人胰腺核糖核酸酶的基因克隆、蛋白表达与活性测定

目的：构建人胰腺核糖核酸酶（hpRNase）原核表达载体、获得纯化hpRNase蛋白,为构建乳腺癌单链免疫毒素奠定基础。方法：针对编码hpRNase成熟蛋白基因的cDNA序列设计相应的引物,通过反转录PCR技术,从一例胰腺切除患者的组织标本中,扩增出编码hpRNase成熟蛋白的cDNA序列,亚克隆入表达载体pPROEX—HTb;在大肠杆菌BL21中经1PTG诱导融合蛋白表达,并用镍离子交换树脂进行蛋白纯化;通过RNA水解实验验证hpRNase重组蛋白的活性。结果：经PCR、酶切、测序等方法鉴定,hpRNase cDNA正确克隆人pPROEX—HTb表达载体;IPTG可诱导载体表达分子量约20kD的蛋白产物,经Westerm blot验证可与抗hpRNase抗体发生特异性反应;经镍离子交换树脂纯化后的重组蛋白可有效降解RNA。结论：成功构建hpRNase原核表达载体,并获得有RNA降解活性的hpRNase重组蛋白,为进一步构建乳腺癌单链免疫毒素奠定了基础。     

截短的食管癌相关基因ECRG4在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化

目的本实验旨在构建ECRG4的原核表达载体，在大肠杆菌中表达并纯化ECRG4所编码的蛋白，为进一步研究奠定基础。方法将ECRG4基因序列前端编码疏水性跨膜区28个氨基酸的cDNA序列截去，再将截短的cDNA序列克隆到原核表达载体Pet30（＋）上，重组表达载体转化感受态表达菌株BL21（DE3），低浓度IPTG低温诱导融合蛋白的表达。采用Western blot鉴定目的蛋白的表达，使用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化。结果构建了截短的ECRG4．pET30a（＋）基因的原核表达载体，IPTG低温诱导得到大量可溶性蛋白，并且通过亲和层析纯化了重组融合蛋白。结论成功获得了高效表达的、具有一定的生物学活性的ECRG4原核表达产物，并为进一步研究ECRG4的结构和功能打下基础。     

基因工程技术获取重组人血小板因子4

目的：用基因工程方法获取重组人血小板因子4（rhPF4）,为下一步基础理论研究和临床应用奠定基础。方法：PCR方法获得人PF4编码序列,克隆入质粒pRSET,构建融合表达载体pRSET—PF4,转化大肠杆菌,以IPTG诱导表达融合的人PF4蛋白,经镍柱亲和层析纯化,SDS—PAGE分析所表达的目的蛋白及纯化后蛋白。结果：成功构建了表达载体pRSET—PF4,DNA序列测定结果与预期结果一致。IPTG诱导表达的rh—PF4融合蛋白部分以可溶形式存在,占菌体总蛋白量的11％。亲和层析纯化后目的蛋白纯度为84％。结论：获得原核基因工程表达的rhPF4蛋白。     

FasL基因构建蛋白表达及其对胃癌细胞株BGC823和MGC803生长的影响

目的:构建适于原核表达的重组蛋白FasL表达载体,并进行重组蛋白的表达纯化及抗肿瘤活性分析.方法:获得人FasL cDNA全序列,将其分段设计引物,通过重叠PCR获得FasL基因.构建pGEX-5X-1/FasL表达载体.转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,GST柱纯化.采用MTT比色法、流式细胞法检测融合蛋白对胃癌细胞的作用.结果:通过重叠PCR获得了编码正确氨基酸序列的目的基因.表达的目的蛋白表达量占菌体总蛋白的30%以上.纯化后,蛋白纯度达95%rX上.MTT比色法与流式细胞技术均表明纯化的融合蛋白能抑制胃癌细胞株BGC823和MGC803的生长,诱导其调亡增加.结论:重组蛋白FasL表达载体的成功构建、表达、纯化及活性分析,为进一步的抗肿瘤功能研究奠定了基础.     

人B细胞成熟抗原的克隆、表达及纯化

目的构建人B细胞成熟抗原（BCMA）原核表达质粒,表达BCMA融合蛋白。方法通过RT—PCR方法从人B淋巴瘤Raji总RNA中扩增BCMA的全长cDNA,并插入原核表达载体PGEX4T-1的BamHI和NotⅠ酶切位点,构建原核表达载体PGEX4T-1-BCMA,利用酶切和序列分析方法验证所构建质粒的正确性。在大肠杆菌中表达BCMA融合蛋白,并经谷胱甘肽-S-转移酶（GST）亲和柱纯化。纯化后的产物经过SDS—PAGE、Westernblot检测目的蛋白的表达情况。结果Bam HI／Notl双酶切证明重组质粒中含有目的大小的BCMA基因片段,序列分析证明重组质粒中插入片段的碱基序列均完全正确。将所构建的PGEX4T-1-BCMA质粒转染感受态DH5ct,IPTG诱导表达后超声裂解菌体,上清经GST亲和纯化,经SDS—PAGE、抗GST和BCMA抗体Westernblot分析,证实融合表达蛋白为GST—BCMA融合蛋白。结论成功构建了BCMA原核表达载体,重组质粒能够在原核表达系统中可溶性表达GST—BCMA融合蛋白,为进一步研究BCMA的生物学功能奠定了基础。     

人NKp44基因克隆及其在大肠埃希菌中的表达和纯化

目的:对人NKp44进行基因克隆及其在大肠埃希菌中重组表达,为进一步研究NK细胞抗肿瘤作用奠定基础。方法:提取人外周静脉血单个核细胞,培养并加入IL-2进行诱导后收集细胞,分离纯化外周血总RNA。用巢式PCR扩增hNKp44片段(约860bp),克隆至质粒载体pMD18-T,并对克隆的DNA片段进行序列分析。用限制酶EcoRⅠ和NcoⅠ消化pMD18-T-hNKp44重组质粒,分离hNKp44片段,并插入原核表达载体pET30a(+)的相应限制酶位点,酶谱分析鉴定重组表达载体pET30a(+)-hNKp44。转化菌株BL21(DE3)经IPTG诱导,用SDS-PAGE和WesternBlot鉴定表达的重组蛋白。采用His.BindPurificationKit对重组蛋白进行纯化。结果:巢式PCR扩增的DNA片段与hNKp44cDNA大小一致。重组质粒pMD18-T-hNKp44的DNA序列分析显示,克隆的DNA序列与文献报道的hNKp44的cDNA序列一致。SDS-PAGE表明,重组蛋白相对分子质量为35.4×103,其表达量达菌体总蛋白的40%左右。WesternBlot分析显示,重组蛋白能特异地与抗His.Tag抗体结合。纯化得到纯度为95%的重组蛋白,纯化回收率达40%。结论:已经成功地构建了表达重组hNKp44的工程菌株。     

精胺/精眯N1-乙酰基转移酶重组蛋白的原核表达及其抗体制备

目的 探讨精胺/精眯N¹乙酰基转移酶（SSAT）的原核表达及抗SSAT多克隆抗体的制备。方法 RT-PCR法从人肺癌细胞总RNA中克隆SSAT cDNA后,构建SSAT原核表达质粒pET15b/SSAT并转化BL21(DE3)大肠杆菌细胞。SSAT重组蛋白经IPTG诱导表达后,利用PAGE凝胶纯化和Ni-NTA亲和层析纯化。用凝胶纯化的SSAT重组蛋白免疫家兔以制备抗SSAT多克隆抗体,所得抗体的特异性及效价用Western blot和ELISA技术检测。结果 SSAT重组蛋白可在大肠杆菌中诱导性高表达,用此蛋白免疫动物所得的SSAT抗体的效价以及特异性均较高。结论 建立了SSAT原核表达系统并成功制备出SSAT多克隆抗体。     

基因工程技术获取重组人血小板因子4

目的:用基因工程方法获取重组人血小板因子4(rhPF4),为下一步基础理论研究和临床应用奠定基础.方法:PCR方法获得人PF4编码序列,克隆入质粒pRSET,构建融合表达载体pRSET-PF4,转化大肠杆菌,以IPTG诱导表达融合的人PF4蛋白,经镍柱亲和层析纯化,SDS-PAGE分析所表达的目的蛋白及纯化后蛋白.结果:成功构建了表达载体pRSET-PF4,DNA序列测定结果与预期结果一致.IPTG诱导表达的rhPF4融合蛋白部分以可溶形式存在,占菌体总蛋白量的11%.亲和层析纯化后目的蛋白纯度为84%.结论:获得原核基因工程表达的rhPF4蛋白.     

精胺/精眯N1-乙酰基转移酶重组蛋白的原核表达及其抗体制备

目的 探讨精胺/精眯N1乙酰基转移酶(SSAT)的原核表达及抗SSAT多克隆抗体的制备.方法 RT-PCR法从人肺癌细胞总RNA中克隆SSAT cDNA后,构建SSAT原核表达质粒pET15b/SSAT并转化BL21(DE3)大肠杆茵细胞.SSAT重组蛋白经IPTG诱导表达后,利用PAGE凝胶纯化和Ni-NTA亲和层析纯化.用凝胶纯化的SSAT重组蛋白免疫家兔以制备抗SSAT多克隆抗体,所得抗体的特异性及效价用Western blot和ELISA技术检测.结果 SSAT重组蛋白可在大肠杆茵中诱导性高表达,用此蛋白免疫动物所得的SSAT抗体的效价以及特异性均较高.结论 建立了SSAT原核表达系统并成功制备出SSAT多克隆抗体.     

人热休克蛋白70的原核表达和纯化的实验研究

目的在大肠杆菌中表达人源性热休克蛋白70基因并纯化表达产物。方法以人HSP0 cDNA为模板,采用PCR方法进行扩增,将PCR产物克隆到表达载体pET30a上,将重组质粒pET30a-HSP70转化大肠杆菌BL21上,经IPTG诱导后,表达产物进行SDS-PAGE及Western blot验证并纯化。结果应用PCR方法扩增出约1900bp的目的片段;经酶切鉴定和DNA测序证实,HSP70基因成功地克隆到原核表达载体pET-30a上;转入重组质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE,发现在分子量约为70kD处有蛋白表达,Western blot证实其为目的蛋白,纯化后的HSP70纯度达到90%以上。结论在大肠杆菌中已成功地表达了HSP70蛋白并且经过纯化,为研究HSP70的结构、功能及临床应用提供了必要条件。     

PEA-15真核表达载体的构建及表达

目的构建PEA-15真核表达载体pcDNA3．1-PEA-15,并在人类食管癌细胞（EC-109）中表达。探讨PEA-15对EC．109细胞的影响。方法采用反转录聚合酶链反应（RT—PCR）技术检测EC-109细胞中的PEA-15基因表达。构建重组真核表达载体pcDNA3．1-PEA-15。酶切及测序鉴定重组质粒正确后,脂质体介导转染至EC-109细胞中。采用RT—PCR、Westernblot法检测基因及蛋白表达。四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞生长抑制率。结果RT—PCR显示PEA-15在EC-109细胞中表达。PCR扩增片段与预期片段大小相符,测序结果表明真核表达载体pcDNA3．1-PEA-15构建成功。转染后的细胞中PEA-15表达均增加（t值分别为4．078、5．269,均P〈0．05）。转染质粒72h后,细胞的生长抑制率较转染空质粒组降低[（7．12±0．86）％、（12．55±1．78）％,t=6．163,P〈0．05]。结论成功构建重组真核表达载体pcDNA3．I-PEA-15,并在EC-109细胞中进行了表达;转染后对食管癌细胞生长有促进作用,其表达可能促进食管癌的发生。     

肿瘤及胚胎特异表达蛋白CEP65的真核细胞表达及其细胞定位

背景与目的:既往研究表明,肿瘤相关抗原CEP65(cancer and em bryoexpression protein65)仅表达于肿瘤和胚胎组织,本研究拟揭示CEP65在细胞中的分布,为进一步阐明CEP65在肿瘤发生、发展中的功能奠定基础。方法:构建肿瘤及胚胎特异表达基因Cep65与GST融合表达的真核表达质粒,通过DEAE-Dextran方法转染COS7细胞,分离细胞的胞浆蛋白和核蛋白,W estern blot检测CEP65在细胞中的分布情况。构建Cep65与红色荧光蛋白基因融合表达的真核表达质粒,转染细胞后,利用荧光显微镜观察CEP65在细胞中的分布。结果:通过细胞组分生化分析分离细胞胞浆蛋白和核蛋白,W estern blot检测结果表明,表达的CEP65分布在细胞浆和细胞核中。荧光蛋白定位进一步分析发现,转染单纯荧光蛋白表达质粒的细胞,其荧光在细胞内呈弥散性分布,而转染CEP65与荧光蛋白基因融合表达质粒的细胞,在细胞质及细胞核内形成聚集的荧光颗粒。结论:CEP65可在COS7细胞中高效表达,其表达产物存在于细胞质和细胞核内;CEP65可能是一种核相关蛋白。     

血液肿瘤基因表达和基因表达模式研究进展

基因表达失调与血液肿瘤的生物学特性、治疗反应和预后密切相关。近年迅速发展的转录组测序、单细胞转录组测序等技术为发现疾病诊疗相关的标志性基因和研究基因表达模式提供了强有力的工具。文章结合第62届美国血液学会(ASH)年会中的报道介绍相关研究进展。     

Nucleostemin基因荧光真核表达载体构建及表达特性

目的:构建Nucleostemin(NS)基因真核表达载体,并在COS-7细胞中表达.方法: 设计引物在肺癌细胞株(LTEP-a-2)中扩增NS全长cDNA片段,插入pMD-18T 质粒中得pMD-18T-NS载体,并测序;再将pMD-18T-NS质粒经酶切后导入真核表达载体pcDNA3.1(+)-GFP质粒中,构建pcDNA3.1(+)-GFP-NS载体,并检测其真核表达情况.结果: 经RT-PCR扩增得到1 650 bp的全长NS cDNA片段,酶切及测序后鉴定证明pMD-18T-NS构建成功.pcDNA3.1(+)-G-FP-NS载体转染COS-7细胞经蛋白印迹及激光共聚焦显微镜检测显示,该GFP-N-S融合基因在COS-7细胞中获得较好表达.转染后见该基因定位于核仁,细胞逐渐失去黏附贴壁的特性,细胞的增殖受阻;稳定表达(4～20周)后,细胞形态发生改变,体积增大,核增多,细胞成瘤细胞样改变.结论: 成功构建pcDNA3.1(+)-GF-P-NS真核表达载体,并在COS-7细胞中有效表达;NS基因在COS-7发生瘤样改变过程中发挥着重要作用,可能与肿瘤发生密切相关.     

真核表达载体pEGFP-N1-Ubc9的构建及表达

目的：克隆人类Ubc9基因cDNA全长,构建Ubc9的真核表达载体并表达。方法：采用RT-PCR技术从人小细胞肺癌NCI-H446细胞总RNA中扩增Ubc9 cDNA基因片段,经过酶切鉴定后,克隆至pUCM-T载体,测序证实碱基序列无误后,再克隆至真核绿色荧光蛋白表达载体（pEGFP-N1）上,并转染到真核细胞,观察其在真核细胞中的表达。结果：测序证实克隆的Ubc9全长cDNA阅读框正确完整,酶切和序列测定证实Ubc9正确插入pEGFP-N1载体中,该重组载体能够在真核细胞中表达。结论：成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-Ubc9。     

小鼠白介素-12真核表达质粒的构建及其表达

目的:构建能在真核细胞内稳定表达小鼠白介素-12(mIL-12)的质粒,为进一步研究mIL-12的免疫调节机制及其抗肿瘤作用奠定基础。方法:通过聚合酶链反应(PCR)扩增质粒pORF-mIL-12(Elas-ti),双酶切后将目的片段mIL-12连接到真核表达载体pcDNA3.1( )质粒上,mIL-12受pcDNA3.1( )中mCMV启动子驱动,将mIL-12全长转录至同一mRNA上,对重组质粒进行鉴定后将其转染小鼠Lewis肺癌细胞(LLC)测其表达。结果:PCR成功扩增出mIL-12片段,PCR鉴定、酶切鉴定及测序均证实pcDNA3.1( )-mIL-12质粒构建成功,RT-PCR及ELISA证实重组质粒在mRNA及蛋白质水平均高表达mIL-12。结论:pcDNA3.1( )-mIL-12真核表达质粒构建成功并能在LLC细胞中稳定表达。     

哺乳动物细胞CDK2系列表达载体的构建与表达

目的：构建一系列细胞周期蛋白依赖激酶2（cyclin-dependent kinase 2,CDK2）在哺乳动物细胞的表达载体,为研究CDK2的功能和修饰提供实验材料。方法：从食管癌细胞中提取总RNA,逆转录PCR扩增CDK2编码区,然后将PCR产物克隆到T载体;扩增后的CDK2片段分别亚克隆入pcDNA3、pcDNA4、pNTAP和pEGFP等4种哺乳动物表达载体;最后,将获得的表达载体PEGFP/CDK2转染小鼠成纤维细胞NIH3T3进行初步的CDK2表达分析。结果：RT-PCR扩增获得约900 bp的目的片段,经T载体克隆和DNA序列分析,显示重组片段是人CDK2基因序列;CDK2片段分别亚克隆入上述4种载体后获得相应表达载体;运用构建的PEGFP/CDK2表达载体,在NIH3T3细胞中表达出CDK2蛋白。结论：成功构建了CDK2的哺乳动物细胞系列表达载体,并在NIH3T3细胞中成功表达目的蛋白。     

真核表达载体pEGFP-N1-Ubc9的构建及表达

目的:克隆人类Ubc9基因cDNA全长,构建Ubc9的真核表达载体并表达。方法:采用RT-PCR技术从人小细胞肺癌NCI-H446细胞总RNA中扩增Ubc9 cDNA基因片段,经过酶切鉴定后,克隆至pUCM-T载体,测序证实碱基序列无误后,再克隆至真核绿色荧光蛋白表达载体(pEGFP-N1)上,并转染到真核细胞,观察其在真核细胞中的表达。结果:测序证实克隆的Ubc9全长cDNA阅读框正确完整,酶切和序列测定证实Ubc9正确插入pEGFP-N1载体中,该重组载体能够在真核细胞中表达。结论:成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-Ubc9。