小鼠卵母细胞减数分裂过程中LIMK1参与调控Aurora-A在纺锤体的定位

目的研究小鼠卵母细胞减数分裂进程中活化的LIMK1(pLIMK1^Thr508)与Aurora-A亚细胞分布的相关性,LIMK1活性变化对Aurora-A和纺锤体组装的影响。方法收集21日龄CB6F1小鼠卵母细胞,分别体外培养至生发泡期(GV)、生发泡破裂期(GVBD)、第1次减数分裂中期(MI)、第1次减数分裂后期(AI)和末期(Tel I)以及第2次减数分裂中期(MII),固定并利用免疫荧光染色法分析减数分裂进程中pLIMK1^Thr508的亚细胞定位模式及其与纺锤体组装调控因子Aurora-A的时空相关性;利用抑制剂BMS-3处理MI期细胞,结合免疫荧光染色分析LIMK1活性缺失对于Aurora-A空间分布和纺锤体形成的影响。结果在小鼠卵母细胞减数分裂前期(prophase)(即GV期),pLIMK1^Thr508信号微弱并主要聚集于生发泡,此时Aurora-A在胞内没有特殊聚集;在临近减数分裂重启时,pLIMK1^Thr508离开生发泡,Aurora-A信号出现,两者呈高度致密的点状聚集并紧密重合;在生发泡完全破裂后,pLIMK1^Thr508和Aurora-A又呈多个点片状聚集在凝集的染色体周围;在MI期和MII期,pLIMK1^Thr508与Aurora-A共同定位于纺锤体两极;在从AI期到Tel I期进程中pLIMK1^Thr508离开纺锤体两极,聚集在收缩环部位,Aurora-A在纺锤体两极有微弱聚集。LIMK1抑制剂BMS-3能够破坏Aurora-A在纺锤体两极的聚集,并影响纺锤体结构。结论pLIMK1^Thr508在卵母细胞减数分裂中是一种微管组织中心(MTOC)相关蛋白,可能通过调控Aurora-A而参与纺锤体结构的形成和维持。     

天花粉蛋白对小鼠卵母细胞第1次减数分裂的影响

目的 研究天花粉蛋白（TCS）对小鼠卵母细胞第1次减数分裂的影响。 方法 性成熟昆明雌鼠,注射孕马血清促性腺激素10IU后48h,从卵巢中获取未成熟卵母细胞共480枚,在含不同浓度TCS的培养液中,分组进行体外培养,解剖镜下观察并统计其生发泡破裂（GVBD）率和第一极体（PB1）排出率;免疫荧光染色、激光扫描共焦显微镜分析系统观察各组卵母细胞第1次减数分裂过程中纺锤体形成及染色体排列状况。 结果 TCS浓度≤15mg/L时,卵母细胞GVBD率、PB1排出率及到达第1次减数分裂中期（MⅠ）的卵母细胞百分率无明显变化;TCS浓度为30mg/L和60mg/L时,到达MⅠ期的卵母细胞百分率降低（P<0.05）,纺锤体形成和染色体排列出现异常,PB1排出率低于对照组（P<0.05）;TCS浓度达到120mg/L时,MⅠ期卵母细胞的百分率显著下降（P<0.01）,GVBD率下降（P<0.05）,浓度为240mg/L时明显下降（P＜0.01）。 结论 TCS干扰第1次减数分裂重启及纺锤体形成和染色体排列,阻滞小鼠卵母细胞第1次减数分裂,且这种阻滞作用呈浓度依赖性。     

小鼠卵母细胞减数分裂过程中钙离子的三维分布

用Ｃａ＾＋＋特异荧光染料Ｆｌｕｏ－３／ＡＭ显示细胞内Ｃａ＾＋＋的存在，利用激光扫描共聚焦显微镜研究小鼠卵母细胞减数分裂过程中细胞内游离Ｃａ＾＋＋的三维分布变化。生发泡期时Ｃａ＾＋＋主要分布在卵母细胞生发泡的周围。生发泡破裂后，Ｃａ＾＋＋均匀分布于整个细胞内，细胞中部荧光强度稍高。ＰｂＩ期时Ｃａ＾＋＋均匀分布。ＰｂＩＩ期时卵母细胞Ｃａ＾＋＋在原核部位浓度降低。在极体中Ｃａ＾＋＋均有较强分布。生发泡破     

小鼠卵母细胞减数分裂过程中活化Pak1的表达及其与染色体分离的相关性

目的研究活化的Pak1在小鼠卵母细胞减数分裂进程中的表达、亚细胞定位及其与染色体分离的相关性。方法用Western blot方法半定量分析活化的Pak1(~(Ser204)位点磷酸化,pPak1~(Ser204))在小鼠卵母细胞减数分裂各个时期的蛋白表达量;用免疫荧光染色法分析减数分裂进程中pPak1~(Ser204)的亚细胞定位模式及其与纺锤体和微管组织中心(MTOC)的时空相关性。结果 pPak1~(Ser204)在小鼠卵母细胞减数分裂重启时(GVBD)开始表达,其表达量随减数分裂进程逐渐升高,在第一次减数分裂中期(MⅠ)时达到峰值并持续保持至第二次减数分裂中期(MⅡ)。在第一次减数分裂前中期(pro-MⅠ)、MⅠ和MⅡ期,pPak1~(Ser204)与MTOC核心蛋白pericentrin和γ-tubulin共同定位于纺锤体两极,pPak1~(Ser204)同时存在于染色体上;在第一次减数分裂后期(AI)到末期(TelI)进程中pPak1~(Ser204)离开MTOC和染色体,聚集在收缩环部位。结论 pPak1~(Ser204)在卵母细胞减数分裂恢复时开始表达,是一种MTOC相关蛋白,可能通过参与纺锤体结构的形成和维持而调控染色体的分离。     

小鼠卵母细胞减数分裂过程中新型微管蛋白ε-tubulin稳定表达并与纺锤体的组装和维持相关

目的研究新型微管蛋白ε-tubulin在小鼠卵母细胞减数分裂进程中的蛋白表达、亚细胞定位及其与纺锤体的相关性。方法用Western blot法检测ε-tubulin在小鼠卵母细胞减数分裂各个时期的蛋白表达;免疫荧光染色分析ε-tubulin在减数分裂进程中的亚细胞定位模式及其与纺锤体的相关性。结果ε-tubulin在小鼠卵母细胞减数分裂各个时期均有稳定的蛋白表达,在减数分裂前期均匀分布在细胞核中,在生发泡破裂后直到第二次减数分裂中期始终保持与纺锤体微管的共定位特性,并持续存在于染色体上。ε-tubulin对纺锤体毒性药物Taxol和Nocodazole敏感并呈现出与微管一致的反应性。结论小鼠卵母细胞内新型微管蛋白ε-tubulin稳定表达并与纺锤体的组装和维持相关。     

Akt1和Akt2在小鼠卵母细胞中定位的差别

目的研究小鼠卵母细胞减数分裂恢复过程中Akt1和Akt2在从GV期向GVBD期转化期间亚细胞定位的特点。方法采用间接免疫分析技术观察Akt1和Akt2在小鼠卵母细胞GV期和GVBD期的定位;利用显微注射实验技术将Akt1和Akt2抗体分别注射入卵细胞,在不同时间点观察GVBD的发生的数量。结果 Akt1在小鼠卵母细胞GV期均匀的分布于细胞质,而在GVBD期则分布于细胞膜。Akt2在GV期和GVBD期分布于整个细胞,但是GV期以细胞质更为密集,而在GVBD期以细胞核附近更为密集。结论 Akt1可能参与小鼠卵母细胞减数分裂恢复的调控。     

阻滞和非阻滞品系小鼠次级卵母细胞基因表达水平的比较

目的:通过基因芯片检测阻滞品系昆明(KM)小鼠和非阻滞品系B6C3F1小鼠次级卵母细胞(MⅡ卵)基因表达差异,探讨KM小鼠植入前胚体外发育阻滞是否与母源基因表达差异相关。方法:分别收集KM小鼠和B6C3F1小鼠MⅡ卵,运用基因芯片分析和real-time PCR验证,母源基因的差异表达。结果:基因芯片检测共筛出差异表达基因995个,其中B6C3F1小鼠MⅡ卵上调基因有793个;下调基因有202个。B6C3F1小鼠MⅡ卵表达上调的基因主要与调节基因转录、蛋白质合成与转运、氧化还原、生长因子等相关。结论:KM与B6C3F1小鼠植入前胚体外发育潜能不同可能与母源基因表达差异相关。     

149位丝氨酸在CDC25B诱导小鼠卵母细胞减数分裂中的功能

目的: 研究小鼠卵母细胞减数分裂过程中, 149位丝氨酸对CDC25B磷酸酶功能的影响.方法: 将野生型CDC25B-WT和突变型CDC25B-S149A体外转录成mRNA, 显微注射到小鼠GV期卵母细胞中, 观察减数分裂恢复情况, 同时检测了各组卵母细胞CDC2-Tyr15的磷酸化状态.结果: 在小鼠卵母细胞减数分裂过程中, 野生型CDC25B能促进减数分裂的重启动, 活化有丝分裂促进因子, 其突变体CDC25B-S149A对减数分裂的诱导作用丧失, 不能活化有丝分裂促进因子.结论: 149位丝氨酸的完整是CDC25B磷酸酶发挥调节功能所必需的.     

玻璃化冷冻对小鼠卵母细胞和颗粒细胞的影响

目的探讨玻璃化冷冻法保存小鼠卵巢组织对卵泡内卵母细胞和颗粒细胞的影响。方法分别应用两种玻璃化冷冻方案(ED20和EE40)冷冻小鼠卵巢组织,常规组织学检测新鲜和复苏卵巢组织内卵泡形态,同时应用TUNEL方法观察冻融前后卵泡内卵母细胞和颗粒细胞凋亡情况。结果ED20组和EE40组卵泡存活率分别为78.99±5.99%和71.50±5.81%,明显低于新鲜卵巢组织。冻融组织卵泡凋亡率较冷冻前显著升高。ED20组、EE40组和新鲜对照组颗粒细胞凋亡的卵泡比例分别为8.30±2.14%、11.98±2.34%和4.95±1.62%,差异有显著性;而冷冻前后卵母细胞凋亡的卵泡比例无明显差异。结论玻璃化冻融过程对小鼠卵泡中颗粒细胞的损伤较大,而对卵母细胞的影响较小。     

Cdc42在小鼠卵母细胞发育中与纺锤体定位的关系

目的研究Cdc42与小鼠卵母细胞发育过程中纺锤体定位的关系。方法以小鼠卵母细胞为模型,利用特异性抑制Cdc42活性的Cdc42T17N（GDP结合形式Cdc42）,显微注射小鼠卵母细胞。共聚焦显微镜下观察Cdc42T17N mRNA注射组和空质粒注射对照组小鼠卵母细胞发育过程中纺锤体的定位,对结果进行统计分析。结果与对照组小鼠卵母细胞相比,Cdc42T17N mRNA注射组小鼠卵母细胞发育过程中纺锤体的定位分布有所改变。Cdc42T17N mRNA注射组的小鼠卵母细胞,纺锤体一端与卵母细胞皮质层接触百分率下降,与卵母细胞皮质层平行接触百分率上升,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论Cdc42可能参与小鼠卵母细胞发育过程中纺锤体的定位。     

149位丝氨酸对cdc25b蛋白在小鼠卵母细胞中定位的影响

目的：探讨149位丝氨酸使cdc25b蛋白诱导减数分裂功能丧失的机制。方法：应用免疫荧光观察GV期、G2／M转换期卵母细胞中cdc25b蛋白的定位情况；应用显微注射将pEGFP-cdc25b-ut、pEGFP-cdc25b—s149a的融合质粒及空载体质粒显微注射到含有完整生发泡的小鼠卵母细胞中，观察不同显微注射组小鼠卵母细胞中蛋白亚细胞定位。结果：免疫组化结果显示GV期卵母细胞中础256蛋白主要分布在细胞浆中，这与显微注射野生型cdc25b结果一致，G2／M转换期卵母细胞中可以观察到蛋白的核聚集，cdc25b-s149a在细胞核与细胞浆中均有分布。结论：看似静止的卵母细胞中cdc25b蛋白处于核浆穿梭的动态平衡，149位丝氨酸的磷酸化影响蛋白的核输出速率，从而使蛋白的定位发生改变。     

肝癌相关蛋白HCAP1的表达、抗体制备及其亚细胞定位

目的：肝癌相关基因HCAP1蛋白产物的表达、抗体的制备及其亚细胞定位。方法：原核表达HCAP1蛋白；纯化的HCAP1蛋白免疫新西兰大白兔，制备多抗血清；Western blot分析其在肝癌细胞株的表达；通过荧光免疫细胞化学进行亚细胞定位。结果：获得了较纯的HCAP1表达蛋白和高效价的、高特异性的抗HCAP1的多抗血清，并且发现HCAP1大部分位于胞浆，少量分布于核仁。结论：表达的HCAP1蛋白和抗HCAP1的多抗血清可用于HCAP1基因功能的研究；HCAP1功能场所可能位于核仁。     

小鼠卵母细胞体外成熟培养系统的建立与优化

目的 探讨激素刺激时间、体外培养时间对小鼠卵母细胞核成熟及不同激活方案对卵母细胞孤雌激活、胚胎发育能力的影响。方法 孕马血清促性腺激素（PMSG）超排处理,在体外培养的不同时间点检测卵母细胞核成熟率（每个处理至少重复3次,3只/重复,以下实验相同）。
分别采用乙醇结合6-二甲氨基嘌呤（6-DMAP）法和SrCl₂ 法激活卵母细胞,胚胎培养液选用CZB［胎牛血清（FBS）或牛血清清蛋白（BSA）］两种,确定最佳激活方案。对不同时间点成熟的卵母细胞进行激活,确定最佳激活卵龄。研究缩短PMSG刺激时间对卵母细胞发育的影响。结果 将
PMSG刺激时间从46h缩短至24h,卵母细胞获得最高核成熟率（97.6% vs 91.9%）的培养时间由14h延长至16h;缩短PMSG刺激时间,核成熟率不受影响,但能显著降低激活率（91.2% vs 37.1%）和囊胚率（20.9% vs 0.0%）。 两种方法体内成熟卵母细胞激活率均高于90%,但囊胚率差异
显著(P<0.05)。卵母细胞体外培养至24~26h时,激活率（89.5%）和囊胚率（21.9%）均达到最高点。结论 建立了一种小鼠卵母细胞体外成熟培养系统,即PMSG超排处理46h、卵母细胞培养24h,CZB（10mmol/L SrCl2）激活2.5h后采用CZB（0.5%BSA）进行胚胎培养。     

成纤维细胞生长因子受体-1、2和3在昆明小鼠卵母细胞和植入前胚中的表达与分布

目的:观察成纤维细胞生长因子受体(FGFR)-1、2和3在昆明小鼠卵母细胞和植入前胚中的表达和分布,为进一步探讨成纤维细胞生长因子(FGF)对昆明小鼠卵母细胞和植入前胚发育的影响提供实验依据.方法:逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、免疫荧光细胞化学显色和共聚焦扫描显微镜观察.结果:RT-PCR检测显示,FGFR1、FGFR2和FGFR3 mRNA在昆明小鼠卵母细胞和植入前胚均有表达;免疫荧光细胞化学显色、共聚焦扫描显微镜观察显示FGFR1、FGFR3免疫阳性反应见于卵母细胞和植入前胚胞质周边,靠近细胞膜;FGFR2阳性反应较均匀分布于卵母细胞和植入前胚的胞质.结论:FGFR1、FGFR2、FGFR3在小鼠卵母细胞和植入前胚发育的不同阶段都有表达,可能介导FGF调节小鼠卵母细胞和植入前胚的发育.     

小鼠精子发生过程中dysbindin-1的表达

目的 探讨精子发生过程中dysbindin-1的表达及dysbindin-1对精子顶体形态的影响。 方法 取生后7d、14d、21d、28d、35d和3月龄的雄性小鼠各3只,用免疫印迹法检测睾丸组织dysbindin-1的表达;以dysbindin-1缺失突变的sdy小鼠为研究对象,收集附睾尾部精子,一部分制备精子涂片,HE染色显示精子形态,用异硫氰酸荧光素-豌豆凝集素（FITC-PSA）和抗精子蛋白56（sp56）单克隆抗体进行荧光染色显示顶体的结构;另一部分采用免疫印迹法检测精子中dysbindin-1的表达。 结果 不同发育阶段小鼠睾丸组织及精子中均只有dysbindin-1A,无dysbindin-1C的表达;sdy小鼠的精子及顶体的形态未见明显异常。 结论 Dysbindin-1A表达于小鼠精子发生的不同时期,dysbindin-1A对精子形态维持不起关键作用。     

同型半胱氨酸对小鼠卵母细胞成熟过程中组蛋白表观遗传修饰的影响

目的 探讨卵母细胞发育过程中同型半胱氨酸（HCY）对组蛋白表观遗传修饰的影响。 方法 首先使用10只2周ICR雌性小鼠建立完整卵泡的体外培养体系,在卵母细胞发育早期,利用免疫组织化学方法,观察HCY对甲基化组蛋白H3K4、H3K9以及乙酰化组蛋白H3K9分布的影响;其次使用10只4周ICR雌性小鼠,利用卵母细胞的体外成熟培养体系,观察HCY对卵母细胞成熟过程的影响,同时利用实时定量PCR方法,观察在此成熟过程中HCY对卵母细胞内组蛋白乙酰化水平的调控酶GCN5和HDAC表达的影响。 结果 HCY明显抑制卵母细胞的体外成熟,在HCY作用下,甲基化组蛋白H3K4、H3K9以及乙酰化组蛋白H3K9的分布没有变化,但是表达强度降低,核呈现去浓缩的趋势。成熟过程中HCY并不改变基因GCN5的表达水平,却明显抑制卵母细胞内HDAC基因的表达。 结论 卵母细胞发育过程中高水平的同型半胱氨酸影响组蛋白的表观遗传修饰,HCY对卵母细胞核内组蛋白甲基化和乙酰化修饰的影响有可能是造成核染色体稳定性下降的重要原因。     

微管相关蛋白1B在FMR1基因敲除小鼠睾丸间质细胞中的表达

目的对不同周龄的Fmr1基因敲除和野生型雄性小鼠睾丸组织微管相关蛋白1B的表达进行分析比较,探讨Fmr1基因敲除小鼠的睾丸间质细胞微管相关蛋白1B表达的差异。方法采用不同周龄(4、6、8、10周)的FMR1基因敲除型(KO)和野生型(WT)各6只,先采用聚合酶链式反应(PCR)技术对KO小鼠和WT小鼠进行基因型鉴定,之后所有小鼠麻醉取睾丸组织、石蜡包埋切片进行HE染色对比观察Fmr1小鼠睾丸组织的形态,最后用免疫组织化学染色技术对KO小鼠和WT小鼠睾丸微管相关蛋白1B的表达进行检测并作对比分析。结果微管相关蛋白1B在4～10周小鼠睾丸间质细胞阳性表达,8、10周为强阳性表达,且KO小鼠在睾丸的阳性表达均高于WT小鼠。结论微管相关蛋白1B在同周龄FMR1基因敲除小鼠睾丸间质细胞的表达均显著高于WT小鼠,提示微管相关蛋白1B可能参与脆性X综合征巨睾症的发病过程。     

TSG-6和连接蛋白在小鼠卵丘-卵母细胞复合体的共位性分析

目的：探讨小鼠卵丘-卵母细胞复合体(COC)中 TSG-6和连接蛋白(LP)与透明质酸(HA)的相关性。方法：应用激光扫描共聚焦显微镜和免疫荧光双重染色技术观察小鼠 COC 中 TSG-6和 LP 的表达和分布。结果： TSG-6和 LP 在 COC 中呈阳性表达。结论：TSG-6和 LP 的阳性表达可能和 HA 在 COC 成熟中起重要作用。     

胃癌中survivin、PTEN、cyclinD1和p53基因的表达及其相关性

目的　探讨survivin基因表达与胃癌生物学行为及PTEN、cyclinD1、p5 3和凋亡指数 (AI)的相关性。 方法　用免疫组化EnVision法检测 15 6例胃癌组织、4 6例正常胃黏膜和 4 6例癌旁不典型增生组织中survivin、PTEN、cyclinD1和 p5 3的表达以及AI。结果　survivin、PTEN、cyclinD1和p5 3的阳性检测率分别为 6 5 %、4 1%、6 1%和 5 8%。survivin未见核内表达。survivin、cyclinD1和 p5 3表达与胃癌的组织学类型相关 (P <0 0 1,P <0 0 5和P <0 0 1) ;survivin和cyclinD1表达与胃癌的浸润深度相关 (P <0 0 1和P <0 0 5 ) ;4种基因蛋白表达均与淋巴结转移相关 ,survivin的表达与p5 3和cyclin阳性表达呈正相关 ,与PTEN的阳性表达呈负相关 ;survivin、p5 3和cyclinD1高表达均有患者术后 <3年生存期相关 (P <0 0 5 ,P <0 0 1和P<0 0 1) ;survivin阳性组的平均AI为 0 6 1,明显低于survivin阴性组 (P <0 0 1) ;PTEN阳性组明显高于阴性组 (P <0 0 1)。结论　survivin、PTEN、p5 3和cyclinD1基因在胃癌的发生、发展中起着不同程度的作用 ,它们的检测对胃癌恶性度的判定、预后和进一步治疗提供有效的依据。survivin、p5 3和cyclinD1的过表达可作为判断肿瘤术后差的指标     

膀胱移行细胞癌中fhit基因和survivin基因的表达和意义

目的探讨fhit基因和survivin基因在膀胱移行细胞癌中的表达和意义。方法用免疫组化S-P法检测62例膀胱移行细胞癌组织及10例正常膀胱粘膜组织中fhit蛋白和survivin蛋白的表达。结果10例正常膀胱粘膜组织中fhit蛋白表达均为阳性，survivin蛋白表达均为阴性；fhit蛋白在膀胱移行细胞癌中阳性表达率为46．77％（29／62），肿瘤不同分级中随恶性程度的增长表达减少，Ⅰ级与Ⅲ级比较，差异有统计学意义（P〈0．05），不同临床分期中随分期的增长表达减少，Tis～T1与T2～T4比较，差异无统计学意义（P〉0．05）；survivin蛋白在膀胱移行细胞癌中阳性表达率为56．5％（35／62），肿瘤不同分级中随恶性程度的增高表达增高（P〈0．05），不同临床分期中随分期的增长表达增高，差异有统计学意义（P〈0．05）；fhit蛋白和survivin蛋白表达相关（P〈0．05）。结论Fhit基因和survivin基因在膀胱移行细胞癌的发生、发展过程中起着重要的作用。Fhit基因可能通过肿瘤凋亡抑制途径发挥作用的。