c血清型变形链球菌抑龋相关基因/DNA片段的高通量筛选

目的　筛选含抑龋相关基因 /DNA片段的阳性克隆 ,为探究变形链球菌高、低毒力株致龋能力的差异奠定基础。方法　将抑制消减杂交方法获得的低毒力株特异的消减PCR产物与T/A载体pCR2 .1连接 ,将连接产物转化E .coliTOP10F′感受态细胞 ,进行蓝白筛选。对 96个转化子进行ClonyPCR ,将PCR产物点样于同一尼龙膜上 ,分别与地高辛标记的变形链球菌高、低毒力株基因组DNA -AluI酶切产物杂交 ,高通量筛选阳性克隆。结果　随机挑取了 96个白色或白色中央有蓝色的菌落 ,经过ClonyPCR ,其中有 4个转化子的扩增产物为双带 ,其余均为 0 .2～ 2 .0kb之间的单一条带 ,由原转化平板上另外挑取 4个白色菌落替代 ,其中 1个未扩增出产物。经过杂交 ,以与低毒力株基因组有杂交信号 ,而与高毒力株基因组无杂交信号或信号明显弱的转化子为阳性克隆 ,筛选的阳性率为 5 0 %左右 ,阳性克隆中含有c血清型变形链球菌抑龋相关的基因 /片段。结论　对抑制消减杂交方法获得的变形链球菌低毒力株特异的消减PCR产物进行高通量筛选 ,获得了抑龋相关基因 /DNA片段     

c血清型变形链球菌抑龋相关基因文库的构建

目的: 构建c血清型变形链球菌抑龋相关基因的抑制消减文库,为变形链球菌抑龋基因的筛选奠定基础。方法:从一对c血清型变形链球菌高、低毒力株中提取基因组DNA,AluⅠ酶切,以低毒力株的DNA酶切产物为testerDNA,高毒力株的DNA酶切产物为driverDNA,testerDNA连接接头后与driverDNA进行抑制消减杂交,并检测连接效率与消减效率。将获得的消减PCR产物,即差异基因 /差异DNA片段,与pCR2.1载体连接,转化E.coliTOP10F′感受态细胞,进行蓝白筛选。结果:AluⅠ酶切高、低毒力株基因组DNA,产生的酶切产物位于 0.1~2kb之间。testerDNA与接头的连接效率>25%,抑制消减杂交后消减效率检测显示,同时存在于tester与driverDNA中的 23SrRNA基因在消减组中出现时间较未消减组晚 12个循环,将消减PCR产物克隆后,挑取96个转化子,构建抑龋相关基因的抑制消减文库。结论:利用抑制消减杂交技术进行c血清型变形链球菌高、低毒力株之间基因组DNA的比较,初次构建了抑龋相关基因的抑制消减文库。     

利用抑制消减杂交技术构建变形链球菌高毒力株特异的基因文库

目的　构建c血清型变形链球菌高毒力株特异的基因文库,为变形链球菌毒力基因的筛选奠定基础。方 法　从一对c血清型变形链球菌高、低毒力株中提取基因组DNA,用四碱基限制性内切酶酶切,以高毒力株的DNA 酶切产物为tester DNA,低毒力株的DNA酶切产物为driver DNA,tester DNA连接接头后与driver DNA进行抑制消减 杂交,并检测连接效率与消减效率。将获得的消减PCR产物与pCR2.1载体连接,转化E.coliTOP10F′感受态细胞, 进行蓝白筛选。结果　从识别四碱基序列的限制性内切酶中,筛选出AluⅠ,用于制备变形链球菌基因组DNA的 代表性片段,产生的酶切产物位于0·1~2.0 kb。tester DNA与接头的连接效率大于25%,抑制消减杂交后消减效率 检测显示,同时存在于tester与driver DNA中的23S rRNA基因在消减组中出现时间较未消减组晚6个循环,将消减 PCR产物克隆后,挑取96个转化子,构建高毒力株特异的基因文库。结论　利用抑制消减杂交技术,进行c血清型 变形链球菌高、低毒力株之间基因组DNA的比较,初次构建了高毒力株特异的基因文库。     

牙龈卟啉单胞菌不同毒力株基因差异的比较研究

目的比较牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，Pgingivalis）高毒力株W83与低毒力株标准参考菌ATCC 33277之间的差异基因。方法采用抑制消减杂交技术（SHH）对比牙龈卟啉单胞菌高毒力株W83与低毒力株标准参考菌ATCC 33277的基因差异。以高毒力株W83为被检菌，低毒力株ATCC 33277为参考菌，将提取的基因组DNA用内切酶Rsa Ⅰ酶切，连接特殊设计的接头进行两次消减杂交和PCR扩增，得到消减混合物，与TA克隆载体连接，转化到JM109中，建立消减文库，经PCR筛选鉴定阳性克隆，进而对部分片段进行测序和同源分析。结果经SSH筛选鉴定得到36个片段大小为88～372bp的阳性克隆基因片段。结论从全基因角度研究牙龈卟啉单胞菌高毒力株W83与标准株ATCC 33277之间的分子遗传差异，为牙龈卟啉单胞菌致病基因的筛选及今后牙周病预防、诊治的靶标提供依据。     

口腔微生物与免疫学

变形链球菌GbpA的GBD免疫防龋实验研究；附着状态对口腔白色念珠菌ALS基因mRNA的影响；第一恒磨牙窝沟菌群组成；c血清型变形链球菌致龋相关基因，DNA片段的批量克隆与高通量筛选；外源性糖对变形链球菌活性氧代谢的作用。     

口腔扁平苔藓发病相关基因cDNA消减文库的建立

目的：建立口腔扁平苔藓差异表达基因的cDNA文库。方法：采用改良消减杂交技术,以口腔扁平苔藓病变组织总mRNA为实验组,采用改良的SMART PCR cDNA合成技术进行反转录,正常黏膜组织总mRNA为驱动组,进行扣除杂交,筛选出两组差异表达的cDNA,与T载体进行T／A连接构建文库,然后转化高效感受态大肠杆菌DHSa进行文库扩增,随机挑取阳性克隆进行酶切鉴定。结果：扩增消减cDNA文库获得200余个白色阳性克隆,随机挑取的100个阳性克隆酶切后,含500bp以上插入片段的克隆64个,占64％。结论：用改良消减杂交技术成功构建了口腔扁平苔藓差异表达基因的消减cDNA文库,该文库的建立为进一步筛选、克隆口腔扁平苔藓相关基因奠定了基础。     

牙根发育不全疾病致病差异表达基因文库的建立

目的：建立先天性牙根发育不全疾病患儿与其正常兄弟间致病差异表达基因的cDNA文库。方法：采用改良消减杂交技术，以先天性牙根发育不全疾病患儿与其正常兄弟外周静脉血的总mRNA为对比材料，筛选出候选相关致病基因差异表达的cDNA，将其与pGEM-T载体进行T／A连接构建文库，然后转化高效感受态大肠杆菌进行文库扩增，随机挑取100个白色克隆进行酶切鉴定。结果：扩增消减cDNA文库获得400余个白色阳性克隆，随机挑取的100个白色克隆经酶切后90％有插入片段。结论：用改良消减杂交技术成功构建了先天性牙根发育不全疾病致病差异表达基因的消减cDNA文库，该文库的建立为进一步筛选、克隆该疾病的候选致病相关基因奠定了基础。     

变形链球菌gcp基因突变菌株的构建及鉴定

目的:构建变形链球菌gcp基因突变菌株,以便研究变形链球菌gcp基因功能。方法:厌氧培养变形链球菌UA159,以前期研究中pMD19T-gcp为模板,PCR扩增gcp基因内部序列,连接自杀载体pVA8912,酶切鉴定;将鉴定正确的质粒转化变形链球菌UA159,挑取阳性克隆,提取基因组DNA,用PCR结合酶切鉴定。结果:发现PCR产物及插入片段大小与预期值相符,表明成功构建了重组质粒pVA8912/gcp;经PCR鉴定:gcp基因失活株基因组中gcp基因内部成功插入了重组载体片段。结论:成功构建了变形链球菌gcp基因失活株,为该基因功能的研究奠定了基础。     

变形链球菌recA基因启动子荧光蛋白表达载体的构建

目的 构建由recA基因启动子启动的红色荧光蛋白穿梭表达载体,研究变形链球菌recA基因表达的特点,以期为不同致龋环境中变形链球菌致龋毒力因子基因的表达提供参照.方法 以变形链球菌(UA159)基因组DNA为模板,扩增recA基因启动子,采用双酶切反应连接入载体pDsRed2-N1,构建原核表达载体pRred;通过酶切重组人穿梭载体pDL276,构建红色荧光蛋白表达载体pLRred.结果 经酶切鉴定目的质粒片段插入无误,同时重组载体pLRred转化菌荧光观测结果提示,重组载体pLRred构建成功.结论 本项研究中构建的recA基因启动子红色荧光蛋白同源重组克隆载体正确,可应用于recA基因表达的研究,同时可为研究变形链球菌致龋基因的表达提供内参照.     

高致龋变形链球菌探针检测与龋病现状的关系

目的探讨唾液中gtfB基因片段检出率与龋病的关系,为寡核苷酸探针作为一种筛检方法用于临床奠定基础。方法以龋失补牙数（decayed missing of filled teeth,DMFT）记录439名不同龋敏感者口腔龋患现状,将其唾液样本中的菌体DNA抽提后行PCR扩增,其产物与gtfB探针行斑点杂交,记录阳性结果。使用SPSS 11.0统计软件计算DMFT和PCR扩增后探针杂交阳性结果之间的spearman等级相关系数。结果DMFT和PCR扩增后探针杂交阳性结果之间有密切相关性,r=0.914,P〈0.01。结论变形链球菌毒力因子gtfB寡脱氧核苷酸探针敏感性高而且特异性好,且PCR扩增后探针杂交阳性结果与受试个体龋病现状密切相关,可以进一步考察该探针检测结果与受试人群未来患龋风险的相关性。     

c血清型变形链球菌低毒力株特异DNA片段的生物信息学分析

目的:发现c血清型变形链球菌低毒力株特异的新基因或已知基因的新功能,推测、鉴定基因所编码蛋白质的功能。方法:对筛选得到的26个变形链球菌低毒力株特异的DNA片段进行序列测定,利用BLAST 2.2.6程序进行核苷酸和含6相位阅读框架编码氨基酸的相似性检索。结果:变形链球菌低毒力株特异的DNA片段大小在113~776 bp之间,平均G C含量为38.27%,其中有8个片段为新的基因片段,在GenBank中登记。结论:发现了8个新的基因片段以及低毒力株特异的DNA片段的主要功能,为下一步的基因功能研究奠定基础。     

变形链球菌高毒力株特异DNA片段的序列测定及生物信息学分析

目的 将筛选得到的变形链球菌高毒力株特异的DNA片段序列与数据库中已知序列进行对比,发现高毒力株特异的新基因或已知基因的新功能,推测、鉴定基因所编码蛋 白质的功能。方法 对筛选得到的c血清型变形链球菌高毒力株特异的31个DNA片段进行序列测定,利用BLAST 2.2.6程序进行核苷酸和含6相位阅读框架编码的氨基酸的相似性检索。结果 变形链球菌高毒力株特异的31个DNA片段中,2个为重复克隆,片段大小在113～776 bp之间,平均G+C含量为38.59%,与已完成测序的变形链球菌UA159基因编码区的G+C含量相近。发现了5个新的基因片段,其余的片段均与变形链球菌UA159基因组中的基因有高度的同源性。依据推测的功能,高毒力株特异的DNA片段主要与信号转导及转录调节、修复应激损伤、生化代谢、外膜蛋白合成及粘附以及目前功能仍未知或不确定的假想蛋白有关。结论 利用生物信息学相关软件及数据库进行c血清型变形链球菌高毒力株特异DNA片段的基因分析、识别及功能预测,发现了5个新的基因片段以及高毒力株特异的DNA片段的主要功能,为进一步的基因功能研究奠定基础。     

Identification of the genes associated with a virulent strain of Porphyromonas gingivalis using the subtractive hybridization technique

Background/aims:  Porphyromonas gingivalis , a major etiological organism implicated in periodontal disease, can be classified into virulent and avirulent strains. Our aim was to identify a gene for the virulence of P .  gingivalis .
Methods:  The subtractive hybridization technique was employed to identify the genes specific to P .  gingivalis W83, a virulent strain. In this study, P. gingivalis W83 was used as the tester strain, and P .  gingivalis ATCC 33277 was the driver strain. The prevalence of W83-specific genes was determined by Southern blot analysis of several P. gingivalis strains.
Results:  We obtained 575 colonies using the subtractive hybridization technique. From among these, 26 DNA fragments were subjected to a homology search using the BLAST program. Compared with strain ATCC 33277, strain W83 contained 12 unique clones. The specificities of the isolated DNA fragments were analyzed among four P. gingivalis strains by Southern blot analysis. Five genes showed specificity for strain W83 compared with strain ATCC 33277. All five genes were also identified in strain W50.
Conclusions:  The subtractive hybridization technique was effective in screening the two strains for specific DNA sequences, some of which might be responsible for determining virulence. The results suggested that several genes specific to strain W83 were associated with its virulence. Further analysis of these DNA fragments will provide important information on the pathogenesis of virulent P .  gingivalis strains.     

PCR同时检测变形链球菌和远缘链球菌

目的:建立一种快速、简便地同时检测变形链球菌和远缘链球菌的方法。方法:以变形链球菌Dextranase基因设计引物,用PCR检测变形链球菌群细菌。结果:变形链球菌(血清型c、e、f)的PCR扩增产物为720 bp;远缘链球菌(血清型d、g)的PCR扩增产物为460 bp;道勒链球菌(血清型h)910 bp;仓鼠链球菌(血清型a),鼠链球菌(血清型b)均为1 270 bp。其它异种菌均不能扩增出产物,因此该PCR检测具有高度的特异性。从细菌纯培养物中PCR检测的敏感性为105菌落形成单位(colony-form ing un its,CFU)。结论:PCR能同时检测变形链球菌和远缘链球菌。该检测方法具有较高的敏感性和特异性,有望运用于临床检测。     

变形链球菌表面蛋白pcDNA3/pacA与pcDNA3/pacP真核表达质粒的构建

目的：构建变形链球菌表面蛋白真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３／ｐａｃＡ与ｐｃＤＮＡ３／ｐａｃＰ,即表面蛋白氨基端与中央区Ｔ、Ｂ细胞表位的两个基因疫苗。方法：通过ＰＣＲ扩增,获得分别编码变形链球菌表面蛋白ＰＡｃ氨基端和中央区Ｔ、Ｂ细胞表位的两个目的基因ｐａｃ－Ａ和ｐａｃ－Ｐ。将它们与真核穿梭表达载体ｐｃＤＮＡ３进行体外重组,并转化大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ,采用菌落原位杂交筛选出阳性克隆子后,抽提重组质粒,进行酶切鉴定、Ｓｏｕｔｈｅｍ杂交分析和ＤＮＡ序列测定。结果：真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３／ｐａｃＡ与ｐｃＤＮＡ３／ｐａｃＰ构建正确,目的基因ｐａｃ－Ａ和ｐａｃ－Ｐ定向插入至真核表达载体中,插入的相位正确,未改变目的基因的阅读框架。结论：真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３／ｐａｃＡ与ｐｃＤＮＡ３／ｐａｃＰ分别包含了变形链球菌表面蛋白ＰＡ     

变形链球菌蔗糖酶Ⅱ基因体外扩增片段的Southern杂交、序列分析及意义(二)

将变链菌NG_8ScrA基因432bp扩增片段纯化后,采用随机引物法标记成DNA探针,与13株变链菌相应的扩增产物进行Southern杂交,结果均出现杂交信号。进一步采用不对称PCR法测序,结果与文献报道的序列一致。表明PCR扩增产物特异性好,ScrA基因在变链菌及部分口腔常居菌间存在广泛同源性。