因为模板,PCR扩增重链和轻链基因片段。将PCR扩增的轻链基因和重链基因分别插入载体pDF-D-SacB内,利用电转化的方法将其转入Trans1-Blue大肠杆菌,构建2个初级质粒,再利用初级质粒超感染BSl365菌,使其轻链与重链发生重组,获得重组质粒,进一步获得抗乙肝表面抗原抗体的噬菌体。之后利用该噬菌体感染大肠杆菌Trans1-Blue进行扩增,得到大量抗乙肝表面抗原的噬菌体抗体。最后,通过酶联免疫吸附剂测定检测所获得的抗体。结果通过向pDF重轻链区域插入SacB基因,改造抗体基因克隆位点,构建了pDF-D-SacB载体;经检测,pDF-D-SacB可以表达具有功能的Fab噬菌体抗体,可以在分泌Cre蛋白酶的细菌胞内发生预期的Cre-Loxp介导的定点重组。结论所获得的含自杀基因的噬菌粒载体pDF-D-SacB适用于构建大容量噬菌体抗体库。     

乙酰胆碱受体α1亚基真核表达载体的构建

目的：构建含人乙酰胆碱受体（AChR）α1亚基N末端主要免疫区205个氨基酸（AChRα205）编码基因的真核表达载体。方法：以pMARα205为模板PCR扩增AChRα205。酶切后将PCR产物插入到载体pcDNA3.1（＋）的EcoRⅠ、XhoⅠ位点之间,重组子经转化E.coliDH5α菌、筛选、酶切并测序进行鉴定。结果：用PCR方法从pMARα205中扩增出了约644bp的片段,构建的重组质粒经双酶切可得到约633bp的片段,大小与预期结果相符,测序表明序列正确。结论：用基因重组方法获得了含正确目的基因序列的重组质粒pcDNA3.1（＋）/AChRα205。     

乙酰胆碱受体单克隆抗体重链可变区PCR产物克隆的条件

聚合酶链反应扩增的乙酰胆碱受体单克隆抗体重链可变区基因经ＥｃｏＲ１和ＢａｍＨ１双酶切割后，与载体质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ连接，并经转化大肠杆菌ＤＨ５α而扩增，扩增后的重组质粒经酶切证实含有乙酰胆碱受体抗体的基因。为核苷酸序列分析准备了材料。     

鼠抗脂多糖单链噬菌体抗体库的构建

目的　构建一个鼠源性的抗脂多糖 (Lipopolysaccharide ,LPS)单链噬菌体抗体库 ,以供进一步生物医学应用。方法　用纯LPS免疫BALB/c小鼠 4个星期后 ,从脾细胞中提取总RNA ,用RT PCR技术扩增出小鼠抗体重链、轻链可变区基因 (VH ,VL) ,然后用Linker将VH ,VL交联形成单链抗体可变区片段 (ScFv)。经NotI、SfiI双酶切后与经同样双酶切的pCANTAB5E噬菌粒载体相连 ,转化入感受态大肠杆菌TG1,构建鼠抗LPS单链噬菌体抗体库 ,并随机抽取转化后的 4个大肠杆菌TG1菌落 ,以检测外源DNA的转入情况。结果　ELISA法检测小鼠血清中抗LPS的效价为 1∶12 80 0。提取的总RNA浓度为 12 .3 813 μg/ml ,纯度较好。扩增出的VH长约 3 4 0bp ,VL长约 3 2 0bp ,ScFv长约 80 0bp。转化入TG1后有约 1.9× 10 7个菌落 ,抽提 4个菌落后经SfiⅠ、NotⅠ双酶切的结果显示有 1个菌落的质粒转化进了外源DNA片段。结论　成功地构建出了一个有效库容量为 4.75× 10 6的鼠抗LPS单链噬菌体抗体库。