Parkin介导的线粒体自噬在高糖高脂导致的心肌细胞损伤中的保护作用

目的 明确Parkin（一种E3泛素化连接酶）介导的线粒体自噬对高糖高脂导致的原代心肌细胞损伤的保护作用。 方法 以LV-lacZ（LacZ空病毒）或LV-Parkin（Parkin过表达慢病毒）转染SD大鼠原代心肌细胞48 h,再用含葡萄糖（5.5 mmol/L NG）的培养基或含棕榈酸盐（500 μmol/L HF）和葡萄糖（25 mmol/L HG）的高糖高脂培养基培养心肌细胞24 h。 实验分组:①阴性对照组（NG-LacZ）,②正常Parkin过表达组（NG-Parkin）,③高糖高脂阴性对照组（HG-HF-LacZ）,④高糖高脂Parkin过表达组（HG-HF-Parkin）。用Western blot法检测PTEN介导的假定激酶蛋白1（PINK1）、Parkin、P62（一种自噬相关蛋白）、微管相关蛋白1轻链3（LC3）蛋白表达水平。采用JC-1染色法检测活细胞内线粒体膜电位水平。免疫荧光法检测自噬体数量,TUNEL法检测细胞凋亡率。 结果 与对照组相比,高糖高脂处理的原代心肌细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅱ,P62表达水平上调（P<0.05）,PINK1表达未发生统计学差异,Parkin表达水平下调（P<0.05）,自噬体数量增多,线粒体膜电位下降功能损伤,心肌细胞凋亡率升高（P<0.05）。而用高糖高脂处理LV-Parkin转染的心肌细胞,LC3-Ⅱ蛋白表达水平进一步升高（P<0.05）,而P62表达水平显著下降（P<0.05）,自噬体数量进一步增多,细胞内线粒体膜电位水平上升,心肌细胞凋亡率下降（P<0.05）。 结论 高糖高脂可引起SD大鼠原代心肌细胞自噬流量降低,自噬小体增多,线粒体自噬发生障碍。Parkin过表达慢病毒通过激活心肌细胞内线粒体自噬途径,提高自噬流量,改善线粒体功能,降低心肌细胞凋亡率。     

联合应用自噬抑制剂增加雷帕霉素引起的肺癌细胞凋亡

目的探讨自噬抑制剂对雷帕霉素引起的肺癌细胞凋亡的影响。方法选用人肺癌A549细胞,MTT方法检测单独利用雷帕霉素(Rapamycin)或者联合自噬抑制剂3-MA对A549细胞存活率的影响,Western印迹检测单独利用雷帕霉素(Rapamycin)或者联合自噬抑制剂3-MA凋亡相关蛋白Caspase-3和PARP,以及线粒体相关蛋白细胞色素C表达水平的影响。结果 MTT结果显示,Rapamycin可以明显地引起A549细胞存活率的下降,并呈现出剂量依赖性。Western印迹结果显示,Rapamycin可以引起凋亡相关蛋白酶切的PARP、酶切的Caspase-3以及线粒体凋亡相关蛋白细胞色素C(cytochrome c)表达水平明显的上升。MTT结果显示,联合应用自噬抑制可以明显的增加Rapamycin引起的细胞存活率的下降。Western印迹显示,与单独给予Rapamycin相比较,联合应用自噬抑制剂3-MA,凋亡相关蛋白酶切的PARP、酶切的Caspase-3进一步增加。结论自噬抑制剂3-MA可提高人肺癌A549细胞对m TOR抑制剂Rapamycin的敏感性。     

高糖对心肌细胞损害调节新机制:烟酰胺核糖通过Sirt3- p53/PGC-1α改善线粒体自噬及线粒体合成

目的 明确烟酰胺核糖（nicotinamide riboside,NR）对成年小鼠心肌细胞在高糖条件下线粒体自噬及线粒体合成的影响及潜在机制。方法 分离成年小鼠心肌细胞后,将细胞分为:①对照组;②高糖组;③高糖+NR组;④高糖+NR+Sirt3siRNA;⑤高糖+NR+过氧化物酶体增生物活化受体γ共激活剂(Peroxisome proliferator-activated receptor γ co-activator,PGC)-1α siRNA组;⑥高糖+NR+nutlin-3组。采用TUNEL法,流式细胞术检测凋亡指数(AI),JC-1染色检测线粒体膜电位,Western blot法检测自噬相关蛋白Atg5、LC3,p62等蛋白表达水平,线粒体自噬相关蛋白Parkin,线粒体合成相关蛋白PGC-1α,Tfam蛋白表达水平,Sirt3。结果 与对照组相比,高糖干预后细胞AI增加（P<0.01）,线粒体膜电位降低（P<0.01）,PGC-1α、Tfam、Sirt3、Atg5、LC3和Parkin表达降低（P<0.01）、p62表达升高（P<0.01）。加入NR后,细胞凋亡减少（P<0.01）,线粒体膜电位增高（P<0.01）,PGC-1α、Tfam、Sirt3、Atg5、LC3和Parkin表达增高（P<0.01）、p62表达降低（P<0.01）,然而,加入Sirt3siRNA,NR的作用减弱（P<0.01）;加入PGC-1αsiRNA,NR作用减弱（P<0.01）,加入nutlin-3后,NR作用减弱（P<0.01）。结论 NR通过加入p53激动剂nutlin-3,改善线粒体自噬,NR通过提高PGC-1α表达水平改善线粒体合成,最终减轻高糖对成年小鼠心肌细胞的损伤。     

动力相关蛋白1通过诱导线粒体自噬对高糖导致心肌细胞损伤的影响

目的明确动力相关蛋白(Drp)1通过诱导线粒体自噬对高糖条件下心肌细胞起保护作用。方法以Lac Z空病毒(LV-Lac Z)或Drp1过表达腺病毒(LV-Drp1)转染大鼠原代心肌细胞24 h,再用含葡萄糖(5.5 mmol/L)的正常培养基(NG)或含葡萄糖(33 mmol/L)的高糖培养基(HG)处理大鼠心肌细胞72 h。实验分组:1:(1)阴性对照(NG+Lac Z)组;(2)正常Drp1过表达(NG+Drp1)组;(3)高糖阴性对照(HG+Lac Z)组;(4)高糖Drp1过表达(HG+Drp1)组。采用免疫荧光法检测自噬体数量,用JC-1染色法检测线粒体膜电位水平,采用Western blot法检测Drp1、Parkin(一种E3泛素化连接酶),微管相关蛋白1轻链3(LC3)、p62蛋白表达水平,TUNEL法检测细胞凋亡率。结果与对照组相比,高糖处理组自噬体数量明显减少(P0.05),线粒体膜电位显著下降(P0.05),线粒体自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Parkin水平下调(P0.05),Drp1,P62表达水平显著增高(P0.05),心肌细胞凋亡率升高(P0.05);与高糖组比较,Drp1过表达组可显著增加自噬体数量(P0.05),线粒体膜电位上升(P0.05),Drp1,Parkin,LC3-Ⅱ表达水平显著上升(P0.05),P62水平显著下降(P0.05),心肌细胞凋亡率下降(P0.05)。结论高糖可引起SD大鼠原代心肌细胞自噬水平降低和线粒体功能障碍,是糖尿病心肌病发病机制之一。Drp1通过提高线粒体自噬水平改善线粒体功能,降低高糖条件下心肌细胞凋亡率。     

腹主动脉瘤血管平滑肌细胞凋亡和自噬研究

目的探讨血管平滑肌细胞(SMC)凋亡和自噬与腹主动脉瘤(AAA)发病的关系。方法采用原位末端DNA标记(TUNEL)技术观察AAA和人正常主动脉组织中SMC凋亡的情况,并用免疫组织化学分析其中LC3的蛋白表达。提取AAA和正常主动脉组织RNA,采用RT-PCR方法检测其中与自噬相关的基因Beclin1、Atg4b、Bnip3、Vps34的表达。结果 AAA组织中凋亡的SMC明显高于正常主动脉组织(P0.05);LC3蛋白在AAA中的表达高于正常主动脉组织(P0.05);AAA中Beclin1、Atg4b、Bnip3、Vps34表达水平明显高于正常主动脉组织(P0.05)。结论 SMC凋亡和自噬在AAA的发病中起重要作用。     

18α-甘草酸二铵对丝裂霉素C诱导的HepG2细胞凋亡的影响及机制

目的探讨18α-甘草酸二铵对丝裂霉素（MMC）诱导的HepG2细胞凋亡的影响及机制。方法18Ⅸ一甘草酸二铵不同浓度与低剂量MMC（50p．g／m1）MMC联合作用,采用MTT比色法观察MMC对HepG2细胞活性率的影响;流式细胞术分析凋亡细胞的百分率、线粒体膜电位的改变及Caspase－3的活性变化;WesternBlot检测细胞内细胞色素c的表达及凋亡相关蛋白Bcl－2／Bax的表达情况。结果单独MMC（50gg／m1）处理的HepG2细胞活性率明显降低,凋亡率显著增加,线粒体膜电位下降,Caspase-3活性增加,细胞内细胞色素C表达增加,抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少,而促凋亡蛋白Bax表达增加。不同浓度的18α-甘草酸二铵与MMC合用组,这些指标的变化均受到抑制。结论18Ⅸ一甘草酸二铵可抑制MMC诱导的HepG2细胞凋亡,其机制可能通过调控凋亡相关蛋白的表达而实现。     

顺铂对人舌鳞状细胞癌细胞Tca8113细胞凋亡与自噬的影响

目的 探讨顺铂对人舌鳞状细胞癌细胞Tca8113细胞凋亡与自噬的影响.方法 体外培养人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞,给予不同浓度的顺铂(CDDP),通过MTT检测细胞增殖率;Western印迹检测CDDP对Tca8113细胞凋亡以及自噬相关蛋白表达水平的影响.结果 与对照组相比,CDDP可以明显降低Tca8113细胞增殖率(P＜0.05);Western印迹结果显示,CDDP可以明显增加凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3,Cleaved PARP以及Cytochrome C的表达水平;同时,自噬相关蛋白LC3,Beclin 1和p62表达水平也发生明显的自噬性改变.结论 CDDP可以明显抑制Tca8113细胞增殖,其增殖抑制作用可能来源于凋亡,同时CDDP可以诱导Tca8113细胞发生自噬.     

丙型肝炎病毒核心蛋白活化内源性大麻素系统诱导不完全线粒体自噬

目的研究丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白活化内源性大麻素系统诱导不完全线粒体自噬的机制。方法HepG2细胞或表达HCV核心蛋白的HepG2细胞与肝星状细胞(LX-2细胞)共培养。共培养后高效液相色谱-质谱联用技术检测2-AG水平,分光光度法测定检测线粒体呼吸链酶复合体活性,流式细胞仪检测细胞活性氧(ROS)水平,激光共聚焦显微镜检测Ca~(2+)浓度和线粒体膜电位,试剂盒检测线粒体丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)含量,蛋白质免疫检测大麻素受体1(CB1R)、蛋白激酶B(Akt)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)和p62蛋白表达。计量资料采用t检验。结果与LX-2细胞和HepG2细胞共培养组相比,LX-2细胞和表达HCV核心蛋白HepG2细胞共培养组,2-AG水平增加,线粒体呼吸链酶复合体活性下降,ROS水平和Ca~(2+)浓度升高,线粒体膜电位下降,MDA升高而SOD下降,CB1R水平升高,p-Akt和p-mTOR表达下降,LC3-Ⅱ表达增加,而p62蛋白表达无明显差异。结论 HCV核心蛋白增加2-AG水平,上调CB1R表达;增加线粒体ROS水平和Ca~(2+)浓度,降低线粒体膜电位;下调Akt和mTOR活性引起不完全线粒体自噬。     

秦皮乙素对人肝癌HepG2细胞体外增殖的影响及机制探讨

目的探讨秦皮乙素对人肝癌HepG2细胞体外增殖的影响并初步探讨其作用机制。方法采用不同浓度的秦皮乙素干预人肝癌HepG2细胞。采用MTT比色法观察细胞增殖率;流式细胞仪分析细胞凋亡及线粒体膜电位;分光光度法检测细胞Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9活性;免疫荧光法检测Bax、Bcl-2、Caspase 9蛋白表达。结果秦皮乙素干预后人肝癌细胞HepG2增殖抑制,凋亡增加;线粒体膜电位降低,Caspase 3、Caspase 9活性增强,均呈剂量依赖性;Caspase 8活性无明显变化。Bax蛋白表达上调的同时Bcl-2蛋白表达下调,亦呈剂量依赖性。结论秦皮乙素可抑制人肝癌HepG2细胞体外增殖;作用机制可能为通过线粒体途径诱导细胞凋亡。     

棕榈酸对肝癌HepG2细胞自噬和凋亡的影响

目的探讨棕榈酸对肝癌HepG2细胞自噬和凋亡的影响。方法采用含浓度为800txmol／L棕榈酸的DMEM高糖培养基培养肝癌HepG2细胞24h,向HepG2细胞转染绿色荧光蛋白（GFP）-LC3质粒,通过观察LC3II绿色荧光斑点确定自噬发生情况。利用BafAl抑制自噬后,采用M30免疫荧光检测细胞凋亡情况。结果棕榈酸刺激24h明显增加自噬及凋亡细胞数量。阻断自噬,棕榈酸刺激引起的HepG2细胞凋亡水平明显增加。结论棕榈酸可刺激自噬发生,该自噬对肝癌HepG2细胞有一定的保护作用。     

人颗粒溶素对肝癌细胞SMMC-7721凋亡、线粒体跨膜电位及细胞色素C释放的影响

目的 构建携带人颗粒溶素(GLS)的真核表达质粒pBudCE4.1/GLS并研究其表达后对肝癌细胞SMMC-7721凋亡、线粒体跨膜电位与细胞色素C转位的影响. 方法 将RT PCR扩增出的人GLS编码基因克隆入pBudCE4.1载体中构建真核表达质粒pBudCE4.1/GLS并将其转染肝癌细胞株SMMC-7721,用RT-PCR、免疫细胞化学检测GLS的表达;用Hoechst法及电镜检测细胞的凋亡状况;用荧光染料MitocaptureTM检测线粒体跨膜电位,用Western blot法检测细胞色素C从线粒体的释放. 结果 成功构建了携带GLS的真核表达质粒pBudCE4.1/GLS,在转染的肝癌细胞株SMMC-7721中,从转录和翻译水半都检测到了目标基因GLS的表达产物;重组质粒转染SMMC-7721细胞后,细胞核染色质固缩,旱致密浓染的凋亡状态,线粒体膜跨电位下降并伴随有细胞色素C从线粒体至细胞质的释放. 结论携带人GLS的真核表达质粒在肝癌细胞SMMC-7721中表达后有致细胞凋亡作用,引起线粒体跨膜电位下降与细胞色素C的释放可能是其诱导肿瘤细胞凋亡的途径之一.     

抑制自噬可以增加mTOR抑制剂AZD8055引起的喉癌细胞株Hep-2的凋亡

目的探讨抑制自噬是否可以增加哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)抑制剂(AZD8055)引起的喉癌细胞株Hep-2的凋亡。方法选用人喉癌细胞株Hep-2细胞系,应用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)检测m TOR抑制剂AZD8055和(或)自噬抑制剂3-甲基嘌呤(3-MA)对Hep-2细胞活性的影响。Western印迹检测AZD8055和(或)3-MA对Hep-2细胞凋亡通路相关蛋白〔Cleaved多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)、Cleaved Caspase-3、细胞色素C〕的作用。结果 AZD8055作用Hep-2细胞24 h后,细胞生存率显著下降,具有浓度依赖性。AZD8055浓度依赖性地增加Hep-2细胞凋亡相关蛋白Cleaved PARP、Cleaved Caspase-3及细胞色素C表达。当3-MA与AZD8055联用时,二者联用与单用AZD8055组相比,细胞活性显著降低,显著下调凋亡通路相关蛋白Cleaved PARP、Cleaved Caspase-3、细胞色素C表达。结论抑制自噬可以增加m TOR抑制剂AZD8055引起的喉癌细胞株Hep-2的凋亡。     

腺苷酸激活蛋白激酶对缺氧H9c2心肌细胞线粒体自噬及细胞凋亡的影响

目的 探讨腺苷酸激活蛋白激酶[adenosine 5’-monophosphate(AMP)-activated protein kinase,AMPK]对缺氧H9c2心肌细胞线粒体自噬及细胞凋亡的影响及可能机制。方法 实验分为对照组、模型组、AMPK特异性阻断剂（Compound C）组和AMPK激活剂5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸转甲酰酶（5-amino-4-imidazolecarboxamide riboside,AICAR）组，采用免疫荧光染色检测线粒体自噬水平；Rhodamine-123和mitotracker双染色及线粒体膜电位检测试剂盒检测线粒体膜电位变化；磷脂结合蛋白V(AnnexinⅤ)-碘化丙啶（propidium iodide,PI）染色检测细胞凋亡率；Western blot检测AMPK、p-AMPK蛋白表达。结果 免疫荧光染色结果显示，与对照组、模型组或Compound C组相比，AICAR组心肌细胞自噬体数增加，差异有统计学意义（P<0.05）。线粒体膜电位变化结果显示，与模型组或Compound C组相比，AICAR组心肌细胞膜电位正常的线粒体比例...     

右美托咪定预处理调控PINK1/Parkin通路对H9C2细胞缺氧/复氧损伤线粒体自噬的影响

目的 研究右美托咪定对缺氧/复氧(H/R)条件下心肌细胞PTEN诱导激酶1(PINK1)/E3泛素连接酶(Parkin)通路介导的线粒体自噬的影响,以明确右美托咪定保护心肌细胞的相关作用机制。方法 体外培养H9C2细胞,将细胞分为空白对照组、H/R组、右美托咪定低剂量组(0.1μmol/L右美托咪定+H/R)、右美托咪定中剂量组(1.0μmol/L右美托咪定+H/R)、右美托咪定高剂量组(10.0μmol/L右美托咪定+H/R)。采用3-2(4,5-二甲基噻唑-2)-2-四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)法检测各组H9C2细胞增殖能力;检测超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、活性氧簇(ROS)水平;透射电镜下观察线粒体自噬情况;JC-1法检测线粒体膜电位(MMP);免疫印迹法检测自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3(LC3)、家蚕隔离体蛋白1(p62)、PINK1/Parkin通路相关蛋白表达情况。结果 与空白对照组比较,H/R组H9C2细胞增殖抑制率、自噬小体数量、MDA含量、ROS水平、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及PINK1、Parkin蛋白表达水平明显升高(P<0.05)...     

曲美他嗪对缺氧诱导原代大鼠心肌细胞凋亡的影响

目的研究曲美他嗪对缺氧诱导的心肌细胞凋亡及线粒体能量代谢改变的影响。方法采用胰酶和胶原酶联合消化的方法,提取大鼠原代心肌细胞,三气培养箱模拟缺氧损伤。MTT和Hoechst染色检测细胞活性和凋亡,TMRE染色检测线粒体膜电位,Oxygraph-2k细胞呼吸测量仪检测态3、态4呼吸和呼吸控制率,Western blot检测Caspase-3、细胞色素C以及线粒体呼吸链复合酶体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ蛋白表达水平的变化。结果缺氧能够诱导心肌细胞凋亡、引起线粒体膜电位下降和促进细胞色素C的释放。此外,缺氧能够显著下调态3呼吸和上调态4呼吸,引起呼吸控制率的下降,同时缺氧能够不同程度地下调线粒体呼吸链复合酶体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ的蛋白表达水平。曲美他嗪能够显著降低缺氧诱导的心肌细胞凋亡、稳定线粒体膜电位和减少细胞色素C释放。此外,曲美他嗪还能减轻缺氧对线粒体呼吸链复合酶体的损伤,维持线粒体有氧呼吸。结论曲美他嗪具有抵抗缺氧致心肌细胞凋亡的作用,可能与其稳定线粒体膜和呼吸链复合酶体有关,继而减少细胞色素C的释放和维持线粒体有氧呼吸。     

氯沙坦钾对棕榈酸所致骨骼肌细胞凋亡的干预作用

目的从细胞水平探索氯沙坦钾对骨骼肌损伤的保护作用及其机制。方法用2%马血清诱导分化L6成肌细胞; CCK-8试剂盒及Western Blot确定合适的氯沙坦细胞处理浓度。实验分为4组:对照组,二甲基亚砜组,棕榈酸(1 mmol/L)组以及棕榈酸(1 mmol/L)+氯沙坦钾(50μmol/L)组。Western Blot检测凋亡相关蛋白(cleaved caspase-3、cleaved PARP、Bcl-2、Bax)、自噬相关蛋白(LC3、Beclin 1),实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR,q PCR)检测P53和P21 m RNA表达水平。结果显微镜下观察及Western Blot检测myogenin蛋白表达增加,证明骨骼肌细胞诱导分化成功。CCK-8试剂盒检测示氯沙坦钾浓度为50、100、200、400μmol/L时L6成肌细胞活力分别为0.87±0.087、1.11±0.037、1.21±0.099、1.30±0.068,其中50μmol/L时细胞活力最大,且对cleaved caspase-3蛋白表达抑制最明显。与未作处理的对照组比较,qPCR显示棕榈酸处理组骨骼肌细胞P53、P21 m RNA表达量分别从0.36±0.03、0.50±0.05上调至0.68±0.08、1.07±0.02 (P0.05),cleaved caspase3、cleaved PARP蛋白表达均增加,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及Beclin 1蛋白表达减低;与棕榈酸单独处理组比较,氯沙坦钾与棕榈酸共处理组P53、P21 m RNA表达量分别从0.68±0.08、1.07±0.02下调至0.44±0.01、0.67±0.03 (P0.05),cleaved caspase-3、cleaved PARP蛋白表达减低,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及Beclin1蛋白无显著改变。结论氯沙坦钾通过抑制cleaved caspase3及其底物cleaved PARP表达抑制细胞凋亡,但这种保护效应并不是通过自噬途径实现的。     

线粒体自噬对术前睡眠剥夺老龄大鼠术后认知功能的影响

目的 评价线粒体自噬对术前睡眠剥夺老龄大鼠术后认知功能的影响。方法 健康雄性SD大鼠64只，20～22月龄，体重550～700 g,采用随机数字表法，将其随机分为对照组(C)组、睡眠剥夺(SD)组、手术(S)组和睡眠剥夺+手术组(SS)组各16只。SD组和SS组采用改良多平台水环境睡眠剥夺法建立睡眠剥夺模型，S组和SS组大鼠行胫骨骨折加髓内固定术。分别于术后1、3、7 d(T1～T3)时采用条件性恐惧记忆实验测定大鼠认知功能，第7天行为学测定结束后立即处死取海马组织，采用TUNEL检测海马神经元凋亡情况，透射电镜观察大鼠海马神经元自噬情况，JC-1探针法测定线粒体膜电位，Western印迹检测大鼠海马组织LC3、Beclin1、Parkin及p62蛋白表达。结果 与C组比较，其余3组术后条件诱导僵立时间百分比明显降低，海马神经元凋亡指数明显升高，线粒体膜电位明显下降，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin 1及Parkin蛋白表达明显增加，p62蛋白表达明显减少(P<0.05);与SD组和S组比较，SS组术后条件诱导僵立时间百分比明显降低，海马神经元凋亡指数显著升高，线粒体膜电...     

CRISPR/Cas9沉默Fas可抑制急性肝衰竭细胞线粒体自噬及减轻线粒体损伤

目的 探讨凋亡相关因子(Fas/CD95)在急性肝衰竭疾病进展中的作用及机制。方法 构建刀豆蛋白A诱导的急性肝衰竭小鼠动物模型,通过透射电子显微镜及免疫印迹检测了急性肝衰竭肝细胞内的线粒体自噬发生;在小鼠尾静脉输注靶向Fas基因的CRISPR/Cas9质粒,随后予以刀豆蛋白A诱发急性肝衰竭,检测小鼠肝组织急性损伤情况及肝细胞内线粒体自噬及线粒体损伤的变化,同时体外转染靶向Fas的CRISPR/Cas质粒到细胞内,刀豆蛋白A诱导HepG2肝细胞损伤,验证Fas敲除后对线粒体自噬和线粒体损伤的影响。结果 刀豆蛋白A可诱导小鼠急性肝衰竭,透射电镜观察发现肝细胞中发生了线粒体自噬,肝细胞内p62蛋白水平降低,PINK1/Parkin的蛋白上调,Fas的表达上调;小鼠肝组织和体外肝细胞先予以PX330Fas质粒转染,再予以刀豆蛋白A诱导肝损伤后,LC3II/LC3I表达比值减低,p62蛋白的表达得到恢复,线粒体蛋白COX4I1和线粒体DNA含量的水平下降,Fas表达下调,与转染空白质粒的对照组相比,差异均有统计学意义。结论 CRISPR/Cas9沉默Fas抑制急性肝衰竭进展及肝细胞内线粒体自噬的...     

恒定及波动高糖下牛视网膜血管周细胞凋亡的线粒体机制

目的 研究恒定及波动高糖培养对牛视网膜血管周细胞凋亡的影响,并探讨其线粒体调控机制.方法 体外培养接近融合的视网膜血管周细胞在恒定及波动高糖中孵育6 d后,采用电镜观察周细胞超微结构改变;TUNEL法检测周细胞凋亡;激光共聚焦显微镜检测周细胞线粒体跨膜电位的改变;分光光度计检测周细胞胞质细胞色素c的变化;免疫组化和RT-PCR测定Bax、Bel-2基因的表达.结果 (1)恒定及波动高糖卜周细胞呈现出典型的细胞凋亡改,变,恒定高糖作用强于波动高糖组;(2)恒定及波动高糖培养使用细胞线粒体跨膜电位降低,周细胞线粒体跨膜电位与周细胞凋亡率负相关(r=-0.89,P<0.01);(3)恒定及波动高糖促使周细胞线粒体细胞色素c转移到胞质,胞质细胞色素c浓度增加,与细胞凋亡率正相关(P<0.01);(4)恒定及波动高糖能诱导凋亡基因Bax表达增加,抑制Bcl-2的表达,Bax/Bcl-2比值增加.Bax/Bcl-2比值与线粒体跨膜电位负相关,与胞质细胞色素c浓度正相关,与周细胞凋亡率正相关(均P<0.01).结论 恒定及波动高糖均可诱导培养的周细胞线粒体跨膜电位降低,细胞色素c释放,细胞发生凋亡,且恒定高糖作用强于波动高糖;线粒体凋亡途径在周细胞凋亡中起重要作用,凋亡基因Bax、Bcl-2可能参与其调控.     

沉默热休克蛋白70-2基因经线粒体依赖通路介导肝癌细胞凋亡

目的 探讨沉默热休克蛋白(HSP)70-2对肝癌细胞生长、凋亡的影响,以及诱导肝癌细胞凋亡的详细作用机制. 方法 Westem blot、免疫细胞化学法检测HSP70-2在4种肝癌细胞和正常肝细胞中的表达.设计合成针对HSP70-2基因的特异性短发夹状RNA(shRNA),构建真核表达载体HSP70-2 shRNA1和HSP70-2 shRNA2.转染肝癌细胞后,四甲基偶氮唑盐法检测细胞增殖,膜联蛋白/碘化丙啶双染法检测细胞凋亡情况,罗丹明染色检测细胞线粒体跨膜电位变化,Western blot检测多聚ADP-核糖聚合酶、caspase-3、caspase-9蛋白切割情况,以及细胞色素C、Bax,Bcl-2蛋白的表达变化. 结果 HSP70-2在4种肝癌细胞中均高表达,在L02细胞中仅有微量表达.HSP70-2 shRNA1、shRNA2均能有效抑制肝癌细胞中HSP70-2的表达.沉默HSP70-2基因显著抑制肝癌细胞生长,诱导肝癌细胞凋亡,转染48 h后,shRNA1和shRNA2诱导HepG2细胞的凋亡指数分别为55.8%±1.8%和57.1%±1.6%,诱导Huh细胞凋亡指数分别为54.9%±1.1%和60.2%±2.6%,与对照组相比,差异均有统计学意义,P值均＜0.01.转染HSP70-2 shRNA 48 h后,肝癌细胞线粒体跨膜电位显著下降,细胞色素C从线粒体释放到胞质中,caspase-3、caspase-9激活,多聚ADP核糖聚合酶被剪切降解,抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少,促凋亡蛋白Bax表达明显增加.结论 沉默HsP70-2能通过激活线粒体凋亡通路导致肝癌细胞凋亡.