大鼠骨髓间充质干细胞体外可诱导分化为角膜上皮细胞

目的:探讨骨髓间充质干细胞 (mesenchymal stem cell,MSC) 分化为角膜上皮细胞的可塑性及其重建角膜上皮的可能性.方法:用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓MSC,经体外与角膜基质细胞共培养诱导分化,免疫荧光法检测角膜上皮细胞特异标志物K12的表达.结果:体外培养的大鼠骨髓MSC表现出很强的增殖潜能,原代培养的骨髓MSC CD29免疫荧光染色阳性,CD34和CD45为阴性,符合骨髓MSC的特征.MSC与角膜基质细胞共培养1wk后大部分细胞分化为间质细胞,少部分细胞形态上相对偏小,免疫荧光检测这部分细胞表达角膜上皮细胞特异性标志角蛋白K12.结论:体外培养的MSC在角膜基质细胞的诱导下可横向分化为角膜上皮细胞.     

经角膜基质细胞诱导的大鼠骨髓间充质干细胞在人羊膜上构建角膜上皮移植片

目的:研究将骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)诱导分化后在羊膜表面培养构建角膜上皮移植片的可行性。方法:取SD大鼠骨髓间充质干细胞和角膜基质细胞,分别培养并传2代后进行共培养,取共培养7d后的MSC覆载于新鲜人羊膜,再培养7d。对MSC及诱导后MSC进行免疫荧光染色和扫描电镜检查;对覆载细胞的羊膜进行HE染色及免疫荧光染色。结果:MSC在体外培养条件下贴壁生长,免疫荧光染色CD29和CD44阳性,CK12阴性。经角膜基质细胞诱导分化后,MSC细胞CK12染色转为阳性。诱导后MSC接种到羊膜表面,迅速贴壁生长,组织学特性无明显改变,CK12染色仍为阳性。结论:经角膜基质细胞诱导的MSC表现出角膜上皮细胞特征,在羊膜上生长后保持不变。     

人角膜上皮干细胞的识别

目的 探讨人角膜上皮干细胞的分子标记。方法 对人角膜和角膜缘部位行组织学检查以分析角膜缘解剖结构。对人角膜切片和整个角膜组织行免疫组织化学染色以检测中央角膜和角膜缘部位未分化标记,如核蛋白p63、乳腺癌抵抗蛋白（ABCG2,BCRP1）、烯醇化酶α、整合素拍、胡及β1、表皮生长因子受体（EGFR）、细胞角蛋白19（CK19）、14（CK14）及转铁蛋白受体（CDT1）的表达,经荧光显微镜和激光扫描共焦显微镜观察。对角膜中部和角膜缘上皮细胞的mRNA进行半定量逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）和原位杂交以检测其相关基因的表达。结果 角膜缘部位横向切片显示角膜缘上皮细胞为乳头放射状排列,对应于Vogt栅栏环境。未分化标记整合素β1、EGFR、烯醇化酶α及CK19在角膜缘基底细胞胞质染色较表层细胞更强;p63、ABCG2、整合素胡蛋白仅见于角膜缘基底部上皮细胞。激光扫描共焦显微镜观察和RT—PCR结果显示角膜缘表达p63、ABCG2、整合素胡蛋白及mRNA。原位杂交显示p63仅表达于角膜缘基底层细胞。结论 角膜缘上皮呈乳头放射状排列,角膜缘干细胞群具有复合标记：p63表达于细胞核、ABCG2表达于胞质、整合素胡表达于胞膜。采用这些标记复合体,可将角膜缘干细胞群与其他上皮细胞区分。     

人角膜及角膜缘上皮细胞分化标记的检测

目的检测分化标记在人角膜及角膜缘上皮细胞的表达,以了解角膜及角膜缘细胞分化状态,旨在发现新的角膜上皮干细胞的阴性标记。方法获取人角膜及角膜缘组织,对冰冻切片及整个角膜组织行免疫荧光染色检测分化标记钙粘连素E、角蛋白3(CK3)、角蛋白12(CK12)、缝隙连接蛋白43、巢蛋白(nestin)和包壳蛋白(involucrin)的表达,经荧光显微镜及激光扫描共焦电镜观察,并行半定量RT-PCR以检测其相关分化标记基因的表达。结果分化标记CK3、CK12、缝隙连接蛋白43、巢蛋白和包壳蛋白在角膜和角膜缘上皮的表层细胞表达,角膜缘基底细胞不表达。激光扫描共焦电镜观察及RT-PCR结果显示角膜缘基底上皮细胞不表达细胞CK3、连接蛋白43和巢蛋白,而角膜上皮细胞则明显表达。结论角膜及角膜缘表层上皮较为成熟分化,而角膜缘基底细胞具有未分化细胞的特征,很可能是干细胞的部位。     

人间充质干细胞横向诱导分化为角膜上皮细胞及角膜缘干细胞的体外研究

目的 探讨人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在体外向角膜上皮细胞及角膜缘干细胞横向分化的可能性.方法 从成人骨髓中分离培养出具有MSCs特性的细胞,经过5次传代培养纯化后使用以下5种培养基对MSCs进行诱导分化:1组:DMEM/F12、体积分数10?S;2组:DMEM/F12、体积分数10?S、5 μg·L-1 表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF);3组:DMEM/F12、体积分数10?S、10 μg·L-1 EGF;4组:DMEM/F12、体积分数10?S、15 μg·L-1 EGF;5组:DMEM/F12、体积分数10?S、体积分数50%条件培养基、10 μg·L-1 EGF.其中第1组为对照组,使用的培养基为培养MSCs的培养基.各组细胞培养30 d后,取出细胞爬片进行AE1、AE5和P63的免疫组化染色.结果 从成人骨髓中分离培养出的细胞绝大部分具有MSCs的特性.各诱导分化组的细胞经过AE1染色后计算的细胞诱导转化率分别为:0、(5.28±0.90)%、(15.65±1.65)%、(27.35±2.36)%、(15.53±1.61)%,第2、3、4组着色细胞的数量和着色深度递增,第5诱导分化组的染色情况和第3组相近,对照组染色为阴性.各组AE5染色均为均匀淡染.各组P63染色均为阴性.结论 5～15 μg·L-1 EGF能诱导MSCs横向分化为角膜上皮细胞,而且在此浓度范围内EGF的诱导作用随浓度升高逐渐增强.用成人角膜缘干细胞的培养液制成的体积分数50%条件培养基对诱导MSCs横向分化为角膜上皮细胞无明显促进作用,本实验方法不能将MSCs诱导分化为角膜缘干细胞.     

人骨髓间充质干细胞分化为上皮样细胞的初步研究

目的 应用猪板层角膜做载体将人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hMSC)跨胚层诱导为上皮样细胞,甚至角膜上皮样细胞,初步探讨hMSC作为构建组织工程角膜种子细胞的可行性.方法 实验研究.用密度梯度离心培养技术结合贴壁培养法分离纯化hMSC并传代,对体外培养的hMSC进行免疫表型鉴定.将传代后的hMSC接种于去上皮的猪角膜基质片前弹力层表面培养诱导分化,免疫荧光检测角膜上皮细胞标志物角蛋白12(CK12)以及角膜缘干细胞标记物ABCG2和CK19的表达.运用体外培养的方法使种植在前弹力层表面的细胞复层化.待细胞融合形成单层后,置入插入式培养皿中进行气液界面培养.培养4周后进行HE染色及免疫组织化学检测,光镜下观察其复层情况.结果 获得的hMSC可以在体外培养扩增,表现出很强的增殖潜能.流式细胞仪示:培养的hMSC CD45阳性率为0.06%,CD34为0.41%,CD44为86.43%,CD29为85.72%,CD105为90.72%.诱导4周后部分细胞表达CK12和CK19,不表达ABCG2.运用气液界面培养法进行体外复层的结果显示可以形成1～2层的上皮样细胞,并很可能为角膜上皮样细胞.结论 在本实验的诱导条件下,hMSC可以分化为上皮样细胞,并很可能为角膜上皮样细胞,hMSC有可能作为组织工程技术角膜上皮重建的种子细胞的选择.     

干细胞与角膜眼表重建研究进展

角膜是眼表的重要防护屏障和光学系统的重要组成部分,其完整性和透明性是实现有效视功能的重要前提。各种原因造成的眼表疾病未经及时有效治疗都有可能发展到终末阶段———角膜缘干细胞功能障碍,包括角膜缘干细胞数目的减少和微环境的病理改变。自体角膜移植无疑是治疗角膜缘干细胞功能障碍最有效的方法。但是供体角膜来源十分有限,且切除健眼组织行角膜移植可能会对健眼造成长期损害。随着干细胞研究的不断深入和组织工程技术的兴起,组织工程角膜应运而生,并且迅速发展。其基本原理为选用生物性能良好的支架材料,体外模拟角膜缘干细胞微环境,诱导各类种子干细胞分化为角膜类上皮,然后再行角膜眼表重建。常用种子细胞包括角膜缘干细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞、骨髓间充质干细胞、皮肤干细胞、口腔黏膜干细胞。本文就上述干细胞在角膜眼表重建中的应用作一综述。     

角膜缘干细胞基础研究和临床应用进展

随着角膜缘干细胞研究的深入,对由角膜缘部受损、功能不良或角膜缘微环境异常等造成的角膜病变有了更深的认识.本文就角膜缘干细胞的基础研究进展(尤其是标志物及微环境方面)及角膜缘干细胞缺损治疗方法(自体、异体角膜缘干细胞移植,培养的角膜缘干细胞和口腔黏膜上皮细胞植片移植等)的临床效果和存在问题进行综述.     

角膜基质诱导胚胎干细胞定向分化的初步实验研究

目的:探索角膜基质接触诱导胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES.细胞)定向分化的可能性。方法:分别在去上皮的新西兰白兔表层角膜缘基质上、晶状体上皮细胞饲养层上培养ES-D_3细胞,裸鼠皮下移植使其形成复层细胞,一段时间后,行扫描电镜和光镜观察。结果:I.ES细胞在新鲜表层角膜缘基质上增殖缓慢,2～3周形成较大细胞集落,光镜下细胞形态单一,体积较正常ES细胞大,电镜下细胞核已演变为细长形,移植到裸鼠皮下2周形成上皮样细胞复层,电镜下可见微绒毛,而角膜基质非上皮面的ES细胞仍保持其小细胞状态不变。2.晶状体上皮细胞与ES细胞共培养只能延缓其分化时间,不能诱导其定向分化。结论:表层角膜缘基质具有诱导ES细胞定向分化的潜能,体外培养条件下可能不发生晶状体诱导的第三级胚胎诱导。眼科学报1999;15:195-198。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞向角膜上皮细胞分化的初步研究

目的 探讨在体外损伤微环境下,人骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为角膜上皮细胞的可行性. 方法体外分离培养人MSCs和人角膜缘干细胞(LSCs),检测细胞CD34、CD44、细胞角蛋白3(CK3)、细胞角蛋白19(CK19)的表达情况.制作人LSCs热损伤模型,加入增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)标记的人MSCs共同培养,2周后检测细胞CK19的表达情况.结果 人MSCs CD44表达阳性、CD34表达阴性,流式细胞术显示CD44阳性率为92.59%,CD34阳性率为0.01%;人LSCs CK19表达阳性,CK3表达阴性.共同培养后部分人MSCs CK19表达阳性,并有多核细胞现象.结论 在损伤微环境下,人MSCs可以转化为类角膜上皮细胞的细胞,在此过程中存在细胞融合现象.     

Induced pluripotent stem cells as a potential therapeutic source for corneal epithelial stem cells

Corneal blindness caused by limbal stem cell deficiency (LSCD) is one of the most common debilitating eye disorders. Thus far, the most effective treatment for LSCD is corneal transplantation, which is often hindered by the shortage of donors. Pluripotent stem cell technology including embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) have opened new avenues for treating this disease. iPSCs-derived corneal epithelial cells provide an autologous and unlimited source of cells for the treatment of LSCD. On the other hand, iPSCs of LSCD patients can be used for iPSCs-corneal disease model and new drug discovery. However, prior to clinical trial, the efficacy and safety of these cells in patients with LSCD should be proved. Here we focused on the current status of iPSCs-derived corneal epithelial cells used for cell therapy as well as for corneal disease modeling. The challenges and potential of iPSCs-derived corneal epithelial cells as a choice for clinical treatment in corneal disease were also discussed.     

干细胞诱导分化为视网膜色素上皮细胞的途径探讨

近年来,干细胞在眼科领域的研究及应用受到高度关注,胚胎干细胞(ES)、成体干细胞能够被定向诱导分化成视网膜色素上皮细胞,由此可获得转分化的大量的视网膜色素上皮细胞源,通过体内干细胞及视网膜色素上皮细胞移植有望应用于各种视网膜退行性疾病的细胞替代治疗。本文就各种干细胞诱导分化为视网膜色素上皮细胞的途径及应用进行探讨。     

Differentiation of retinal ganglion cells from induced pluripotent stem cells: a review

Glaucoma is a common optic neuropathy that is characterized by the progressive degeneration of axons and the loss of retinal ganglion cells (RGCs). Glaucoma is one of the leading causes of irreversible blindness worldwide. Current glaucoma treatments only slow the progression of RGCs loss. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are capable of differentiating into all three germ layer cell lineages. iPSCs can be patient-specific, making iPSC-derived RGCs a promising candidate for cell replacement. In this review, we focus on discussing the detailed approaches used to differentiate iPSCs into RGCs.     

从胚胎干细胞诱导视网膜细胞的分子生物学

近年来诱导人多能干细胞的研究激发了人们对再生医学和组织工程的极大热情,干细胞在眼科疾病治疗中的可能应用也得到了更多的重视。在这里我们着重讨论视网膜发育中的细胞分子生物学过程,以及从胚胎干细胞诱导分化的一些考虑,以期对进一步的研究工作及实现其临床应用有所帮助。     

Research on induced pluripotent stem cells and the application in ocular tissues

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) were firstly induced from mouse fibroblasts since 2006, and then the research on iPSCs had made great progress in the following years. iPSCs were established from different somatic cells through DNA, RNA, protein or small molecule pathways and transduction vehicles. With continuous improvement of technology on reprogramming, the induction of iPSCs became more secure and effective, and showed enormous promise for clinical applications. We reviewed different reprogramming of somatic cells, four kinds of pathways of reprogramming and three types of transduction vehicles, and discuss the research of iPSCs in ophthalmology and the prospect of iPSCs applications.     

脂肪干细胞在眼科的应用及研究进展

脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)是存在于脂肪组织的间充质干细胞,具有多向分化潜能,在特定的条件下可以分化为脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞等中胚层细胞,甚至可以跨胚层分化为神经细胞等外胚层细胞及肝细胞等内胚层细胞。ADSCs还有易于获取、对取材区损伤小等众多优势,使其成为组织修复等领域的热点之一。本文对ADSCs的生物学特性及其在眼科领域的研究进行了分类总结,以期为ADSCs在眼科的应用研究给予有益的提示。     

诱导多功能干细胞在视网膜再生医学中的应用

诱导多功能干细胞（induced pluripotent stem cell,iPSC）是由4个转录因子与成体细胞基因组进行重组诱导出的一种全能分化型干细胞.多种疾病会导致视网膜的结构或功能受损,可利用iPSC的增生分化能力使视网膜再生.在视网膜再生医学领域,iPSC的研究热点集中在：供体细胞、转录因子及转录载体的选择、诱导分化机制的研究、iPSC向视网膜不同类型细胞分化的诱导途径以及诱导出的视网膜色素上皮细胞和光感受器细胞的移植方法.但在目前关于iPSC的研究中仍存在定向诱导分化效率较低、眼内移植后存活率低、临床应用安全性难保障等一系列问题.唯有解决上述问题,iPSC研究才能在视网膜再生医学领域发挥更大的作用.     

诱导多能干细胞向神经视网膜细胞定向分化的研究进展

视网膜退行性病变是造成视觉损害乃至失明的重要原因,由于成年视网膜组织无法自我更新病变中丢失的细胞,导致视网膜退行性病变具有不可逆性。诱导多能干细胞具有自我更新和多向分化的巨大潜力,是建立疾病模型、研究细胞替代疗法的理想供体。本文重点论述诱导多能干细胞的获取及其向神经视网膜细胞定向分化方面的研究进展,为视网膜退行性病变的实验室研究和临床诊治提供一定参考。     

诱导多能干细胞在眼科疾病的研究进展

可诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSC)是由体细胞或成体细胞重编程转化而来,这项技术引起了学术界空前的关注,越来越多的相关研究随之开展。它是通过人工方法将适当的外源性转录因子导入体细胞或成体干细胞,使之转化为具有无限增殖潜能和定向分化能力、类似于胚胎干细胞的一类干细胞。在不断探索发展多能干细胞培养转化技术的过程中,已经取得不少突破性的进展,这为将来细胞移植成为临床治疗方法奠定了基础。同时各种研究成功诱导出类似人体细胞的干细胞,并在动物实验中得到乐观的结果。我们主要探讨iPSC在眼科疾病方面的研究进展。     

Ocular stem cells: a narrative review of current clinical trials

Stem cells are undifferentiated cells showcasing a remarkable capacity of self-replenishing and differentiating into mature cells. Their ability to proliferate connotes that a designated stem cell source is capable of generating an unrestricted number of mature cells. The ever-increasing comprehension of position, activity, and function of ocular stem cells has led to rapid progress and incessant improvement of possible procedures and therapies. A narrative review was conducted to summarize the current evidence on clinical trials and respective literature, regarding current evolution in the field of ocular regenerative medicine. We tried to ascertain the safety of experimental and clinical procedures, their effectiveness, and the ethical repercussion of their use.