软骨脱细胞细胞外基质多孔支架与山羊髓核细胞生物相容性研究

目的 制备软骨脱细胞细胞外基质多孔支架,并探讨其与山羊髓核细胞的生物相容性.方法 猪关节软骨经研磨、脱细胞、冷冻干燥技术等处理制成三维多孔支架;从山羊腰椎间盘中分离出髓核细胞,培养后获取P1代细胞;四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测支架浸提液毒性;将髓核细胞以5×106/ml的密度接种在支架上体外培养48 h,通过倒置显微镜、HE染色、死活细胞染色(LIVE/DEAD染色)、扫描电镜观察细胞在支架上的黏附及活性.结果 软骨脱细胞基质多孔支架在敷水状态下光滑透明,分离的髓核细胞呈典型的软骨细胞样形态;MTT检测各组间增殖,其差异不具有统计学意义(P＞0.05);倒置显微镜、电镜观察髓核细胞呈球状或短梭形均匀地贴附在支架内部,HE染色观察可见髓核细胞均匀分布在支架内部,LIVE/DEAD染色显示全部为绿色荧光(活细胞),未见红色荧光(死细胞).结论 软骨脱细胞基质多孔支架在组成上与髓核组织相似,与山羊髓核细胞具有良好的生物相容性,可以作为髓核组织工程的支架材料.     

碱性成纤维细胞生长因子对许旺细胞在小肠黏膜下层支架上黏附及增殖的影响

背景:许旺细胞复合小肠黏膜下层是构建人工神经的可行方法,碱性成纤维细胞生长因子有促进许旺细胞增殖的作用。目的:验证碱性成纤维细胞生长因子对许旺细胞在小肠黏膜下层支架材料表面的细胞增殖及黏附状态的影响。方法:将体外分离培养的2代SD乳鼠许旺细胞接种于小肠黏膜下层支架材料上并加入50μg/L的碱性成纤维细胞生长因子复合培养为实验组,以单纯的许旺细胞复合小肠黏膜下层作为对照组,分别用MTT法测定细胞增殖能力,细胞黏附率检测细胞在支架上的黏附情况,用流式细胞仪测定细胞分裂周期,并用苏木精-伊红染色及描电镜观察细胞形态及与材料的贴附情况。结果与结论:MTT显示实验组的细胞增殖吸光度值明显高于对照组(P0.05),实验组的细胞黏附率为(69.47±3.17)%,对照组为(44.58±1.76)%(P0.05),细胞周期显示实验组比对照组的G2/M+S期细胞百分含量高(P0.05),培养7d后的苏木精-伊红染色及扫描电镜显示实验组比对照组材料上聚集的细胞数量多,细胞形态伸展更明显,细胞贴附力更好。因此碱性成纤维细胞生长因子可明显地改善许旺细胞在小肠黏膜下层上的增殖及黏附能力,能促进许旺细胞与小肠黏膜下层支架的复合而构建人工神经导管。     

人脱细胞软骨细胞外基质对异种软骨种子细胞的影响

目的观察人脱细胞软骨细胞外基质(hACAM)对异种兔软骨种子细胞增殖和表型的影响。方法将差速梯度离心法制作的人脱细胞软骨细胞外基质,配制成0.5%的浆料,分别铺于6孔细胞培养板和96孔细胞培养板,形成1 mm厚的薄膜,以此培养板为实验组。空白对照组培养板仅使用单纯培养液培养。在培养板上培养兔关节软骨细胞。通过hochest33258染色验证人软骨细胞外基质脱细胞完全与否;分别在第5、15天两个时间点,通过倒置显微镜、甲苯胺蓝染色观察两种培养方法的兔软骨细胞的生长形态、细胞表型和增殖情况,用CCK-8细胞增殖实验比较两种培养方法在第1、3、7、10天的增殖情况。结果通过hochest33258染色发现差速梯度离心的人软骨细胞外基质脱细胞完全。通过倒置显微镜观察第5和15天的实验组细胞增殖情况优于空白对照组,甲苯胺蓝染色的结果也证明这个观点;CCK-8细胞增殖试验显示第7天hACAM组在细胞增殖方面明显地优于单纯培养液的对照组(P=0.0298),hACAM组的软骨细胞与空白组的软骨细胞在第10天的增殖情况相比没有统计学差异。结论 hACAM免疫原性低,无细胞毒性,能够很好地促进异种软骨细胞的增殖。     

兔骨髓间充质干细胞与异体脱细胞耳软骨支架的体外复合*

背景：耳软骨作为脱细胞基质可选择的支架,进行脱细胞处理可去除了软骨细胞的抗原性,从而与种子细胞具有良好的相容性。 目的：体外提取、培养兔骨髓基质干细胞,并与异体脱细胞耳软骨支架复合,观察其生物相容性。 方法：提取兔骨髓间充质干细胞行体外培养,诱导为软骨细胞,以胰蛋白酶-曲拉通联合法获得脱细胞软骨支架,将两者于体外复合,10 d后复合支架固定行组织学染色及扫描电镜观察。 结果与结论：兔骨髓间充质干细胞体外诱导14 d可形成软骨细胞,Ⅱ型胶原免疫细胞化学示胞浆呈棕黄色;兔耳软骨脱细胞基质呈乳白色,组织学染色及扫描电镜观察示经脱细胞后支架孔隙均匀,结构完整,仍保存大量酸性黏多糖及胶原成分。其孔径长度(33.70±4.33) μm,孔隙率(65.23±7.35)%。 复合支架组织学染色及扫描电镜示两者黏附良好,并伴有多量基质分泌。说明兔骨髓间充质干细胞诱导为软骨细胞与异体脱细胞耳软骨有良好的生物相容性。     

腺病毒介导hIGF-1基因转染对软骨细胞增殖的影响

目的：探讨腺病毒介导人胰岛素样生长因子(human insulin—like growth factor，hIGF-1)基因转染对软骨细胞增殖的影响。方法：构建携带hIGF—1基因的重组腺病毒并进行PCR、Western blot鉴定。体外培养人胚胎软骨细胞，用处于对数增长期的第3代软骨细胞进行实验?分别转染1、10、100及500不同感染复数单位(multiplicity of infection，MOI)的Ad／hIGF-1，用PBS做阴性对照，hIGF-1生长因子(100μg/L)做阳性对照，采用四氮甲基唑蓝(methyl thiazolyl tetmzolium，MTT)法检测不同时间、不同组别软骨细胞吸光度。结果：第2代重组腺病毒上清液中PCR鉴定含有hIGF-1基因，Westem blot，证实Ad／hIGF-1表达成熟的hIGF-1生长因子。不同病毒滴度转染对软骨细胞增殖的影响存在量效依赖关系，100MO1软骨细胞吸光度约为对照组3倍，1MOI与10MOI、500MOI对软骨细胞增殖的影响近似；PBS组随着细胞体外培养时间延长，细胞增殖下降，hlGF-1生长因子、hIGF-1基因对软骨细胞增殖的影响存在时效关系，72h达到峰值。结论：Ad／hlGF-1基因转染对软骨细胞增殖的影响存在量效、时效依赖关系。     

TGF-β1诱导分化的兔BMSCs复合左旋聚乳酸\β-磷酸三钙多孔支架材料体外研究实验

目的 研究体外培养rBMSCs经TGF-β1诱导分化的软骨细胞复合左旋聚乳酸\β-磷酸三钙(PLLA\β-TCP)多孔支架材料体外构建仿生人工软骨. 方法 低温挤出成形法制备成PLLA\β-TCP复合多孔支架材料,体外分离、培养rBMSCs至第3代,利用含有TGF-β1特殊诱导系统诱导其向软骨细胞分化,诱导14d后用甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组化进行鉴定后与PLLA\β-TCP多孔支架材料体外复合培养,并取第7、14、21d细胞复合材料进行电镜扫描观察细胞贴附、生长、增殖状况,同时消化收集贴附支架第7、14、21d的细胞,行RT-PCR检测分化软骨细胞相关基因aggrecan、Co12A1在mRNA水平的表达,Western-bolt检测Ⅱ型胶原蛋白的分泌情况.结果 rBMSCs经诱导后向软骨细胞分化,甲苯胺蓝染色见分化软骨细胞分泌糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG),Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈阳性;电镜扫描见分化细胞在支架材料分布均匀,黏附良好;RT-PCR及Westem-bolt检测示7、14、21daggrecan、Co12A1在mRNA水平、Ⅱ型胶原蛋白均有不同程度表达. 结论 利用含有TGF-β1特殊诱导系统诱导rBMSCs分化的软骨细胞复合到PLLA\β-TCP多孔支架材料上,细胞生长良好,并能正常分泌软骨细胞特异细胞外基质,体外成功构建了组织工程软骨.     

人脐带间充质干细胞复合脱细胞软骨细胞外基质取向支架修复山羊膝关节全层软骨缺损的实验研究

目的探索人脐带间充质干细胞复合脱细胞软骨细胞外基质取向支架构建组织工程软骨,用于修复山羊膝关节负重区全层软骨缺损的可行性。方法从人脐带中分离、扩增培养人脐带间充质干细胞,并进行鉴定;以猪源脱细胞软骨细胞外基质取向支架为组织工程软骨支架载体;在成年山羊膝关节负重区股骨髁处造全层软骨模型;实验分为两组,以人脐带间充质干细胞复合脱细胞软骨细胞外基质取向支架修复组为实验组,单纯全层软骨缺损造模作为对照组,每组3只山羊。术后7 d、14 d分别抽取关节液涂片行HE染色,观察炎症反应。在术后3、6个月后分别处死两组实验动物,取材进行大体形态学观察及评分、组织学染色及评分、软骨特异性基质成分定量检测。结果①关节液涂片HE染色结果显示,术后两组膝关节炎症反应未见明显差异。②大体形态学观察及组织学染色结果均证实,实验组修复区再生的关节软骨更加接近天然软骨,且与周边整合良好,获得更好的修复效果。大体形态学及组织学评分均证实,实验组的评分均要明显高于对照组(P0.05);③糖胺多糖定量检测结果显示实验组明显高于对照组(P0.05)。结论人脐带间充质干细胞复合脱细胞软骨细胞外基质取向支架构建组织工程软骨,可用于修复山羊膝关节负重区全层软骨缺损,是未来治疗软骨损伤较有应用前景的方法之一。     

同种异体气管软骨脱细胞基质构建组织工程化气管的初步研究

目的 初步探寻同种异体气管软骨脱细胞基质与向软骨诱导的骨髓间充质干细胞(MSCs)共同构建组织工程化气管的可行性.方法 分离并诱导宿主犬MSCs向软骨细胞分化,通过内蛋白多糖含量测量及Ⅱ型胶原免疫组化染色观察初步诱导效果.使用曲拉通化学消化法对供体犬气管软骨进行脱细胞处理,根据消化时间分组,观察气管软骨脱细胞基质制备效果.将诱导后MSCs与同种异体气管软骨脱细胞基质分别进行体外与体内复合培养,组织学及电镜下观察诱导细胞的生长情况,以进行构建组织工程化气管可行性初步分析.结果 宿主犬MSCs软骨方向诱导后诱导组细胞培养液内蛋白多糖含量为(42.48±2.32)μg/ml,较未诱导组(19.62±1.30)μg/ml明显增高(p<0.01),诱导组细胞Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性.HE染色及扫描电镜均可见120小时组供体犬气管组织黏膜细胞及软骨细胞完全消失,软骨基质结构完整.体外联合培养7天内可见诱导后MSCs在脱细胞软骨基质表面生长,14天时细胞逐渐凋亡;体内联合培养可见诱导细胞在软骨基质浅层生长,但基质内部未见细胞成分生长,并无新生软骨形成.结论 使用曲拉通化学消化法可成功制备结构完整的同种异体气管软骨脱细胞基质,但作为构建组织工程化气管的支架材料,其空隙率和贯通性仍需进一步改进.     

胰岛素样生长因子I与透明质酸对人关节软骨细胞的作用

目的探讨胰岛素样生长因子I(IGF-I)和透明质酸(HA)联合培养对人关节软骨细胞增殖及其生物学行为的影响.方法分离培养人关节软骨细胞,分4组,分别为对照组、IGF-I组、HA组和IGF-I+HA组.加入不同浓度的IGF-I、HA、IGF-I和HA,用四氮甲基唑蓝(MTT)法测定不同时间点软骨细胞增殖活性的变化.从第4代开始,用IGF-I和HA联合培养,通过电镜观察、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原和软骨蛋白聚糖(aggrecan)免疫组化及RT-PCR判断联合培养第8代软骨细胞表型的变化.自然传代的第6代细胞为对照组.结果 IGF-I在10μg/L浓度时即可明显促进软骨细胞的增殖,当IGF-I浓度为50μg/L时,其促增殖作用达最大值.单独应用不同浓度的HA对人关节软骨细胞的促增殖作用不明显.联合应用IGF-I与HA对软骨细胞的增殖具有协同效应并使促增殖作用时间后延.IGF-I和HA联合培养的第8代细胞胞质内含有丰富的粗面内质网和分泌小泡;RT-PCR显示Ⅱ型胶原mRNA表达阳性而Ⅰ型胶原mRNA表达阴性;甲苯胺蓝染色显示细胞质内有大量的紫色异染颗粒;Ⅱ型胶原和aggrecan免疫组化见92%的细胞染色呈阳性或强阳性,平均灰度分别为85.92±9.71和116.23±16.69.而对照组的平均灰度值分别为105.12±12.20和135.68±10.65,二者均显著低于对照组(P<0.01).结论 IGF-I明显促进软骨细胞的增殖;HA对软骨细胞的增殖无影响;二者联合培养促增殖能力更强,并且能有效地保持软骨细胞表型的稳定.     

脱细胞真皮基质/生物矿化胶原一体化骨软骨支架的制备及其生物相容性的研究

目的成功制备脱细胞真皮基质/生物矿化胶原一体化骨软骨支架,并进行理化性质、生物力学与生物相容性评估,为骨软骨缺损修复提供理论依据。方法以物理和化学方法制备牛源脱细胞真皮基质,利用磷酸三钙和胶原,按照不同比例混合,利用自组装和冻干技术,制备以脱细胞真皮基质支架为软骨层,生物矿化胶原为骨层的骨软骨一体化双相支架。通过大体观察、扫描电镜观察、生物力学等检测,对骨软骨一体化支架进行理化性质和力学性能评价。原代培养小鼠软骨细胞和成骨细胞,并分别种植在脱细胞真皮基质和生物矿化胶原双相支架上,利用细胞毒、死/活细胞染色和增殖实验等观察细胞生长情况,测定骨软骨一体化支架的生物相容性。结果大体观察表明支架各层间结合紧密,未出现明显不连续和相互分离。扫描电镜各层内的孔隙结构相互连通且均具有立体多维性,其中脱细胞真皮基质、生物矿化胶原和双相支架的孔径分别为(121.6±8.65)、(98.40±5.56)和(103.2±3.94)μm。同时三组支架的压缩模量分别为(41.05±11.69)、(108.0±12.71)和(84.98±8.51)k Pa,弹性模量分别为(17.24±3.93)、(28.98±3.31)和(21.74±2.92)k Pa。MTT法表明骨软骨一体化支架无细胞毒性。荧光显微镜观察显示,纵切的支架薄片上细胞生长分布均匀,表明支架生物相容性较好,CCK8实验表明支架可以维持良好的细胞活性。结论脱细胞真皮基质/生物矿化胶原骨双相支架中上下层间的理化性能展示了骨软骨组织结构和力学方面的双重仿生,为动物体内实验奠定了基础,有望成为治疗骨软骨缺损修复的一种新手段。     

外消旋聚乳酸与软骨细胞体外培养的实验研究

探讨国产外消旋聚乳酸(Poly-DL-Lactide,PDLLA)材料作为软骨组织工程技术中细胞培养支架的可行性及不同孔隙率的PDLLA支架对软骨细胞吸附增殖的影响。采用不同孔隙率的PDLLA支架与软骨细胞体外培养,观察其亲水性的改变,细胞吸附及对细胞增殖的影响。软骨细胞在不同规格的PDLLA支架上均能生长增殖分泌基质。孔隙率在90%~96%的PDLLA支架细胞吸附、增殖较佳。     

脱细胞半月板细胞外基质/脱钙骨基质双相半月板支架的制备及其生物相容性的研究

目的成功制备脱细胞半月板细胞外基质/脱钙骨基质双相半月板支架,并与半月板纤维软骨细胞结合研究其生物相容性。方法联合利用湿法粉碎、差速离心等物理方法和胃蛋白酶等化学方法制备脱细胞半月板细胞外基质,利用改良Urist法制备脱钙骨基质,并利用灌注、冷冻干燥等方法分别制备脱细胞半月板细胞外基质支架、脱钙骨基质支架以及脱细胞半月板细胞外基质/脱钙骨基质双相支架等三种不同的支架,并从组织学、分子生物学、生物力学等方面研究三种支架的异同;原代培养兔半月板纤维软骨细胞,并将P3代的纤维软骨细胞分别种植在以上三种支架上,利用扫描电镜、死/活细胞染色等观察细胞生长情况,并分别在3、7、14 d时检测纤维软骨细胞的增殖情况以及分泌胶原和糖胺多糖的含量。结果物理化学联合法脱细胞可以去除半月板中绝大部分的细胞成分,并且很好地保留正常半月板细胞外基质的胶原以及糖胺多糖成分;脱细胞半月板基质支架、脱钙骨基质支架以及脱细胞半月板细胞外基质/脱钙骨基质双相支架三种支架均具有良好的孔隙率,合适的孔径大小,扫描电镜结果显示纤维软骨细胞可以很好地在支架上生长,死/活细胞染色结果显示三种支架均可以维持良好的细胞活性,但是脱细胞半月板细胞外基质/脱钙骨基质双相支架具有更好的生物力学特性,脱细胞半月板基质支架和脱钙骨基质/脱细胞半月板基质双相支架在促进纤维软骨细胞增殖和维持细胞表型方面要比单纯脱钙骨基质支架更优。结论脱细胞半月板细胞外基质/脱钙骨基质双相支架具有较好的生物力学特性,良好的生物相容性,可以促进纤维软骨细胞增殖,同时也可以维持纤维软骨细胞的表型,是一种可以应用于组织工程半月板再生的支架。     

壳聚糖-脱细胞真皮三维材料作为骨组织工程支架材料的研究

目的观察MC3T3-El成骨前体细胞在壳聚糖-脱细胞真皮三维支架材料上的黏附情况,并评价其细胞相容性。方法通过冷冻干燥制备壳聚糖-脱细胞真皮三维支架材料,并测试其孔隙率、密度和吸水率,通过扫描电镜分析支架的微观形貌。采用体外培养细胞的方法,将MC3T3-E1细胞直接接种到壳聚糖-脱细胞真皮三维支架材料上,培养2,3,4,5h,各时间点各取3个样品,测定细胞在支架上的黏附率,确定最佳的细胞贴壁时间。将细胞接种到支架上,共培养1,3,5,7,9,11,13d,采用MTS方法绘制细胞增殖曲线,组织化学染色观察细胞形态,并利用材料试验机测试不同时间材料细胞复合物的压缩弹性模量。结果壳聚糖-脱细胞真皮材料具有连通的多孔结构,孔隙率为92.8%,密度为97.96g/L,吸水率为(2169±100)%。细胞相容性实验显示,成骨细胞易于在支架材料上黏附、增殖。结论壳聚糖-脱细胞真皮材料具有连通的孔隙,孔径较均匀,MC3T3-El成骨前体细胞易在壳聚糖-脱细胞真皮三维支架材料上黏附、增殖,表明该支架材料具有良好的细胞相容性。     

可注射性纤维蛋白凝胶/脱钙骨基质复合支架延缓兔骨关节炎软骨退变

背景:纤维蛋白凝胶及脱钙骨基质都有优良的生物相容性及生物降解性,因此可以作为软骨组织工程支架培养软骨种子细胞。这两种材料分别可以作为生长因子的载体缓慢释放生长因子,并达到持续发挥促软骨细胞生长的功能。目的:验证可注射性纤维蛋白凝胶/脱钙骨基质复合支架延缓骨性关节炎的可行性及有效性。方法:实验为同体对照动物实验。16只兔切断双后肢前交叉韧带制备兔膝关节骨性关节炎模型,兔一侧膝关节内注射复合支架材料与软骨细胞混悬液为实验组。另一侧膝关节内注射等量生理盐水为对照组,12周后取关节软骨,分别进行苏木精-伊红染色,Masson染色,Ⅱ型胶原免疫组化染色,并根据Wakitani标准及Outerbridge分类重新制定标准进行评分,评价实验组与对照组软骨退变的程度。结果与结论:实验组关节软骨表面尚光滑,可见软骨陷窝,结构软骨退变较对照组轻;软骨细胞及Ⅱ型胶原较正常软骨组织轻度减少,关节囊组织无明显Ⅱ型胶原表达。实验组综合评分低于对照组(P0.01)。表明可注射性纤维蛋白凝胶/脱钙骨基质复合支架为早期骨性关节炎及骨缺损修复提供了一种优良的复合支架材料。     

丝素蛋白/明胶/壳聚糖三维多孔软骨组织支架的制备及体外评价

背景：软骨缺损是骨科医生面临的主要临床挑战之一，组织工程是一种结合了工程学和细胞生物学知识的跨学科方法，为软骨缺损的修复提供了新思路与途径。目的：基于丝素蛋白、明胶和壳聚糖制备多组分复合支架，通过评估其理化性质和生物学性能，筛选能够适合软骨再生的三维多孔支架。方法：以丝素蛋白、明胶和壳聚糖为基础材料，通过真空冷冻干燥法制备4组多孔支架，分别为明胶/壳聚糖支架、丝素蛋白/壳聚糖支架、丝素蛋白/明胶支架和丝素蛋白/明胶/壳聚糖支架，通过扫描电镜、X射线衍射、孔隙率、吸水膨胀率和生物降解率及力学性能等检测筛选出合适的软骨支架。然后将软骨支架与骨关节炎患者软骨细胞共培养，通过细胞黏附率、活死染色和增殖活性等检测体外评估多孔支架用于软骨损伤修复的可行性。结果与结论：(1)4组支架均具有多孔结构，综合物理性能检测结果得出丝素蛋白/明胶/壳聚糖支架更符合软骨缺损修复的要求，该支架的孔径为(176.00±53.68)μm，孔隙率为(80.15±2.57)%，吸水溶胀率为(3 712±358)%，体外浸泡于含溶菌酶的PBS中28 d后的生物降解速率为(46.87±3.25)%，且具有良好的机械性能；(2...     

胶原-壳聚糖支架与软骨细胞的生长

背景：目前软骨支架材料的种类比较多,但还没有一种材料能完全符合软骨修复的要求。 目的：观察在混合材料胶原-壳聚糖支架中软骨细胞的生长情况。 方法：采用冷冻干燥法将质量分数为2%胶原与3%壳聚糖混合制备胶原-壳聚糖多孔支架。将分离培养的第2代兔软骨细胞接种到胶原-壳聚糖支架上,对照组将软骨细胞接种到无支架的培养板中。观察支架的孔隙率、吸水性及内部形态结构,MTT法检测软骨细胞在支架上的增殖情况,组织切片苏木精-伊红染色,扫描电镜观察细胞在支架的生长、贴附情况,RT-PCR检测细胞支架复合物蛋白聚糖和Ⅱ型胶原mRNA表达情况。 结果与结论：胶原-壳聚糖支架的吸水性为(80.0±0.55)%,孔隙率为(88.5±1.5)%,孔径为100~150 μm,复合细胞培养2周后,细胞增殖活力高,软骨细胞分泌的蛋白聚糖和Ⅱ型胶原mRNA表达明显高于对照组。说明质量分数为2%胶原与3%壳聚糖的混合支架适合软骨细胞生长和快速增殖,是一种良好的修复和重建软骨载体。     

SIS重塑为海绵状后对BMSCs诱导的软骨细胞增殖分化的影响

目的观察大鼠骨髓干细胞(BMSCs)诱导分化的软骨细胞,在具有三维孔隙结构的海绵状猪小肠粘膜下层(SIS)表面的生长情况,探讨SIS由薄膜状重塑为海绵状后对软骨样细胞增殖分化的作用,为软骨组织工程提供新型的天然生物衍生材料。方法原代培养SD大鼠BMSCs,流式术检测细胞表面抗原表达;诱导BMSCs分化为软骨细胞,甲苯胺蓝染色鉴定。按Abraham法将猪近段空肠制备成脱细胞的SIS,再将薄膜状的SIS经液氮低温研磨制成微粒,交联后采用冷冻干燥技术重塑形为具有三维孔隙结构的海绵状SIS。将软骨细胞与海绵状SIS共培养:扫描电镜观察细胞生长状态;Western blotting检测共培养组织ColⅡ的表达;DMMB法测量葡萄糖胺聚糖(GAG)表达量。应用材料浸提液培养软骨细胞,相差显微镜观察细胞形态,MTT法检测细胞的增殖。结果原代培养的BMSCs表达干细胞相关抗原,并可分化为软骨细胞,甲苯胺蓝将糖胺多糖染成蓝色。脱细胞的SIS未见有核物质,海绵状的SIS具有大量较均匀的三维孔隙。软骨细胞能在材料孔隙内良好生长,软骨分化指标ColⅡ与GAG表达量明显增加;浸提液培养的软骨细胞增殖能力强。结论重塑形后具有三维孔隙结构的海绵状SIS促进BMSCs来源的软骨细胞增殖和分化,为软骨组织工程提供了新型的天然生物衍生材料。     

羟基丁酸-羟基辛酸共聚体/脱细胞软骨基质支架的细胞黏附性

背景:羟基丁酸-羟基辛酸共聚体[poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyoctanoate),PHBHOx]是一种新型的多聚羟基烷酸类材料,具有优良的可塑性、生物相容性、生物可降解性等性能,但同其他酯类材料相似,PHBHOx亲水性能较差,单纯PHBHOx材料支架细胞黏附性能明显不足。目的:观察羟基丁酸-羟基辛酸共聚体/脱细胞软骨基质支架的细胞黏附性。方法:取新鲜猪膝关节表面透明软骨,采用非离子型去污剂TritonX-100、低渗Tris-HCl以及Dna酶和Rna酶等进行脱细胞处理。低温粉碎后与PHBHOx以不同比例复合,采用溶剂浇铸-颗粒沥滤技术制备支架。分离培养猪关节软骨细胞,进行细胞-支架黏附实验并通过MTT比色法和扫描电镜观察软骨细胞在支架上的黏附存活情况。结果与结论:PHBHOx/脱细胞软骨基质支架的细胞黏附率较对照组显著提高,软骨细胞在支架上黏附紧密,生长良好。提示复合脱细胞软骨基质可以明显提高单纯PHBHOx支架的细胞黏附性能。     

胰岛素样生长因子1与转化生长因子β2促进组织工程软骨构建的体外实验

背景：软骨组织的再生能力差,软骨组织工程能利用较少的细胞、支架材料和细胞因子对缺损进行修复。 目的：观察胰岛素样生长因子1与转化生长因子β2联合应用对组织工程软骨形成的影响。 方法：用酶消化法获取人软骨细胞,将培养的细胞以4×10⁹ L^-1的细胞浓度接种在藻酸钙凝珠支架上,分别加入200 μg/L胰岛素样生长因子1和(或)1 μg/L转化生长因子β2进行立体培养。于培养的第3,5,7,9,11,13天,进行细胞计数,观察软骨细胞的增殖情况。培养2周后,进行大体形态观察和阿尔新蓝-过碘酸雪夫氏染色 (AB-PAS)及抗Ⅱ型胶原免疫组织化学染色。 结果与结论：细胞计数及免疫组织化学染色显示,胰岛素样生长因子1和转化生长因子β2均能促进软骨细胞增殖和软骨相关基质黏多糖及Ⅱ型胶原的分泌,其中胰岛素样生长因子1的作用主要体现在促细胞增殖方面,而转化生长因子β2的作用主要体现在促进软骨相关基质形成方面,二者联合应用具有促进组织工程软骨形成的协同作用。     

骨髓间充质干细胞与同种异体脱钙骨基质组合生长因子诱导向软骨细胞分化

背景：用组织工程学方法高质量修复关节软骨缺损并达到很好的远期疗效目前尚无定论。鉴于此,课题组提出“同种异体骨髓间充质干细胞关节腔内定向培养组织工程软骨”的实验设技。 目的：同种异体脱钙骨基质组合转化生长因子β1和胰岛素样生长因子Ⅰ诱导骨髓间充质干细胞向软骨分化的能力,同时探索其在关节腔内培养促进向关节软骨定向分化的方法。 方法：分离兔骨髓间充质干细胞并行体外培养,分为两组：实验组DMEM培养液中加入转化生长因子β1和胰岛素样生长因子Ⅰ,对照组中未加入诱导因子。比较两组细胞的增殖情况和成软骨分化情况。制备同种异体脱钙骨基质支架材料,实验组骨髓间充质干细胞负载到同种异体脱钙骨基质中,构建组织工程软骨复合体,取另2只兔的腰背筋膜包裹后缝合固定到30只兔膝关节腔内行腔内培养。分别于植入后4,8,12周各取10只标本进行组织学切片观察及Ⅱ型胶原免疫组织化学观测,并对结果进行分析。 结果与结论：实验组中骨髓间充质干细胞集落形成效率明显高于对照组(u=3.326,P < 0.01)。实验组细胞爬片做Ⅱ型胶原免疫组化检测呈阳性,对照组未见阳性细胞。组织工程复合体在腔内培养12周后,苏木精-伊红染色见大量软骨细胞增生,胞核染色呈蓝色;甲苯胺蓝染色见软骨细胞成串排列,大量软骨陷窝形成,周围大量基质包绕;Ⅱ型胶原免疫组织化学反应见细胞外基质中出现大量棕黄色颗粒,Ⅱ型胶原染色强阳性。提示转化生长因子β1和胰岛素样生长因子Ⅰ可显著促进骨髓间充质干细胞增殖和成软骨分化,骨髓间充质干细胞与同种异体脱钙骨基质结合后可在关节腔内成功培养出组织工程软骨。同种异体脱钙骨基质符合组织工程软骨支架材料的基本要求。