人ALK-1的克隆和真核表达载体的构建

目的:克隆人ALK-1基因并构建其真核表达载体. 方法:设计ALK-1特异性引物,提取人胚胎肺组织总RNA,用RT-PCR方法获取人ALK-1 cDNA. 将ALK-1 cDNA克隆至pcDNA3.1/myc-His(-),双酶切鉴定并测序后,转染HEK293细胞. 用Western Blot检测目的蛋白的表达. 结果:成功获得人ALK-1全长cDNA,双酶切鉴定证实成功构建pcDNA3.1(-)/ALK-1. 测序结果表明ALK-1全长cDNA与GeneBank中ALK-1序列完全一致. 转染HEK293细胞后,可检测出Mr约为62×103的目的蛋白. 结论:获得了ALK-1全长cDNA并成功构建了ALK-1真核表达载体,证实pcDNA3.1(-)/ALK-1转染HEK293细胞后可表达ALK-1蛋白,为深入研究ALK-1介导的TGFβ信号转导通路在创面愈合以及瘢痕疙瘩发生,发展中的作用奠定了基础.     

人PDX-1基因真核表达载体的构建及表达

目的构建人胰十二指肠同源盒(PDX-1)基因的真核表达载体,观察其在NIH3T3细胞中的表达。方法以人胰岛细胞瘤cDNA为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增PDX-1基因编码区的全部序列,克隆入真核细胞表达载体pcDNA3.1中,经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因。序列正确的重组质粒用脂质体转染NIH3T3细胞,Western blot观察基因表达情况。结果PCR扩增的特异性片段长度为852 bp,以此构建的重组质粒pcDNA3.1-PDX-1,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后显示5.5 kb和850 bp左右的两条片段,测序结果与GenBank中的人PDX-1基因cDNA(GenBank序列号NM_000209)序列一致。证明PDX-1基因已成功克隆到了真核细胞表达载体pcDNA3.1中。Western blot证实pcDNA3.1-PDX-1转染NIH3T3细胞24 h后有PDX-1的表达。结论成功构建了pcDNA3.1-PDX-1重组真核表达载体,并在NIH3T3细胞中表达。     

人PDX-1基因真核表达载体的构建及表达

目的 构建人胰十二指肠同源盒(PDX-1)基因的真核表达载体,观察其在NIH3T3细胞中的表达.方法 以人胰岛细胞瘤cDNA为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增PDX-1基因编码区的全部序列,克隆入真核细胞表达载体pcDNA3.1中,经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因.序列正确的重组质粒用脂质体转染NIH3T3细胞,Western blot观察基因表达情况.结果 PCR扩增的特异性片段长度为852 bp,以此构建的重组质粒pcDNA3.1-PDX-1, 经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后显示5.5 kb和 850 bp左右的两条片段,测序结果与GenBank中的人PDX-1基因cDNA(GenBank 序列号NM_000209)序列一致.证明PDX-1基因已成功克隆到了真核细胞表达载体pcDNA3.1 中.Western blot证实pcDNA3.1-PDX-1转染NIH3T3细胞24 h后有PDX-1的表达.结论 成功构建了pcDNA3.1-PDX-1重组真核表达载体,并在NIH3T3细胞中表达.     

MyD88基因真核表达载体的构建及表达

目的：构建人髓样分化因子88（MyD88）基因编码区序列（cDNA）的真核表达载体,观察其在GES-1细胞中的表达．方法：从健康人外周血单个核细胞中提取总RNA,应用RT—PCR方法扩增MyD88基因cDNA全长序列,经NheI和KpnI酶切位点,插入到pcDNA3．1／myc—His（-）A质粒中,构建成MyD88基因的真核表达载体;用脂质体Lipo—fectamine2000将其转染人人胃黏膜细胞株GES-1细胞中,Western Blot检测其在GES-1细胞中的表达．结果：重组载体经酶切鉴定和测序证实目的基因正确无误;Western Blot结果显示MyD88基因在GES-1细胞具有良好的表达．结论：成功构建了pcDNA3．1／myc—His（-）A-MyD88真核表达载体,并在GES-1细胞中进行了表达,为进一步研究MyD88的结构和功能奠定了基础．     

小鼠VCAM-1真核表达质粒的构建及表达

目的:构建小鼠血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)基因真核表达质粒,了解该质粒是否能在真核细胞中有效表达.方法:以小鼠胚肝组织总RNA为模板,通过RT-PCR扩增小鼠VCAM-1全段基因cDNA,应用基因工程技术将扩增的cDNA片段插入pcDNA3.1( )真核表达质粒,构建重组真核表达质粒pcDNA-mVCAM,经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体转染技术转染CHO细胞,用Western Blot鉴定该质粒是否能够在真核细胞中表达相应的目的蛋白质.结果:成功扩增了小鼠VCAM-1全长基因cDNA,酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒pcDNA-mVCAM,Western Blot方法证实该质粒能在CHO真核细胞中正确表达目的蛋白.结论:成功构建了小鼠VCAM-1基因的真核表达质粒载体,为进一步研究VCAM-1的新功能和免疫治疗奠定了基础.     

人AQP5真核表达质粒的构建及其在胃癌细胞中的表达

目的构建人pcDNA3.1-AQP5/myc-His真核表达质粒,观察水通道蛋白5(AQP5)基因在胃癌AGS细胞中的稳定表达。方法采用基因重组技术将人AQP5cDNA插入真核表达载体pcDNA3.1/myc-His,构建人pcDNA3.1-AQP5/myc-His真核表达质粒。脂质体介导空载体pcDNA3.1/myc-His和表达质粒pcDNA3.1-AQP5/myc-His分别转染人胃癌AGS细胞株,G418筛选,挑取阳性克隆,扩大培养,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western Blot)分别检测AQP5mRNA和蛋白表达。结果双酶切和基因测序结果均证实人pcDNA3.1-AQP5/myc-His真核表达质粒构建成功。AQP5转染组与空白对照组、空载体组比较,AQP5mRNA表达显著增加(P<0.05),AQP5蛋白表达显著上调(P<0.05)。结论成功构建人AQP5真核表达质粒并获得稳定表达AQP5基因的胃癌AGS细胞系,为进一步研究AQP5蛋白对胃癌恶性表型的影响奠定实验基础。     

Adipophilin真核表达载体的构建与表达分析

目的 构建能在真核细胞中表达的adipophilin表达质粒pcDNA3.1-HA-adi.方法 从培养的C57BL/6J小鼠血管平滑肌细胞提取总RNA,在PCR引物中加入HA序列,用RT-PCR及TOPO克隆技术得到HA-adi克隆栽体,测序后,把HA-adi定向插入pcDNATM3.1/myc-His(-)-C的多克隆住点.阳离子聚合物介导转染人THP-1巨噬细胞,用R.T-PCR及Western blot的方法检测目的 蛋白在细胞中的表达.结果 限制性内切酶酶切和DNA测序分析证实成功获得HA-adi基因片段,HA-adi准确克隆入pcDNATM3.1/myc-His(-)-C的多克隆位点.转染THP-1巨噬细胞后,检测到目的 蛋白的表达.结论 成功构建pcDNA3.1-HA-adi,并在THP-1巨噬细胞中得到表达.     

新基因PRR11的克隆、真核表达载体的构建及鉴定

目的：克隆新基因PRR11的开放阅读框区,构建其真核表达载体,并进行表达检测及鉴定。方法：以HeLa细胞cDNA为模板,半定量RT-PCR扩增PRR11基因,克隆入真核表达载体pcDNA3.1中,酶切、测序鉴定确认获得PRR11基因的重组真核表达载体pcDNA3.1-PRR11。然后将pcDNA3.1-PRR11重组载体转染入HeLa细胞中,收集细胞,制备总RNA和细胞裂解液,采用半定量RT-PCR和蛋白质免疫印迹法检测目的基因表达情况。结果：成功扩增了PRR11基因,双酶切、测序鉴定证实目的基因成功克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,测序结果表明序列完全正确,pcDNA3.1-PRR11真核重组表达载体构建成功。半定量RT-PCR和蛋白质免疫印迹法证实了转染入HeLa细胞中的目的基因表达成功。结论：成功构建了PRR11基因的真核表达载体,并可在HeLa细胞中成功表达,为进一步研究PRR11基因的功能奠定了基础。     

稳定表达HIV-1 GagPol基因真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建能稳定表达HIV-1 GagPol基因的真核表达载体.方法:用PCB方法扩增HIV-1 GagPol基因,克隆入pMD18-T,然后亚克隆人真核表达质粒pcDNA3.2(一)中,将构建的重组质粒pcDNA3.1(-)/GagPol分别瞬时和稳定转染HEK293细胞,经G418筛选,建立稳定转染GagPol基因的细胞系,并应用Western Blot方法鉴定表达产物.结果:酶切鉴定和Western Blot检测证实重组质粒pcDNA3.1(-)/GagPol构建正确,并能稳定表达HIV-1GagPol蛋白.结论:成功构建携带HIV-1 GagPol基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)/GagPol,并在HEK293细胞中获得稳定表达.     

凋亡抑制蛋白Livin两种异构体真核表达载体的构建及表达鉴定

目的构建凋亡抑制蛋白Livin两种异构体(Livinα和β)真核细胞表达载体pcDNA3.1-Livin α和pcDNA3.1-Livin β.方法利用分子克隆技术,首先设计合成扩增Livin基因异构体全长cDNA序列的特异性PCR引物,以肺腺癌SPC-A1细胞总RNA为模板,RT-PCR获得Livin基因异构体全长cDNA序列,TA克隆将Livin全长cDNA序列克隆到T载体上,用限制性内切酶HindⅢ和Xba Ⅰ双酶切取所需目的片段,然后将该片段插入真核表达载体pcDNA3.1的多克隆位点,最后对产生的重组子进行双酶切、PCR鉴定,并经过测序证实后,构建成为Livin基因异构体表达载体(pcDNA3.1-Livin).电穿孔法获得稳定表达Livin α和β的A549细胞克隆,Western blot验证Livin蛋白在转染细胞中的表达情况.结果成功获得Livinα和Livin β全长cDNA序列,并克隆到真核表达载体pcDNA3.1上;基因转染后,阳性细胞分别表达Livinα和β.结论Livin基因两种异构体真核表达载体的构建及在细胞中的表达鉴定,为进一步研究Livin异构体功能及在肺癌细胞中的抗凋亡效应奠定了基础.     

增强型绿色荧光蛋白原核表达载体的构建及表达

目的 构建以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为标记的原核表达栽体,并观察EGFP基因在大肠杆菌中的表达情况.方法 据已知的EGFP基因序列,设计引物,并引入Nde Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点.采用PCR技术从含有EGFP的质粒pEGFP-C1中克隆EGFP编码序列;将其亚克隆入表达载体pTWIN1,得到以EGFP为标记的原核表达载体pTWIN-EGFP.转化大肠杆菌ER2566菌株,IPTG诱导EGFP基因表达.结果 经过IPTG诱导后,细菌培养物在长波紫外线的照射下,发出明亮的绿色荧光.结论 成功构建了原核表达载体pTWIN-EGFP,为应用EGFP作为报告基因和筛选标记奠定了实验基础.     

gp350胞外段基因表达载体的构建与表达

目的 构建gp350与C3d融合基因表达载体,并在体外进行表达和鉴定.方法 以pGEX-gp350为模板,经PCR获得长846bp的gp350胞外段(25-870),将该扩增片段插入pSG.SS.C3d3.YL载体,构建pSG.SS.gp350.C3d3.YL表达质粒.经限制性内切酶鉴定和DNA序列测定证实后,将该质粒转染Hela细胞,检测其体外表达.结果 免疫细胞化学分析结果表明转染细胞有目的 分子的表达. 结论 构建的重组载体可在真核细胞内正确表达,这为基于gp350的鼻咽癌预防性疫苗下一步的动物实验奠定了基础.     

人碱性成纤维细胞生长因子真核表达载体的构建及表达

目的: 构建研究人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)真核表达载体,并在体外进行表达和检测.方法: 从骨髓基质干细胞中分离总RNA,进行RT-PCR 获得人bFGF cDNA.测序证实其结果正确后,构建真核表达载体.并经BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切、PCR及测序鉴定.利用Blast程序,搜索NCBI GenBank中与重组质粒(pVAX1-bFGF)中编码bFGF基因同源的序列.通过脂质体将重组质粒转染入骨髓基质干细胞,使用间接免疫荧光法进行表达产物检测.结果: 经EcoRⅠ/Pst BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切、PCR及测序鉴定证实,人bFGF基因成功地克隆到真核表达载体pVAX1中;pVAX1- bFGF中编码bFGF的序列与GenBank中所报道的bFGF编码序列完全一致;间接免疫荧光结果显示转染重组质粒的细胞表面有绿色荧光.结论: 成功地构建了人bFGF真核表达载体,其可以在体外进行表达.     

小鼠GITR真核表达载体的构建及表达

目的:构建小鼠GITR(mGITR)的真核表达载体,转染COS-7 细胞表达小鼠GITR 蛋白.方法:用TRIzol 试剂抽提小鼠脾细胞总RNA,经RT-PCR 扩增出GITR 全长基因,构建真核重组载体pIRES2-EGFP-mGITR,经鉴定后采用脂质体介导DNA 法转染COS-7 细胞.结果:从小鼠脾细胞中成功扩...     

hTEFT重组绿色荧光表达载体的构建与表达

目的构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)片段的真核表达质粒。方法用RT-PCR方法从肝癌组织中提取总RNA扩增出hTERT基因片段,将其连接pGEM-TEasy质粒上,将重组质粒pGEM-T-hTERT和pEGFP-C3真核绿色荧光蛋白表达载体同时用HindⅢ和BamHⅠ双酶切后进行连接,再将重组的pEGFP-C3-hTERT基因片段转染NIH3T3细胞,经G418筛选获得稳定转染的细胞系,荧光倒置显微镜观察并检测转染细胞的hTERTmRNA表达水平。结果DNA序列分析证实了重组载体pGEM-T-hTERT和pEGFP-C3-hTERT内插入片段的碱基组成与公开发表的hTERT序列一致。转染pEGFP-C3-hTERT的NIH3T3细胞可见绿色荧光,并检出高水平表达的hTERT。结论成功构建高效表达hTERT的真核表达载体,为以hTERT为靶点的肿瘤治疗打下实验基础。     

maspin/pEFIRES-N表达载体的构建及应用

目的构建maspin/pEFIRES-N表达载体,为深入研究maspin基因抑制肝癌生长、转移、浸润作用和机制奠定基础.方法 PCR扩增maspin基因全长,将表达载体pEFIRES-N用EcoRⅠ XbaⅠ进行双酶切后,T4DNA连接酶连接成重组质粒,稳定转染到肝癌高转移细胞株mHCC-97中进行表达,检测稳定转染前后maspin表达的变化.结果重组质粒在大肠杆菌株JM109内扩增.提纯、纯化后用EcoRⅠ、XbaⅠ酶切鉴定及测序鉴定证明maspin基因已完整、正确的插入到pEFIRES-N表达载体,并在肝癌MHCC-97细胞中上调了maspin基因mRNA和蛋白水平表达,抑制了肝癌MHCC-97细胞增殖及浸润.结论成功构建了maspin/pEFIRES-N表达载体,能在真核细胞中表达.     

凋亡抑制蛋白Livin真核表达载体的构建及表达

目的:构建凋亡抑制蛋白Livin真核表达载体pIRES2-AcGFP-Livin。方法:设计合成扩增Livinα和Livinβ基因全长cDNA序列的特异性PCR引物,以食管鳞状细胞癌EC9706细胞总RNA为模板,进行RT-PCR,将获得的cDNA序列克隆入T载体,再用BglⅡ和EcoRⅠ双酶切,亚克隆入真核表达载体pIRES2-AcGFP,将重组质粒用脂质体包裹转染NIH3T3细胞,G418筛选得到稳定表达的细胞克隆,Western-blot检测转染细胞Livinα和Livinβ蛋白的表达情况。结果:构建了真核表达载体pIRES2-AcGFP-Livinα和pIRES2-AcGFP-Livinβ,测序分析证实插入序列正确;转染的NIH3T3细胞,可稳定表达Livinα或Livinβ蛋白。结论:成功构建Livinα和Livinβ真核表达载体。     

TAT-EGFP融合蛋白表达载体的构建及表达

目的:构建TAT-EGFP原核表达载体,在E.coli BL21中高效表达并纯化.方法:人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段,插入载体pET28a后得到pET28a-TAT重组质粒,再连接绿色荧光蛋白(EGFP)基因,组成pET28a-TAT-EGFP重组表达子.转化大肠杆菌,IPTG诱导TAT-EGFP融合蛋白表达.表达产物用十二烷基硫钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,组氨酸亲和层析柱纯化融合蛋白.结果及结论:成功地构建了TAT-EGFP融合蛋白的原核表达载体,在诱导后获得了高效表达并纯化,为进一步研究TAT的蛋白转导作用奠定了基础.     

人DC-SIGN真核表达载体的构建及表达

目的构建含有FLAG标签的人DC—SIGN真核表达载体,并在人胚肾293T细胞中进行表达。方法通过PCR方法获得含有FLAG标签的人DC—SIGN分子基因,将其插入到真核表达载体pIRES—neo中。构建的重组质粒pIRES—neO—FLAG—DC—SIGN转染293T细胞,利用流式细胞仪、免疫荧光及WesternBlot检测其表达情况。结果含FLAG标签的人DC—SIGN基因测序正确,PCR和酶切鉴定证明FLAG—DC—SIGN基因已成功连入真核表达载体pIRES—neo中;检测结果显示重组质粒pIRES—neo—FLAG—DC—SIGN在293T细胞中得到表达。结论成功构建了重组质粒pIRES—neo—FLAG—DC—SIGN,且在293T细胞中能有效表达,为后续DC靶向性疫苗研究奠定了基础。