人胰腺核糖核酸酶的基因克隆、蛋白表达与活性测定

目的：构建人胰腺核糖核酸酶（hpRNase）原核表达载体、获得纯化hpRNase蛋白,为构建乳腺癌单链免疫毒素奠定基础。方法：针对编码hpRNase成熟蛋白基因的cDNA序列设计相应的引物,通过反转录PCR技术,从一例胰腺切除患者的组织标本中,扩增出编码hpRNase成熟蛋白的cDNA序列,亚克隆入表达载体pPROEX—HTb;在大肠杆菌BL21中经1PTG诱导融合蛋白表达,并用镍离子交换树脂进行蛋白纯化;通过RNA水解实验验证hpRNase重组蛋白的活性。结果：经PCR、酶切、测序等方法鉴定,hpRNase cDNA正确克隆人pPROEX—HTb表达载体;IPTG可诱导载体表达分子量约20kD的蛋白产物,经Westerm blot验证可与抗hpRNase抗体发生特异性反应;经镍离子交换树脂纯化后的重组蛋白可有效降解RNA。结论：成功构建hpRNase原核表达载体,并获得有RNA降解活性的hpRNase重组蛋白,为进一步构建乳腺癌单链免疫毒素奠定了基础。     

恶性肿瘤患者血液中核糖核酸酶及核糖核酸酶抑制因子活性测定

本文测定了２６例正常中老年人（４０～６１）岁）、７８例初诊恶性肿瘤患者和８例术后恶性肿瘤患者（均为４０～６０岁）的血清酸性核糖核酸酶（ＡＣＲ）及游离碱性核糖核酸酶（ｆＡＫＲ）的活性。测定了１６例正常人（４０～６０岁）、５０例同龄的恶性肿瘤患者、１０例卵巢囊肿及７例胃溃疡患者红细胞中核糖核酸酶抑制因子（ＲＩ）的活性。结果表明，恶性肿瘤患者血清ＲＮａｓｅ活性显著高于正常对照组；恶性肿瘤组与正常组比较，红细胞中ＲＩ活性显著下降。胃溃疡及卵巢囊肿患者红细胞中的ＲＩ活性，与正常组比较，无明显差异。     

抗肝癌hdsFv融合RC-RNase重组免疫毒素的表达、纯化及活性测定

目的制备有临床应用前景的特异性高、稳定性强的新型抗肝癌重组免疫毒素。方法利用IPTG诱导抗肝癌hdsFv-RC-RNase重组免疫毒素在大肠杆菌中表达。表达产物经Ni-NTA亲合层析法纯化并复性,应用免疫细胞化学和MTT的方法分别检测其对人肝癌细胞的特异性结合和杀伤活性。结果重组免疫毒素以可溶性形式在大肠杆菌中获得表达。免疫细胞化学和细胞毒实验表明其能够特异性地结合并杀伤肝癌细胞,并且能够保持较强的稳定性。结论我们抗肝癌hdsFv-RC-RNase重组免疫毒素的成功制备,为其进一步的临床应用研究奠定了一定的实验基础。     

核糖核酸酶抑制因子基因在人乳腺癌中的表达及突变分析

目的　通过核糖核酸酶抑制因子 (ribonucleaseinhibitor,RI)基因在人乳腺癌中的表达及其是否突变的分析 ,进一步探讨RI与肿瘤细胞生长的关系。方法　采用Westernblotting方法检测人乳腺癌组织中RI的表达量 ;采用SSCP的方法分析肿瘤细胞RI基因中是否有突变。结果　人乳腺癌组织中RI的表达明显低于同体癌旁正常组织 ,但用MboI酶切及SSCP分析未发现人乳腺癌组织中RI基因有突变。结论　乳腺癌的生长可能与RI表达的下降有关 ,从而可能使癌组织周边新血管的形成未受到有效抑制的结果。     

核糖核酸酶抑制因子基因的克隆及序列测定

目的 探讨核糖核酸抑制因子基因的克隆及意义。方法 用ＲＴ－ＰＣＲ技术，从传代的人肝细胞中扩增了Ｒ１基因，并将其克隆以ｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ－Ｖｅｃｔｅｒ上。顷ＰＣＲ筛选和限制酶切鉴定，得到了正向，反向插入的阳性克隆。结果 序列分析表明，反向克隆与报道的人胎盘Ｒ１基因序列一致。结论 用ＲＴ－ＰＣＲ产物直接克隆法，得到了与人胎盘ＲＩ序列一致的阳性克隆。ＲＩ基因的成功克隆，为研究ＲＩ的表达与调控及制备基因工     

人乳腺癌组织中核糖核酸酶抑制因子基因的表达分析

背景与目的:核糖核酸酶抑制因子(ribonucleaseinhibitor,RI)是一种多功能的酸性糖蛋白,人胎盘中富含RI。我们的前期研究表明,从人胎盘中提纯的RI能明显抑制小鼠某些实体瘤(S180肉瘤、Ca761乳腺癌和H22肝癌)的生长。本研究的目的是观察人乳腺癌组织中RI基因的表达水平。方法:采用RT-PCR及毛细管电泳(capillaryelectrophoresis,CE)法检测人乳腺癌组织中RImRNA的表达水平,采用Westernblot方法检测人乳腺癌组织中RI的含量。结果:与对照乳腺组织相比,乳腺癌组织RT-PCR产物的电泳条带较窄;乳腺癌组织Westernblot的斑点较小。乳腺癌组织RT-PCR产物毛细管电泳吸收曲线峰高及峰宽明显小于对照乳腺组织;乳腺癌组织和对照乳腺组织RT-PCR产物毛细管电泳吸收峰面积积分值分别是(3.320±0.365)×106和(4.385±0.880)×106,两组间比较有显著性差异(P<0.01)。结论:与正常乳腺组织相比,人乳腺癌组织中RImRNA表达水平明显降低,RI蛋白含量也明显减少,表明人乳腺癌组织中RI基因表达明显下调。     

核糖核酸酶含量测定作为乳腺肿瘤标志物的探索

以204例正常人,91例良性乳腺疾病患者为对照组,测定和分析了45例恶性乳腺肿瘤患者和32例乳腺癌癌前病变(22例乳腺囊性增生,10例乳腺导管上皮不典型增生)患者血清、尿液核糖核酸酶(RNase)含量及其部分乳腺癌患者术前后RNase含量的变化.结果表明:恶性肿瘤组RNase水平明显高于对照组,癌前病变组亦明显高于对照组,乳腺癌术后RNase含量较术前明显降低.提示RNase是乳腺肿瘤的良好标志物,测定RNase水平对乳腺癌早期诊断、鉴别诊断以及确定乳腺癌高发人群确有一定意义,同时可作为估计疗效的一项良好指标.     

牛蛙核糖核酸酶的表达和鉴定及功能检测

目的：在大肠埃希菌中高效表达牛蛙核糖核酸酶（rana catesbeiana ribonuclease，RC-RNase），并对其纯化产物进行噻唑蓝（tetrazolium blue，MTT）实验，观察对肝癌细胞的抑制效果。方法：用异丙基硫代-D-半乳糖苷（isopropylthio-D-galactoride，IPTG）诱导原核表达质粒PET32a—RC-RNase在大肠埃希菌F．cali B121（DE3）plysS中表达。茴体经超声、离心后，用Ni—NTA Agarose亲和层析法对包涵体进行纯化。采用MTT法检测纯化的目的蛋白对体外培养的肝癌细胞的杀伤活性。结果：纯化的目的蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium doecyls ulphatepolyacrylamide gel eletrophoresis，SDSPAGE）蛋白电泳表明，RC-RNase在大肠埃希菌中是以包涵体的形式表迭。用MXT法的结果中可以看出，纯化的目的蛋白对体外培养的肝癌细胞具有一定的抑制效果，其IC50值（半抑制浓度）是22．44μg／mL，。结论：牛蛙核糖核酸酶在大肠埃希菌中得到大量表达，为进一步研究其生物学特性以及功能打下了良好的基础。     

牛蛙核糖核酸酶在大肠杆菌中的高效表达及其初步纯化

目的:利用大肠杆菌系统表达重组RC蛳RNase融合蛋白,并对其表达产物进行初步纯化。方法:以PCR方法扩增出RC蛳RNase基因,插入到融合蛋白原核表达载体PET32a中,构建重组表达载体PET蛳RC蛳RNase,转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)plyS,利用异丙基硫代蛳β蛳D蛳半乳糖苷(IPTG)诱导表达。工程菌经超声碎菌,离心后,采用Ni亲合层析法在变性条件下进行初步纯化。结果:经IPTG诱导后,SDS蛳PAGE和免疫印迹分析显示,工程菌在相对分子质量为3.1×104处出现一条新生蛋白带,目的蛋白占菌体总蛋白的34%,主要以包涵体形式存在。所得包涵体经纯化,纯度可达90%以上。结论:重组融合蛋白RC蛳RNase在大肠杆菌中获得成功表达,纯化效果令人满意,为进一步研究其生物学特性和功能奠定了良好的基础。     

牛蛙核糖核酸酶的表达和鉴定及功能检测

目的:在大肠埃希菌中高效表达牛蛙核糖核酸酶(ranacatesbeianaribonuclease,RCRNase),并对其纯化产物进行噻唑蓝(tetrazoliumblue,MTT)实验,观察对肝癌细胞的抑制效果。方法:用异丙基硫代D半乳糖苷(isopropylthioDgalactoride,IPTG)诱导原核表达质粒PET32aRCRNase在大肠埃希菌E.coliBl21(DE3)plysS中表达。菌体经超声、离心后,用NiNTAAgarose亲和层析法对包涵体进行纯化。采用MTT法检测纯化的目的蛋白对体外培养的肝癌细胞的杀伤活性。结果:纯化的目的蛋白经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecylsulphatepolyacrylamidegeleletrophoresis,SDSPAGE)蛋白电泳表明,RCRNase在大肠埃希菌中是以包涵体的形式表达。用MTT法的结果中可以看出,纯化的目的蛋白对体外培养的肝癌细胞具有一定的抑制效果,其IC50值(半抑制浓度)是22.44μg/mL。结论:牛蛙核糖核酸酶在大肠埃希菌中得到大量表达,为进一步研究其生物学特性以及功能打下了良好的基础。     

原核表达重组质粒pUC57－CTP－PTEN的构建及鉴定

目的：合成基因CTP及PTEN基因,构建其原核表达重组质粒pUC57－CTP－PTEN,为后续研究其功能做准备。方法：合成基因CTP－PTEN,将该基因定向克隆到原核表达载体pUC57中,构建pUC57－CTP－PTEN重组质粒,转化大肠杆菌DH5α菌株,抽提质粒进行双酶切、测序鉴定后,用Western blotting检验表达。结果：测序鉴定CTP－PTEN基因合成成功。经双酶切、测序鉴定证实重组质粒pUC57－CTP－PTEN 成功转入DH5α,Western blotting检验pUC57－CTP－PTEN成功表达。结论：成功构建了重组质粒pUC57－CTP－PTEN,并在大肠杆菌DH5α中成功表达。     

SRG基因的克隆及原核表达

目的克隆SRG基因、原核表达并鉴定。方法从培养的人骨肉瘤细胞SOSP-9607中提取总RNA,经RT-PCR获得SRG基因。将该基因克隆到pGEM-T-Easy克隆载体中,测序、鉴定。将测序正确的SRG基因亚克隆到pET-28(a )表达载体中,构建SRG表达载体,IPTG诱导表达2h~6h,做SDS-PAGE分析,鉴定SRG蛋白的表达。结果DNA测序证明,获得了SRG基因,其序列与GenBank中报道序列完全一致。SDS-PAGE分析表明,SRG蛋白获得高效表达,其相对分子质量为22kDa,表达量约占菌体总蛋白的25%。结论SRG基因的克隆和表达均获得了成功,为进一步探讨SRG基因在骨肉瘤诊治中应用奠定了基础。     

非小细胞肺癌T7噬菌体展示文库的构建

Objective: Currently, only a limited numbers of tumor markers for non small lung cancer (NSCLC) diagnosis, new biomarker, such as serum autoantibodies may improve the early detection of lung cancer. Our objective is construction human lung squamous carcinoma and adenocercinoma T7 phage display cDNA library from the tissues of NSCLC patients. Methods: mRNA was isolated from a pool of total RNA extract from NSCLC tissues obtained from 5 adenocarcinomas and 5 squamous carcinomas, and then mRNA was reverse transcribed into double stranded cDNA. After digestion, the cDNA was inserted into T7Select 10-3 vector. The phage display cDNA library was constructed by package reaction in vitro and plate proliferation. Plaque assay and PCR were used to evaluate the library. Results: Two T7 phage display cDNA library were established. Plaque assay show the titer of lung squamas carcinoma library was 1.8×106 pfu, and the adenocarcinoma library was 5×106pfu. The phage titer of the amplified library were 3.2×1010 pfu/mL and 2.5 x 1010 pfu/mL. PCR amplifica-tion of random plaque show insert ratio were 100% (24/24) in adenocarcinorna library and 95.8% in human lung squamas carcinoma library (23/24). Insert range from 300 bp to 1 500 bp. Conclusion: Two phage display cDNA library from NSCLC were constructed.     

hSesn3基因真核表达载体的构建及在骨肉瘤细胞中的蛋白表达和定位

目的:通过构建人Sesn3真核表达载体同时证实融合蛋白在细胞中的表达及定位.方法:提取Hela工具细胞的mRNA,反转录至cDNA.进一步通过PCR来扩增人Sesn3基因的cDNA全长片段,并将其亚克隆于pEGFP-C1真核表达载体中,进而将构建的重组质粒进行酶切及测序鉴定,转染到MG-63骨肉瘤细胞中,获取细胞总蛋白,通过Western blot方法检测表达.进一步利用激光共聚焦扫描显微镜方法观察MG-63细胞内pEGFP-hSesn3的定位,最后利用免疫沉淀方法纯化人源hSesn3蛋白.结果:hSesn3基因cDNA全长片段克隆于真核表达载体pEGFP-C1中,酶切鉴定片段为1 410 bp,并成功测序.Western blot检测到了GFP-hSesn3融合蛋白表达,分子量约为79 kDa.在MG-63细胞中pEGFP-hSesn3主要定位于细胞质,进一步成功纯化了hSesn3蛋白.结论:成功构建了hSesn3基因cDNA全长的真核表达载体,在MG-63细胞中pEGFP-hSesn3蛋白主要定位于细胞质,最终成功纯化了hSesn3蛋白.     

人NIT1基因原核表达载体的构建和鉴定

背景与目的目前已知FHIT基因为抑癌基因，其结构和功能的异常与肺癌的发生、发展有密切关系，而且可能与NIT1基因存在功能上的相关性。但是．FHIT基因与NIT1基因调控肺癌发生发展的分子机制尚未明了。本研究旨在构建人NIT1基因原核表达载体．为进一步研究人肺癌细胞株中NIT1基因和FHIT基因的关系打下基础。方法应用RT—PCR法获得NIT1基因cDNA．定向克隆到融合表达载体pET-32a中．作双酶切和测序鉴定。结果①克隆的cDNA片断包含了人NIT1基因翻译区的全部序列，翻译区序列与GenBank登录的人NIT1 cDNA序列完全一致。②对构建的原核表达载体做双酶切．获得了预期的目的条带。结论通过RT—PCR和定向克隆的方法．成功构建了人NIT1基因的原核表达载体，为研究人NIT1蛋白的表达和进一步研究人肺癌细胞中NIT1基因和抑癌基因FHIT的关系奠定了基础。     

MicroRNA-378真核表达质粒的构建及鉴定

目的：构建microRNA-378（miR-378）真核表达质粒pcDNATM6.2-GW/±EmGFP-miR378。方法：根据miRBase提供的序列合成miR378前体序列,退火形成双链后,插入真核表达质粒pcDNATM6.2-GW/±EmGFP-miR,构建pcDNATM6.2-GW/±EmGFP-miR378。进行酶切和测序鉴定后,转染人胃癌细胞株SGC-7901,应用实时定量PCR检测转染后miR378的表达量。结果：pcDNATM6.2-GW/±EmGFP-miR378的酶切、测序表明与设计一致,实时定量PCR证实转染pcDNATM6.2-GW/±EmGFP-miR378能够上调miR378的表达水平。结论：成功构建了miR378真核表达质粒pcDNATM6.2-GW/±EmGFP-miR378,为进一步探讨miR378在胃癌中的作用奠定了基础。     

胰腺癌伴淋巴结转移的基因芯片研究

目的 利用基因芯片技术分析伴与不伴淋巴结转移胰腺癌组织中的差异表达基因。方法 将4000个人类全长基因的PCR产物点样于特殊处理后的玻片上制备基因芯片。用逆转录的方法,分别将两种荧光Cy3-dUTP和Cyt-dUTP标记正常胰腺组织和胰腺癌组织mRNA,以制备cDNA探针,并与芯片杂交。以ScanArray 3000荧光扫描仪扫描芯片上两种荧光信号,获得的荧光信号图像用计算机分析。每点上两种荧光信号的强度分别代表Cy3-dUTP和Cy5-dUTP的量。最后,计算每点的Cy5和Cy3比值。结果 在所检测的2例伴淋巴结转移和2例不伴淋巴结转移的胰腺癌标本中,56个基因（其中包括24个已知基因）有表达差异。结论 基因芯片技术为阐明人类胰腺癌伴淋巴结转移的特异性基因表达提供了有效方法。     

Human pancreatic ribonuclease 1: expression and distribution in pancreatic adenocarcinoma

BACKGROUND: Human pancreatic ribonuclease (RNase 1) is a pancreatic enzyme that is present at high levels in the serum of most patients with pancreatic adenocarcinoma. For this reason, the authors studied its patterns of expression at the single-cell level in pancreatic adenocarcinoma tissues by immunohistochemical analysis and in situ hybridization (ISH). METHODS: Immunohistochemical analysis with polyclonal antibodies against RNase 1 and by ISH with digoxigenin-labeled RNase 1 probe were used to detect RNase 1 in the neoplastic cells of ductal type pancreatic adenocarcinomas. RESULTS: Fifteen of 18 carcinoma samples were positive for RNase 1, demonstrating that the expression of ribonuclease that the authors observed previously in human pancreatic adenocarcinoma cell lines was not an artifact of cell culture. The authors also found RNase 1 in some of the metaplastic ducts and atrophic islets in 4 of 6 chronic pancreatitis samples, and they observed RNase 1 immunostaining in hyperplastic ducts adjacent to one of the well-differentiated adenocarcinomas. CONCLUSIONS: The expression levels of RNase 1 by tumor cells from pancreatic adenocarcinomas are consistent with the high RNase 1 levels found in the serum of most patients with pancreatic adenocarcinoma. This expression of RNase 1, which is an acinar protein, demonstrates that the patterns of gene expression in pancreatic adenocarcinoma are distinct from those of normal pancreatic duct cells. Conversely, RNase 1 expression levels in altered ductal cells from some chronic pancreatitis tissues and hyperplastic ducts from carcinoma tissues suggest that abnormal expression levels may be an early event in pancreatic tumorigenesis.     

人FL基因表达载体的构建及其体内外生物活性的研究

目的:构建人Flt3配基的胞外区表达载体pCDNA3FL,并在体内外对其表达率及活性进行检测。方法:从健康人单核细胞中反转录PCR扩增FLcDNA胞外区片段,并进行测序,构建表达载体pCDNA3FL,测定pCDNA3FL转染H22细胞后及经小鼠尾静脉注射后hFL表达量。结果:测序结果表明,所扩增、克隆的靶序列正确,Western结果证实pCDNA3FL能正确表达hFL蛋白。ELISA结果表明表达载体pCDNA3FL在体外H22细胞中的瞬时表达量为5.9ng/ml。小鼠经尾静脉注射pCDNA3FL载体后血浆中的hFL蛋白最高含量为36μg/ml,外周血中CD3 、CD4 、CD8 、CD34 细胞亚群的比率均有不同程度的提高。结论:成功构建了表达载体pCDNA3FL,为构建肿瘤细胞瘤苗创造了条件。