IL-18基因转染对小鼠卵巢癌OVHM细胞免疫生物学特性的影响

目的 分析转染IL-18基因后,小鼠卵巢癌OVHM细胞的IL-18 mRNA及蛋白表达、培养上清中IL-18含量、IFN-γ诱生能力等免疫生物学特性的变化,初步探讨IL-18基因转染治疗卵巢癌的应用价值.方法 将逆转录病毒携带的小鼠活性IL-18基因转染至OVHM(OVHM/IL-18),以空载体转染的OVHM(OVHM/LXSN)和野生型OVHM作为对照.分别采用RT-PCR及免疫细胞染色法检测3组细胞的IL-18 mRNA及蛋白表达;ELISA方法测定细胞培养上清中IL-18的含量、及其诱生小鼠脾细胞产生IFN-γ的能力.结果 OVHM/IL-18细胞中可检测到IL-18 mRNA及蛋白的表达,而OVHM/LXSN和野生型OVHM细胞中未见表达.OVHM/IL-18细胞可分泌IL-18,于培养24 h时达高峰(138.25 pg/mL±12.36 pg/mL),之后逐渐减弱;OVHM/LXSN和野生型OVHM细胞上清中未检测出IL-18.0VHM/IL-18细胞培养上清诱生IFN-γ的水平明显高于VHM/KXSN和野生型OVHM细胞(分别为33.84 pg/mL±2.36 pg/mL、18.80 pg/mL±1.06 pg/mL、18.43 pg/mL±2.64 pg/mL,P<0.01),VHM/LXSN与野生型OVHM细胞之间未见显著差异(P0.05).结论 IL-18基因转染可有效提高小鼠卵巢癌细胞IL-18mRNA的表达及其蛋白的合成释放、诱导小鼠脾细胞产生IFN-γ.IL-18基因转染可纠正肿瘤细胞的IL-18低表达状态,诱导IL-18的抗瘤效应,可能对抑制肿瘤生长、促进肿瘤消退有一定的应用价值.     

Kail/CD82基因转染对结肠癌细胞株LoVo生物学特性的影响

目的　探讨Kail/CD82对LoVo细胞株生长、黏附、分离与侵袭能力的影响。方法　转染KailcDNA ,建立稳定Kail表达克隆株。采用体外实验的方法 ,绘制转染细胞与对照细胞的生长曲线 ,并检测其黏附、聚集、分离与侵袭能力 ,对比有无差别。结果　与对照细胞相比 ,转染对LoVo细胞的生长无明显影响 ;震荡 10、2 0、3 0、40min时 ,转染细胞与空白对照细胞的黏附细胞数 (× 10 5 )分别为0 0 8、0 63、0 83、0 91和 0 0 4、0 48、0 71、0 82 ,其中震荡 2 0、3 0与 40min时二者差异有显著性 (P <0 0 5) ;震荡 5、10、15min时 ,转染细胞与空白对照细胞的脱落率分别为 13 %、2 0 %、53 %和 11%、2 8%、60 % ,其中震荡 10与 15min时二者的差异有统计学意义 (P <0 0 5) ;5h的温和震荡后 ,转染细胞的聚集体形成率较空白对照细胞为高 (64 8%和 58 6% ,P <0 0 5) ;1d共培养后 ,转染细胞穿过内皮细胞的数目较空白对照细胞的少 (6 3 3 /视野和 17 67/视野 ,P <0 0 5) ;总之 ,转染可以增强细胞的黏附与聚集能力 ,降低其分离与侵袭能力。结论　Kail/CD82对结肠癌细胞的转移力具有抑制作用     

DPC4基因转染结肠癌细胞对VEGF表达的影响

目的研究DPC4基因转染人结肠癌细胞株SW620对血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响.方法利用DNA的限制性内切酶双酶切技术鉴定重组质粒PCDNA3.1-DPC4;利用脂质体介导转染技术和G418筛选得到稳定表达Smad4蛋白的DPC+4-SW620(PCDNA3.1-DPC4转染的SW620高转移性结肠癌细胞株)细胞模型;采用Western blot检测细胞中Smad4的表达;采用ELISA检测细胞上清液中VEGF的蛋白表达量;采用半定量逆转录多聚酶链反应RT-PCR技术检测细胞中VEGF的mRNA表达量.结果阳性质粒组DPC+4-SW620细胞的Smad4蛋白表达强于空白质粒组PCDNA3.1-SW620和未转染组SW620;DPC+4-SW620组细胞上清液VEGF蛋白分泌明显减少,与PCDNA3.1-SW620组和SW620组比较差异有显著性(P＜0.05),DPC+4-SW620组细胞与PCDNA3.1-SW620组细胞中VEGF mRNA半定量结果和SW620组比较,其表达量分别下降28.3%和4.5%.结论 DPC4可抑制人结肠癌细胞株SW620中VEGF的表达.     

腺病毒介导重组人单链IL-27融合基因在肝癌细胞的表达及活性鉴定

目的:利用腺病毒表达系统在肝癌细胞表达有生物活性的单链重组人白细胞介素-27(rhscIL-27)并检测其生物学活性。方法:将rhscIL-27基因片段从pcDNA3.1载体克隆到腺病毒载体pAdTrack-CMV,然后在细菌内与pAdEasy同源重组构建AdIL-27腺病毒载体并转染293细胞包装、扩增腺病毒颗粒。将重组腺病毒感染肝癌细胞株HepG2,荧光显微镜、RT-PCR及ELISA等方法进行检测蛋白表达情况,IFN-γ诱生实验检测rhscIL-27的生物学活性。结果:成功构建AdIL-27腺病毒载体,经293细胞包装扩增后感染HepG2细胞观察到有GFP表达,RT-PCR及ELISA检测到细胞有rhscIL-27表达,IFN-γ诱生实验证实表达的rhscIL-27具有诱导产生IFN-γ的生物学活性。结论:利用腺病毒表达系统成功在肝癌细胞表达有生物活性的重组人单链IL-27(rhscIL-27),并具有诱导产生IFN-γ的生物学活性,为研究IL-27的生物学功能及其对肝癌的基因治疗奠定了基础。     

不同IL-15基因转染对NCI-H446细胞诱导PBMC增殖和杀伤肿瘤细胞的影响

目的 研究不同IL-15基因转染对NCI-H446细胞诱导外周血单个核细胞(PBMC)增殖和杀伤肿瘤细胞的影响.方法 野生型NCI-H446细胞(Cw)和被3种IL-15基因分别转染的3种NCI-H446细胞(Cmp:被IL-15成熟肽基因转染;Cp:被原型IL-15基因转染;Csp:被信号肽换为IL-2信号肽的改型IL-15基因转染),用丝裂霉素(M)处理后(分别名为MCw、MCmp、MCp和MCsp)作为刺激细胞刺激健康志愿者的PBMC.对这些被刺激的PBMC,分别名为MCw-PBMC、MCmp-PBMC、MCp-PBMC和MC-sp-PBMC.台盼蓝拒染法计数细胞数,流式细胞术测定CD4 细胞和CD8 细胞百分率.在MCmp-PBMC,MCp-PBMC和MCsp-PBMC中,选择其细胞数和CD4 细胞和/或CD8 细胞百分率统计学上明显高于MCw-PBMC的作为效应细胞,MTT法测定它们对Cw的杀伤.结果 与MCw-PBMC相比,MCp-PBMC在细胞数、CD4 细胞和CD8 细胞百分率及对Cw的杀伤上,均显著提高(P＜0.05).结论 原型IL-15基因转染能提高NCI-H446细胞诱导PBMC增殖和杀伤野生型NCI-H446细胞的能力.     

人IL-6基因转染的小鼠黑色素瘤细胞B16-IL-6~ 致瘤性降低的实验研究

应用细胞因子基因转染的瘤苗治疗肿瘤是近年来肿瘤基因治疗的重要进展之一。本研究采用磷酸钙DNA共沉淀法将人IL-6基因转染入B16黑色素瘤细胞中,筛选出一株高分泌IL—6(240U/ml)克隆(B16—IL—6~ ),B16—IL-6~ 细胞体外生长能力减弱,小鼠皮下接种后肿瘤结节形成率降低,生长速度减慢,并对再次接种野生型B16细胞具有抵抗作用。小鼠静脉接种后形成的肺转移结节数显著减少,荷瘤小鼠存活期延长。结果表明IL-6基因转染的肿瘤细胞致瘤性显著下降。并能诱导机体产生抗肿瘤免疫功能。     

DPC4基因转染对结肠癌细胞生长的抑制作用及其作用机制

目的 研究DPCA基因转染对结肠癌细胞生长及p21^WAFI mRNA表达的影响。方法 构建pcDNA3．1-DPCA真核表达质粒．利用脂质体转染技术将pcDNA3．1质粒和pcDNA3．1-DPCA质粒分别导入结肠癌细胞系SW620;采用免疫细胞化学和Western蛋白印迹检测细胞中DPCA基因的表达;通过检测细胞生长曲线、克隆形成实验研究DPCA基因转染对SW620细胞生长的抑制作用。通过逆转录．聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组细胞内p21^WAFI mRNA的表达。结果 转染DPC4基因后,在SW620细胞中可检测到高表达的DPCA蛋白;细胞生长倍增时间(74h)明显延长;细胞克隆形成率(21％)明显降低。DPCA基因转染后SW620细胞p21^WAFI mRNA含量增加。结论 DPC4基因的高表达能够抑制结肠癌细胞的生长,DPCA基因可能通过诱导p21^WAFI基因的表达而抑制结肠癌细胞的生长。     

小鼠白细胞介素12基因转染及其在黑色素瘤细胞B16F10中的表达

目的:探索小鼠白细胞介素12(mIL-12)基因在小鼠黑色素瘤B16F10细胞中的表达。方法:应用DNA重组技术将mIL-12基因插入pcDNA3.1真核表达载体中, 通过电穿孔转染B16F10细胞, 筛选出阳性细胞克隆后, 应用PCR、RT-PCR及Westernblot技术检测mIL-12基因在B16F10细胞中的整合及表达。结果:在DNA、mRNA及蛋白质3个水平均证实mIL-12基因已转染到B16F10细胞中并表达。结论:mIL-12基因可成功地转染体外培养的B16F10细胞并表达, 为进一步研究IL-12基因修饰的肿瘤细胞的基因瘤苗奠定了基础。     

TGF-β1基因转染对大鼠树突状细胞生物学特性的影响

目的 研究转化生长因子β1(TGF-β1)基因转染对大鼠树突状细胞生物学特性的影响。方法 将TGF-β1基因导入体外培养的大鼠树突状细胞，经过G418筛选后，采用Western blot和水貂肺上皮细胞(Mv1)生长抑制试验，了解转染细胞TGF-β1的表达及其生物学活性。通过混合淋巴细胞反应，观察转染的树突状细胞对T淋巴细胞增殖的影响。结果 FGF-β1基因转染的树突状细胞可以分泌TGF-β1，而且具有特异性抑制Mv1增长的生物学活性。在混合淋巴细胞反应中，TGF-β1基因转染的树突状细胞对T淋巴细胞的增殖有抑制作用，而空载体pcDNA3对照组与未转染组的树突状细胞具有强烈的激发T细胞增殖的能力。结论 利用构建的TGF-β1表达质粒转染大鼠树突状细胞，转入的TGF-β1基因可以在树突状细胞内稳定表达，并且使树突状细胞的生物学特性发生相应的改变。     

LKB1基因转染对人肺腺癌细胞生物学行为的影响

目的:探讨外源性LKB1基因表达对人肺腺癌细胞生物学行为的影响。方法:应用巢式PCR方法扩增LKB1基因编码区,利用脂质体转染技术将真核表达重组体pcDNA-LKB1质粒和空载体pcDNA3.1质粒分别导入A549细胞,经G418筛选后获得稳定转染细胞克隆,Western blot检测LKB1和STAT3在A549细胞中的表达变化。通过绘制生长曲线和克隆形成试验检测获得性表达LKB1基因后肺癌细胞的增殖变化,流式细胞术(FCM)分析其细胞周期及其凋亡的变化。结果:成功获得了稳定表达外源性LKB1基因的A549细胞系,与转染空白载体组比较,转染LKB1基因的细胞生长速度明显减慢,细胞周期中G1/G0期比例明显增加,S期比例减少,细胞凋亡率升高;同时STAT3蛋白的磷酸化水平明显降低。结论:LKB1可能通过下调STAT3蛋白磷酸化水平的表达从而抑制A549细胞的恶性生物学行为。     

三利IL-15基因转染NCI-H446细胞模型的建立与鉴定

目的构建并鉴定三种IL-15基因转染的人小细胞肺癌(NCI—H446)细胞模型。方法PCR法扩增得原型IL-15基因片段(FhIL-15)、IL-15成熟肽基因片段(FhIL-15mp)和IL-2信号肽基因片段(FhIL-2sp)；利用重叠延伸基因拼接法将FhIL-15mp和FhIL-2sp拼接成改型IL-15基因片段(FhIL-2sp-hIL-15mp)。将三种IL-15基因片段(FhIL-15、FhIL-15mp和FhIL-2sp-hIL-15mp)分别插入真核表达载体pEGFPN1构建成相应的重组质粒(PhIL-15、PhIL-15mp和PhIL-2sp-hIL-15mp)，用脂质体法分别转染NCI-H446、G418筛选得三种IL-15基因转染的NCI-H446细胞(C-hIL-15、C-hIL-15mp、C-hIL-2sp-hIL-15mp)。对所得的各基因片段和重组质粒，用琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定；对所得的各转染细胞，用RT-PCR法检测hIL-15mRNA的表达，ELISA法检测hIL-15蛋白的分泌。结果琼脂糖凝胶电泳和测序证明，FhIL-15、FhIL-15mp、FhIL-2sp-hIL-15mp电泳条带位置和基因序列正确。三种转染细胞均有IL-15mRNA表达，但仅C-hIL-2sp-hIL-15mp可测到22pg/mL的IL-15蛋白分泌。初步应用表明，三种转染细胞确有不同的免疫生物学特性。结论正确构建了三种IL-15基因转染的NCI—H446细胞模型，可在进一步研究IL-15基因与肿瘤细胞免疫生物学特性的关系及至机制中应用。     

IL—3基因转染的肿瘤细胞增强机体免疫功能的实验研究

建立了ＩＬ－３基因转染的Ｂ１６小鼠黑素瘤细胞株（Ｂ１６－ＩＬ－３），发现其体内的致瘤性和肺转移能力明显下降，对其免疫机理作一探讨，结果发现接种Ｂ１６－ＩＬ－３细胞的小鼠脾细胞体所诱生的ＬＡＫ活性和ＣＴＬ活性显著升高，外周血和脾细胞的ＣＤ４／ＣＤ８比值都有所升高，此外，在裸鼠体内，Ｂ１６－ＩＬ－３细胞的致瘤性也有一定程度的降低，结果表明ＩＬ－３基因转染的肿瘤细胞能诱导机体的特异性和非特异性免疫功能，     

hMIP-1β基因转染小鼠结肠腺癌CT26细胞对免疫细胞的体内外趋化作用

探讨转染人巨噬细胞炎性蛋白1β(human macrophage inflammatory protein-1 beta,hMIP-1β)基因的小鼠结肠腺癌CT26细胞的生物学特性、致瘤性及对免疫细胞的体内外趋化作用。利用重组腺病毒载体携带hMIP-1β基因(AdhMIP-1β)转染CT26细胞。X-gal染色法检测基因转染效率;ELISA法检测基因转染CT26细胞培养上清中hMIP-1β的含量;Boyden趋化小室法检测培养上清对CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞及未成熟树突状细胞(immature dendritic cell,imDC)的趋化作用。小鼠皮下接种转染hMIP-1β基因的CT26细胞,观察其体内致瘤性和对免疫细胞的趋化作用。结果显示,腺病毒载体可携带hMIP-1β基因转染CT26细胞并高效表达hMIP-1β(P<0.01),培养上清含hMIP-1β且对免疫细胞有明显趋化作用。转染hMIP-1β基因的CT26细胞皮下接种后成瘤率降低,肿瘤生长速度减慢,肿瘤内可见明显坏死灶,坏死灶内和周围可见较多淋巴细胞浸润。提示hMIP-1β基因转染CT26细胞后,通过分泌hMIP-1β趋化淋巴细胞等免疫细胞到肿瘤局部发挥有效的抗肿瘤作用,从而为肿瘤的免疫治疗提供新的思路和策略。     

白细胞介素-27对白血病细胞株U937细胞生物学行为的影响

目的: 探讨白细胞介素-27(IL-27)对人单核细胞白血病细胞株U937细胞的影响及其机制。方法: 用不同剂量的重组人IL-27和U937细胞分别共培养24h和48h,用荧光定量PCR测定细胞中促凋亡基因 p53、bax 及caspase-3、主要组织相容性复合物Ⅰ(MHCⅠ)类分子、协同刺激分子CD86和黏附分子CD54的表达,流式细胞仪检测U937细胞表面CD86和CD54的表达,并用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定IL-27对细胞增殖的影响。结果: PCR结果显示经过不同剂量IL-27刺激后,U937细胞中促凋亡基因 p53和bax表达增加,同时,U937细胞中凋亡相关蛋白caspase-3的表达及活性也有相应增加;MTT结果显示,IL-27可以抑制U937细胞增殖并和抗肿瘤药物阿糖胞苷产生协同作用;IL-27可以诱导U937细胞中的MHCⅠ类分子(HLA-A,B,C)、表面的协同刺激分子CD86和黏附分子CD54的表达增加。结论: IL-27可以诱导U937细胞中促凋亡基因的表达,直接抑制细胞增殖,对细胞中MHCⅠ、CD86和CD54的表达有诱导作用。这可能是IL-27抗肿瘤作用的重要机制。     

人SCF和IL-15基因共转染NK细胞系生物学特性研究

目的：研究人SCF和人IL-15基因共转染NK细胞系的生物学特性。方法：利用LipofectAMINE^TM将IL-15真核表达载体pcDNA3-hIL-15和SCF真核表达载体pcDNA3-hSCF共转染NK-92细胞，RT-PCR鉴定表达SCF和IL-15的细胞克隆并以SCF依赖细胞株TF-1和IL-15依赖细胞株CTLL-2测定上清活性，MTT法检测增殖和杀伤活性。流式细胞术检测细胞表面分子CD3、CDl6、CD56、CD25、CD48、CD54、CD69和CD95。结果：建立共表达hSCF和hIL-15基因的NK-92S15细胞株，在IL-2培养条件下，其增殖能力表现出更强的聚集趋势，且生长要求有一定的细胞浓度，杀伤活性有不同程度下降。细胞表面分子CD16和CD56没有显著变化，而NK细胞活化相关分子CD25、CD48、CD54和CD95明显降低。结论：可以通过SCF和IL-15基因共修饰NK-92，改变其生物学特性，观察NK细胞活化、杀伤相关分子的特征，使NK细胞系有更深入的研究价值。     

IL-3基因转染的肿瘤细胞体内对巨噬细胞数目和功能的影响

曾发现转染IL—3基因的黑色素瘤细胞(B16—IL—3)体内致瘤性下降,肿瘤组织有包括巨噬细胞在内的大量炎症细胞浸润。进而研究了C57BL/6小鼠在皮下接种B16—IL—3细胞后,腹腔巨噬细胞数目和功能的变化。在接种B16-IL-3细胞后第4天,腹腔巨噬细胞的数目就升高1倍,接种后第10～15天升高5～6倍。而且体外无需LPS的刺激,腹腔巨噬细胞就能分泌一定水平的细胞因子IL—1、IL—6和TNF,具有较强的杀伤活性,体外经LPS刺激后,其分泌水平和杀伤活性继续升高,明显高于对照组。此外。腹腔巨噬细胞MHC二类抗原Ia的表达也明显增强。提示B16—IL—3细胞分泌的IL—3有效地激活了体内的巨噬细胞,这可能是B16—IL—3细胞体内致瘤性下降的原因之一。     

逆转录病毒载体介导IL-2基因转染人肝细胞的建立及其部分生物学性状

目的　　建立ｈＩＬ－２基因修饰的人肝细胞株并探讨对其生物学活性的影响。　方法应用重组逆转录病毒载体ｐＬＮＣＩＬ－２，将ｈＩＬ－２基因导入人肝细胞系Ｌ－０２，观察其形态及克隆形成率的变化，检测细胞培养上清中ｈＩＬ－２的含量，以及进行转染细胞基因组ＤＮＡ　ＮｅｏＲ基因片段的ＰＣＲ扩增。结果Ｌ－０２／ＩＬ－２细胞的增殖速度和克隆形成率低于Ｌ－０２／Ｎｅｏ细胞和Ｌ－０２细胞。Ｌ－０２／ＩＬ－２细胞的培养液中ｈＩＬ－２的含量达３２　０００　ｐｇ／１０６ｃｅｌｌｓ·ｄ，并可持续表达１０　ｗｋ以上。从Ｌ－０２／ＩＬ－２细胞和Ｌ－０２／Ｎｅｏ细胞基因组ＤＮＡ中，均扩增到ＮｅｏＲ基因片段（７９０　ｂｐ）。结论应用重组逆转录病毒载体成功地建立了Ｌ－０２／ＩＬ－２细胞株，为进一步进行肝细胞移植动物实验奠定了基础。     

腺病毒介导HCN2基因转染对人脂肪干细胞生物学特性的影响

目的:研究腺病毒介导的HCN2基因(Ad.HCN2)转染对人脂肪干细胞(ADSCs)生物学特性的影响.方法:取人脂肪组织分离得到脂肪干细胞并进行体外培养,腺病毒绿色荧光蛋白转染测定最佳感染倍数(MOI)值,Ad.HCN2转染后测量HCN2表达情况,并检测转染后细胞生物学特性的变化.结果:MOI=50为最佳MOI,Ad.HCN2转染后,ADSCs可表达HCN2,且其细胞活力、细胞周期、生长曲线、表面标志及诱导分化能力无明显变化.结论:ADSCs被Ad.HCN2转染后可表达目的基因HCN2,并可保持其生物学特性.     

IL-27在小鼠结肠炎中的作用及对NLRP3炎性小体的影响

目的:观察白细胞介素27(IL-27)对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎小鼠结肠组织学及NOD样受体蛋白3(NLRP3)炎性小体的影响。方法:将48只雄性C57BL/6小鼠随机分为正常对照组(自由进食饮水)、DSS模型组(饮用3%DSS溶液)、低剂量IL-27组和高剂量IL-27组(在饮用DSS溶液的基础上分别腹腔注射500ng和1μg IL-27)。12 d后行疾病活动指数(DAI)及组织损伤指数(HI)评分评估炎症程度,取结肠组织行免疫组化、Western blot及qPCR检测,取血清行ELISA检测IL-1β和IL-18水平。结果:与对照组相比,模型组的DAI评分和HI评分提示小鼠的结肠炎症明显增强(P0.05),NLRP3和IL-1β的mRNA表达水平增高,NLRP3和cleaved caspase-1的蛋白水平增高,血清中IL-1β和IL-18的含量增加;与模型组相比,高剂量IL-27组的DAI评分和HI评分提示小鼠的结肠炎症明显减轻(P0.05),NLRP3和IL-1β的mRNA表达水平下降,NLRP3和cleaved caspase-1的蛋白水平降低,血清中IL-1β中和IL-18的含量也减少;与模型组比较,低剂量IL-27组除了血清中IL-1β和IL-18含量减少外,上述各项指标的差异无统计学显著性。结论:IL-27可减轻DSS结肠炎模型小鼠的炎症程度并且可抑制NLRP3炎性小体的表达和激活。