牛坐骨神经内源性抑制物对体外培养DRG细胞分化的影响

目的　在新生牛坐骨神经提取对背根神经节 (dorsalrootganglia,DRG)细胞存活和突起生长有抑制活性的物质 .方法　原代培养 DRG细胞 ,实验组分别以不同浓度加入前一实验证实对 PC12细胞有抑制活性 ,Mr5 0 0 0～ 10 0 0 0之间的新生牛坐骨神经提取液 ,对照组中加入培养液 . 48h后进行MTT细胞活性测定、总蛋白含量测定以及观察细胞突起生长情况 .结果　实验组加入提取液蛋白浓度为 2 0 m g· L- 1 ,40mg· L- 1时 ,DRG细胞的活性、总蛋白含量以及突起的生长无明显变化 ;当提取液的浓度为 80 mg· L- 1 ,16 0 mg· L- 1时 ,DRG细胞胞体皱缩 ,突起生长缓慢、停滞 ,细胞活性和总蛋白含量明显减低 .对照组的 DRG细胞生长良好 .结论　新生牛坐骨神经内存在一种对体外培养的 DRG细胞存活及突起生长有抑制作用的物质 .     

静电纺丝聚乳酸-乙醇酸聚合物膜与大鼠嗅鞘细胞的生物相容性研究

目的 探索静电纺丝技术制作的聚乳酸-乙醇酸聚合物（PLGA）膜与大鼠嗅鞘细胞（olfactory ensheathing cells,OECs）的生物相容性。方法 体外培养纯化成年大鼠OECs,将细胞接种于静电纺丝PLGA膜上,使用相差显微镜观察静电纺丝PLGA膜上OECs的细胞形态与分布;用CFDA SE荧光染色检测接种后1～5 d内静电纺丝PLGA膜上OECs的增殖情况;以多聚赖氨酸（PLL）包被细胞做对照。将静电纺丝PLGA膜植入大鼠体内观察其与大鼠的组织相容性。结果 体外培养纯化所得的OECs的细胞纯度大于90%。相差显微镜下示OECs在静电纺丝PLGA膜孔隙中的纳米纤维上黏附良好,细胞状态佳,且特异性地沿纳米纤维方向生长。接种后1～5 d内OECs在静电纺丝PLGA膜上均正常增殖,细胞数目与对照组相比差异无统计学意义。静电纺丝PLGA膜局部移植后大鼠无死亡,PLGA膜与周围组织融合并部分降解。结论 静电纺丝PLGA膜具有良好的生物相容性,OECs在其膜上的黏附和增殖状况良好,是有潜力的神经修复组织工程化神经移植物。     

丝素纤维与背根神经节体外生物相容性初步研究

目的:通过丝素纤维与背根神经节共培养观察其与神经组织的相容性。方法:采用丝素制备,背根神经节与丝素共培养,免疫细胞化学等方法。结果:培养7天后大量的细胞从背根神经节爬出,缠绕在丝素材料上。经免疫细胞化学染色激光共聚焦显微镜观察,示该类细胞主要为雪旺细胞。另可见大量的神经纤维从背根神经节发出,沿着丝素材料延伸。结论:丝素与背根神经节有良好的组织相容性,可适用于外周神经修复。     

低热高压法制作PLGA支架的三维结构研究

目的制作不含有机溶剂、三维结构良好的聚丙交酯-乙交酯共聚物（PLGA）支架,使之符合组织工程骨修复的需要,探讨一种新型聚合物支架制作方法。方法将聚合物与氯化钠粉碎后,采用低热高压法制作PLGA泡沫结构支架,经密度法、氯化钠法测定其空隙率、开孔率;扫描电镜观察表面和内部结构、测定孔径。结果利用此种方法制作的PLGA支架,空隙率达到90.0％和92.5％、孔径在200-250μm之间、开孔率为98.0％以上（P<0.01）,平均氯化钠沥净时间为12～13h。结论使用低热高压法制作的组织工程支架,三维结构稳定,各项参数可控制;根据模具的大小可以制作不同体积的支架;依据盐的颗粒粒度与数量控制支架的孔径和空隙率,在制作过程中不使用有机溶剂,减少了有机溶剂残留可能引起的对细胞的毒性。使用这种方法要对聚合物与氯化钠颗粒进行充分混合。     

Co-transplantation of neural stem cells and Schwann cells within poly (L-lactic-co-glycolic acid) scaffolds facilitates axonal regeneration in hemisected rat spinal cord

Background  Various tissue engineering strategies have been developed to facilitate axonal regeneration after spinal cord injury. This study aimed to investigate whether neural stem cells (NSCs) could survive in poly(L-lactic-co-glycolic acid) (PLGA) scaffolds and, when cografted with Schwann cells (SCs), could be induced to differentiate towards neurons which form synaptic connection and eventually facilitate axonal regeneration and myelination and motor function.

Methods  NSCs and SCs which were seeded within the directional PLGA scaffolds were implanted in hemisected adult rat spinal cord. Control rats were similarly injured and implanted of scaffolds with or without NSCs. Survival, migration, differentiation, synaptic formation of NSCs, axonal regeneration and myelination and motor function were analyzed. Student’s t test was used to determine differences in surviving percentage of NSCs. One-way analysis of variance (ANOVA) was used to determine the differences in the number of axons myelinated in the scaffolds, the mean latency and amplitude of cortical motor evoked potentials (CMEPs) and Basso, Beattie & Bresnahan locomotor rating scale (BBB) score. The χ² test was used to determine the differences in recovery percentage of CMEPs.

Results  NSCs survived, but the majority migrated into adjacent host cord and died mostly. Survival rate of NSCs with SCs was higher than that of NSCs without SCs ((1.7831±0.0402)% vs. (1.4911±0.0313)%, P <0.001). Cografted with SCs, NSCs were induced to differentiate towards neurons and might form synaptic connection. The mean number of myelinated axons in PLGA+NSCs+SCs group was more than that in PLGA+NSCs group and in PLGA group ((110.25±30.46) vs. (18.25±3.30) and (11.25±5.54), P <0.01). The percentage of CMEPs recovery in PLGA+NSCs+SCs group was higher than in the other groups (84.8% vs. 50.0% and 37.5%, P <0.05). The amplitude of CMEPs in PLGA+NSCs+SCs group was higher than in the other groups ((1452.63±331.70) µV vs. (428.84±193.01) µV and (117.33±14.40) µV, P <0.05). Ipsilateral retransection resulted in disappearance again and functional loss of CMEPs for a few days. But contralateral retransection completely damaged the bilateral motor function.

Conclusions  NSCs can survive in PLGA scaffolds, and SCs promote NSCs to survive and differentiate towards neurons in vivo which even might form synaptic connection. The scaffolds seeded with cells facilitate axonal regeneration and myelination and motor function recovery. But regenerating axons have limited contribution to motor function recovery.

 

     

嗅鞘细胞与神经修复支架材料的相互作用

目的：探讨一种提取高纯度和一定数量的嗅鞘细胞(OECs)的新方法,并研究其与神经支架修复材料PLGL的生物相容性。方法：从新生的 Wister 大鼠身上分离制备嗅鞘细胞并与PLGL共同培养。测量其接触角、吸附率、存活率等。结果：PDLLA的接触角（84.5°±1.5°）明显大于PLGL的接触角（52.6°±0.8°）。PLGL的吸附率（80%）明显高于PDLLA（57%）。PLGL的细胞存活率（88%）明显高于PDLLA（76%）。结论：PLGL比PDLLA具有更好的亲水性、存活率以及良好的细胞生长状况。     

新生SD大鼠坐骨神经Wallerian变性规律及其S-100蛋白表达和雪旺细胞增殖研究

目的:了解新生SD大鼠周围神经Wallerian变性不同时间点S-100蛋白表达变化及对雪旺细胞增殖的影响.方法:10 d龄SD大鼠坐骨神经进行结扎预变性,分别于术后24 h、3 d、5 d、7 d和9 d,进行雪旺细胞培养和S-100免疫组织化学染色观察.结果:在损伤周围神经的近端发生可逆性变性,远端则发生永久性Wallerian变性.实验组雪旺细胞增殖速率与S-100蛋白阳性染色率均优于对照组,7 d组增殖能力达到高峰,S-100蛋白阳性染色率约51%～56%,与对照组比较差异有显著性.结论:新生SD大鼠周围神经受损后变性过程类似于经典的Wallerian变性,且能在变性中期获得活力较强及倍增时间较短的雪旺细胞.     

自制编织型三维支架对体外神经膜细胞生长的影响及体内降解观察

目的:自制聚乙交酯-丙交酯(poly lactide-co-glycolide acid,PLGA)神经组织工程三维支架,观察该支架对体外神经膜细胞生长的影响及其体内降解情况及炎症反应,为后续研究奠定基础.方法:通过熔融、纺丝、拉伸、编织等步骤制作编织型三维PLGA支架,扫描电镜观察内部微管道的排列规律,测量微管道孔径大小.将原代培养的神经膜细胞接种到编织型三维支架上,采用倒置相差显微镜和扫描电镜观察细胞在支架上生长、黏附、增殖和凋亡情况,并与细胞培养皿和胶原海绵培养细胞进行对照.将携带神经膜细胞的三维支架植入大鼠脊柱两侧肌肉中,H-E染色观察支架在体内的降解情况及炎症反应.结果:支架外径为3 mm,微管道直径为100 μm,均匀平行排列.三维支架与细胞培养皿中的神经膜细胞细胞黏附率、增殖率无统计学差异,与胶原海绵培养细胞差异有统计学意义(P<0.05);三维支架与胶原海绵上的细胞凋亡率无统计学差异,二者均低于细胞培养皿培养细胞,差异有统计学意义(P<0.05).三维支架植入体内12周后完全降解,周围无明显炎性细胞浸润.结论:自制编织型三维支架对体外神经膜细胞生长无不良影响,体内能有效降解,具有良好的生物相容性.     

细菌纤维素与雪旺细胞体外生物相容性研究

目的 探讨雪旺细胞与细菌纤维素体外共培养时的生物相容性,为细菌纤维素制备成组织工程化神经提供实验依据.方法 将背根神经节与细菌纤维素膜体外共培养,分别在培养的第1、2、5天通过扫描电镜和光镜观察雪旺细胞的形态及增殖、迁移情况,免疫细胞化学染色检测S-100蛋白表达情况;将坐骨神经来源的纯化雪旺细胞在细菌纤维素浸出液中培养,分别在24、48、72 h采用倒置显微镜和免疫细胞化学染色观察雪旺细胞形态及S-100蛋白的表达情况,并通过MTT检测细胞活力,流式细胞仪检测细胞周期来综合评价雪旺细胞与细菌纤维素的生物相容性.结果 雪旺细胞能在细菌纤维素膜表面正常生长、迁移;与普通培养基相比,细菌纤维素浸出液对雪旺细胞的生长、增殖及S-100蛋白的表达无明显影响.结论 雪旺细胞能够在细菌纤维素膜表面及细菌纤维素浸出液中良好生长,体外与细菌纤维素具有较好的生物相容性.     

Survival and migration of Schwann cells after the vascularized peripheral nerve grafted into spinal cord in rats

Objective：To study the survival and ability of inducing axonal regeneration of the Schwann cells after the peripheral nerve being grafted into spinal cord. Methods：A total of 30 adult female Wistar rats were randomly divided into the VN （vascularized peripheral nerve） and PN （peripheral nerve） groups. A 5-mm spinal cord defect of the left posterior column was made at the T1-3 vertebral level. The defect was grafted with the vascularized or isolated peripheral nerve respectively. The survival and proliferation of the Schwann cells were assessed by histological and morphometric analysis 8 weeks after the operation. Resuits：In the VN group, the peripheral nerve grew into the cord with lots of Schwann cells survived and proliferated, and had more NF and S-100 positive fibers than in the PN group. Conclusion：The vascularized peripheral nerve enhances the survival and proliferation of the Schwann cells and prompts the regener- ation of injured axon of the central nerve system to certain degree.     

低热高压法制作PLGA支架的降解及生物力学研究

目的研究低热高压法制作的聚丙交酯-乙交酯(PLGA)支架在体外降解后生物力学和固有粘滞系数等的变化。方法将空隙率为90.0%和92.5%的PLGA在37℃生理盐水中降解观察8周,每周进行体积、质量丢失、粘滞系数衰减和抗压强度测试,同时观察降解液酸度变化。结果两组支架的质量丢失差异显著,各组粘滞系数在第1周后逐渐衰减,至第6周时衰减一半。支架抗压强度自第4周起减至原来的1/2,外形在4~8周观察期间发生显著坍塌。降解液中的pH值在整个过程中保持在6.0~6.5之间,在前4周90.0%组比92.5%组pH值低,其后没有差别。结论低热高压法制作的PLGA支架生物力学性能是稳定的,半衰期为6周,适于在组织工程实验中应用。     

外周血来源的内皮祖细胞的体外培养与分化

目的 研究内皮祖细胞(EPC)的分离、培养、分化及鉴定。方法 Ficoll密度梯度离心分离外周血获取单核细胞，在加有EGM-2-MV—SingleQuots的EBM-2培养液中培养和扩增，免疫组化和免疫荧光测定分化细胞表面特异性抗原的表达。结果 培养后10d细胞融合，呈克隆样生长，20d后细胞呈现典型的鹅卵石样内皮细胞形态；免疫组化和免疫荧光显示，CD31、vWF、FLK-1／KDR／VEGFR-2和VE—cadherin均呈阳性。结论 外周血来源的单核细胞含有内皮祖细胞，能在一定的培养条件下分化成为血管内皮细胞。     

PRKCq在大鼠损伤坐骨神经组织中的表达及其作用研究

目的：通过分子生物学方法,分析大鼠坐骨神经损伤后Wallerian溃变过程中,Protein Kinase-theta （PRKCq）在远端神经组织中的表达,进一步通过培养的施旺细胞（Schwann cell, SC）,分析PRKCq对体外培养SC的作用,揭示PRKCq在周围神经Wallerian溃变过程中的功能及机制。方法：制备不同时间点损伤大鼠坐骨神经溃变模型,采用Real-time PCR和siRNA的方法,分析PRKCq在大鼠坐骨神经损伤后,不同时间点远端组织中的表达变化,进一步培养和纯化SC,干扰PRKCq在SC中的表达,分析PRKCq对SC增殖和迁移的影响。结果：大鼠坐骨神经损伤后,在Wallerian溃变过程中,远端组织PRKCq的表达显著降低,PRKCq可在培养的SC中表达,PRKCq siRNA干扰SC后,抑制了SC的增殖和迁移。结论：在大鼠坐骨神经损伤后Wallerian溃变过程中,PRKCq的表达显著降低并影响SC的功能,提示PRKCq在神经损伤修复过程中可能发挥一定的作用。     

PLGA纳米可降解尿道支架的制备及力学性能

目的：探讨电纺丝法制备聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)(摩尔比80∶20)可降解尿道支架的可行性,并评价支架管的力学性能。方法：PLGA（80∶20）用三氯甲烷溶解并配成3%、4%、5%和6%的溶液,采用电纺丝技术制备纳米尿道支架,采用扫描电镜观察各种浓度PLGA制备的纳米尿道支架的微观结构,比较各种浓度PLGA支架的纤维直径、孔径、孔隙率及力学性能的差异。结果：浓度为3%、4%和5%的PLGA尿道支架制备成功,浓度为6%的PLGA因浓度过高制管失败。支架呈白色,长度4 cm,内径约 3.0 mm,外径约4.0 mm。电镜扫描见3种浓度的PLGA支架纤维平均直径随浓度的增高而增粗,组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。3种浓度PLGA支架的平均孔径分别为（7±4）、(13±7)和(32±13)μm,各组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。3%PLGA支架的孔隙率接近79%,4%PLGA支架的孔隙率约为85%,而5%PLGA支架的孔隙率约为90%,各组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。3种浓度PLGA支架的平均断裂强度分别为（2.37±0.15）、（1.97±0.07）和（1.85±0.11）MPa,3%PLGA支架的断裂强度显著高于浓度4%及5%PLGA支架（P<0.05）,而4%与5% 2种浓度PLGA支架的平均断裂强度比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论：5%PLGA尿道支架在孔径、孔隙率等方面可较好满足尿道组织工程支架对空间结构的要求,虽力学性能较3%PLGA支架略差,但可完全满足支架对力学性能的要求。     

兔脂肪干细胞(ADSCs)与聚羟基乙酸/壳聚糖(PLGA/CS)支架材料生物相容性研究

 目的  探讨兔脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)作为种子细胞复合新型聚羟基乙酸(polylactic-co-glycolic acid,PLGA)/壳聚糖(chitosan,CS)支架材料的生物相容性,为进一步构建组织工程化脂肪组织提供实验依据。方法  取雄性新西兰大白兔腹股沟脂肪组织,Ⅰ型胶原酶消化分离出ADSCs进行培养,贴壁细胞至3~5代,评价其多向分化能力。将干细胞收集重悬后,以l×107/mL的密度接种于多孔PLGA/CS支架,形成细胞 支架材料复合物。培养7天后,扫描电子显微镜观察细胞在支架材料上的黏附生长和基质分泌情况,评价细胞与支架材料的生物相容性;Dil荧光标记检测细胞在支架材料上的分布;Hochest 33258检测细胞在支架上的生长情况。接种1和7天后,分别对细胞 材料复合物行Annexin V/PI双染色法检测材料对细胞的毒性作用。用成脂诱导条件培养基诱导分化ADSCs及ADSCs支架材料复合物,7天后,尼罗红荧光染色液检测ADSCs在不同环境下的成脂分化能力。结果  原代培养的ADSCs呈成纤维细胞样外观,在相应诱导条件下能够分化为脂肪细胞和骨细胞。细胞接种于PLGA/CS支架材料上第8天分裂增殖达到高峰,扫描电子显微镜下提示ADSCs在支架表面贴附生长良好,并向孔隙内壁充分延伸,细胞周围形成丰富的基质成分。活死双染结合共聚焦显微镜显示材料对细胞活性无影响,尼罗红染色可见成脂诱导后的ADSCs细胞质内有红色脂滴颗粒形成。结论  多孔PLGA/CS支架与兔ADSCs具有良好的生物相容性,可作为构建组织工程脂肪组织的支架材料。     

载顺铂联合氯喹聚乳酸静电纺丝膜对口腔鳞状细胞癌CAL-27细胞增殖的抑制作用

目的：观察载药聚乳酸（PLA）静电纺丝膜对口腔鳞状细胞癌CAL-27细胞的作用,探讨预防口腔癌术后复发的方法。方法：利用静电纺丝技术制备载顺铂（DDP）PLA静电纺丝膜（DDP/PLA膜）、载氯喹（CQ）/顺铂/氯喹PLA静电纺丝膜（CQ/DDP/CQ/PLA膜,复合膜）和载氯喹/顺铂PLA静电纺丝膜（CQ/DDP/PLA膜,共混膜）。通过扫描电镜（SEM）观察3种载药PLA静电纺丝膜的表面形态;紫外分光光度分析法测定PLA静电纺丝膜的降解速率;激光共聚焦显微镜观察自噬特异性蛋白LC3-Ⅱ在CAL-27细胞中的表达情况;MTT法检测CAL-27细胞生存率。结果：SEM观察,DDP/PLA膜、复合膜和共混膜纳米纤维连续,表面光滑,直径较均匀;载药PLA静电纺丝膜在21 d左右降解;第1天DDP/PLA膜、复合膜和共混膜对CAL-27细胞杀伤作用不明显,第3天以后,DDP/PLA膜组、复合膜组及共混膜组CAL-27细胞的生存率明显降低（P<0.05）;复合膜组和共混膜组LC3-Ⅱ荧光亮度均低于DDP/PLA膜组。结论：具有缓释效果的CQ/DDP/PLA纳米静电纺丝膜提高了CAL-27细胞对DDP的敏感性,增强了DDP对口腔癌CAL-27细胞的杀伤作用。     

载氟聚碳酸丙烯酯牙贴片再矿化性能及其对小鼠成纤维L929细胞的毒性作用

目的：制备以聚碳酸丙烯酯（PPC）和氟化钠（NaF）为基础的新型PPC/NaF牙贴片,探讨其再矿化性能和体外细胞毒性,阐明不同氟含量的含氟贴片促进脱矿釉质再矿化效果,为其临床应用提供参考。方法：以PPC为载体搭载不同质量分数（0、0.5%、2.5%和5.0%） NaF,采用熔融共混法制备PPC/NaF牙贴片。将离体牙制备成釉质块试件,并根据牙贴片中氟含量的不同随机分为PPC组、0.5%PPC/NaF组、2.5%PPC/NaF组和5.0%PPC/NaF组,每组各10个样本。采用扫描电子显微镜（SEM）观察各组试件釉质表面形态表现,显微硬度仪测定脱矿前后和再矿化后各组试件釉质表面显微硬度,并计算显微硬度恢复百分比（SMHR）。将小鼠成纤维L929细胞与PPC/NaF牙贴片浸提液进行共培养,CCK-8实验检测各组小鼠成纤维L929细胞的相对增殖率（RGR）,并评估其细胞毒性等级。结果：脱矿后各组釉质试件的表面显微硬度均明显低于脱矿前（P<0.05）。经不同氟含量PPC/NaF牙贴片处理后,各组釉质试件的再矿化后表面显微硬度均明显高于再矿化前（P<0.05）,但仍低于脱矿前（P&l...     

PLGA-(PEG-ASP)n共聚物的合成与性能研究

以辛酸亚锡[Sn(Oct)2]为催化剂,聚乙二醇／L-天冬氨酸预聚物[(PEG-ASP)n]为共引发剂,引发D,L—LA和GA开环共聚合成具有功能侧氨基的PLGA-(PEGASP)n共聚物。通过FTIR、^1H—NMR、DSC、表面接触角测定和细胞培养等方法研究共聚物的结构与性能。结果表明,共聚物为典型的非晶态聚合物;共聚物的亲水性以及对骨髓基质细胞的粘附能力和粘附效率均明显优于PLGA。     

兔包皮来源的上皮细胞与人来源脱细胞羊膜基质(HAAM)组织工程共同培养细胞层片的体外研究

 目的  探讨兔包皮来源的上皮细胞与人来源脱细胞羊膜基质(human acellular amniotic membrane matrix,HAAM)组织工程共同培养细胞层片的效果。方法  将兔包皮来源的上皮细胞接种于实验组(脱细胞羊膜基质)和对照组(未脱细胞的羊膜上基质)上,待细胞在两种羊膜基质上生长至铺满表面,用活细胞示踪剂标记细胞,然后通过组织学观察上皮细胞在两种羊膜基质上的黏附及生长情况。结果  包皮来源的上皮细胞在两组羊膜基质上均能增殖生长,细胞呈单层生长,活细胞示踪剂显示细胞生长良好,并具有活细胞功能。结论  包皮来源的上皮细胞是良好的实验室组织工程化的种子细胞,脱细胞羊膜基质是良好的组织工程化尿道支架材料,该方法可成功培养上皮细胞层片,有望用于尿道重建。     

Fabrication of electrospun poly(d,l lactide-co-glycolide)80/20 scaffolds loaded with diclofenac sodium for tissue engineering

Background

Adaptation of nanotechnology into materials science has also advanced tissue engineering research. Tissues are basically composed of nanoscale structures hence making nanofibrous materials closely resemble natural fibers. Adding a drug release function to such material may further advance their use in tissue repair.

Methods

In the current study, bioabsorbable poly(d,l lactide-co-glycolide)80/20 (PDLGA80/20) was dissolved in a mixture of acetone/dimethylformamide. Twenty percent of diclofenac sodium was added to the solution. Nanofibers were manufactured using electrospinning. The morphology of the obtained scaffolds was analyzed by scanning electron microscopy (SEM). The release of the diclofenac sodium was assessed by UV/Vis spectroscopy. Mouse fibroblasts (MC3T3) were seeded on the scaffolds, and the cell attachment was evaluated with fluorescent microscopy.

Results

The thickness of electrospun nanomats was about 1 mm. SEM analysis showed that polymeric nanofibers containing drug particles formed very interconnected porous nanostructures. The average diameter of the nanofibers was 500 nm. Drug release was measured by means of UV/Vis spectroscopy. After a high start peak, the release rate decreased considerably during 11 days and lasted about 60 days. During the evaluation of the release kinetics, a material degradation process was observed. MC3T3 cells attached to the diclofenac sodium-loaded scaffold.

Conclusions

The nanofibrous porous structure made of PDLGA polymer loaded with diclofenac sodium is feasible to develop, and it may help to improve biomaterial properties for controlled tissue repair and regeneration.