结核分枝杆菌Rv3872基因的克隆、表达和纯化

目的原核表达并纯化结核分枝杆菌Rv3872蛋白。方法聚合酶链反应（PCR）技术从结核分枝杆菌标准株H37Rv全基因组中扩增出的表达Rv3872基因序列，将其克隆到pMD18-T载体后，测序分析。亚克隆该目的基因到pET28a表达载体，最终转化至大肠杆菌BL21（DE3），获得正确的阳性克隆子后大量表达重组Rv3872蛋白，再经纯化、定量后，通过Western blot分析其抗原性。结果扩增Rv3872基因经序列测定与GenBank公布的序列完全一致，表达蛋白经SDS-PAGE分析，在约15000kD处有表达条带，纯化后的重组蛋白占总蛋白的90％以上。免疫印迹分析显示重组的Rv3872蛋白具有抗原性。结论成功表达结核分枝杆菌的Rv3872蛋白，为结核病血清学诊断候选抗原筛选和开发应用打下基础。     

结核分枝杆菌Rv0444c基因的克隆、表达及ELISA检测

目的：探索结核分枝杆菌Rv0444c基因编码的蛋白作为结核检测抗原的可行性。方法：首先克隆了结核分枝杆菌Rv0444c蛋白的编码基因，构建了pET30a—Rv0444c重组质粒，并将其成功的转化到大肠杆菌JF1125克隆载体中，测序鉴定结果正确。将pET30a—Rv0444c重组质粒转化到大肠杆菌BL21中，表达纯化目的蛋白并做质谱分析。制备Rv0444c蛋白的多克隆抗体，纯化的重组蛋白通过间接ELISA实验进行抗原性的初步检测．结果：重组抗原在检测耐药肺结核病人中的检出率为41．6％（25／60），特异性为90％。结论：为后续深入研究Rv0444c蛋白的生物功能、研究其作为诊断靶标、药靶候选蛋白的可行性提供了基础．     

结核分枝杆菌Rv1884c和Rv0867c基因的克隆表达及其促生长作用的研究

目的 构建结核分枝杆菌Rv1884c和Rv0867c基因的原核表达质粒,获得结核分枝杆菌Rvl884c和Rv0867c基因的表达蛋白,并初步研究其促生长作用.方法 制备结核分枝杆菌基因组DNA,采用PCR技术扩增目的 基因片段;将2个片段分别克隆入克隆载体pGEx-4T-1和pUC19,再分别克隆入原核表达载体pGEX-4T-1和pPRO-EXHT,经序列测定证实正确后,再经异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达GST标记的Rv1884c融合蛋白和His标记的Rv0867c融合蛋白;用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白的相对分子质量大小及表达形式.结果 成功扩增出了结核分枝杆菌Rv1884c和Rv0867c基因,构建了具有正确基因序列的质粒载体pGEX-4T-1-Rv1884c和pPRO-EXHT-Rv0867c,转化人大肠杆菌DH5α中经诱导产生高水平的表达产物.经SDS分析,在相对分子质量为45 000和80 000处出现新生蛋白带,凝胶薄层扫描检测表达量分别约占菌体蛋白的18.3%和23.7%.用GSTrap FF亲和层析柱和Ni2+-NTA纯化柱进行蛋白纯化,并研究这两种蛋白对藤黄微球菌、BCG和结核分枝杆菌H37Rv的促生长作用.结论 成功克隆了结核分枝杆菌Rv1884c和Rv0867c基因并得到了其大肠杆菌表达产物,为进一步研究Rv1884c和Rv0867c基因蛋白的活性及其功能,以及研究结核分枝杆菌快速促生长作用奠定了基础.     

徐州市结核分枝杆菌耐药原因分析

目的探讨徐州市结核分枝杆菌产生耐药的原因。方法采用发放调查表的方式对161例肺结核患者分别从年龄、收入、职业、文化程度、治疗史、密切接触史等方面进行调查。结果高中及以上文化程度的肺结核患者初治耐药率显著低于初中以下文化程度的肺结核患者(χ2=6.61,P=0.01),复治敏感患者与复治耐药患者在年龄、治疗史方面差异有统计学意义(t=2.99,P=0.01)、(χ2=5.25,P=0.02),中青年肺结核患者耐药率明显高于其他年龄组(χ2=6.30,4.10;P=0.01,0.04)。结论应加强对肺结核患者尤其是文化程度低的肺结核患者的宣教工作,采取切实有效的措施加强对肺结核患者的管理,把直接面视下短程化疗(DOTS)策略[1]落到实处,提高首次治愈率,减少耐药结核病的发生。     

耐药结核分枝杆菌基因变异研究

目的 研究多药结核分枝杆菌ｋａｉＧ、ｉｎｈＡ基因的变异机理。方法 用ｋａｔＧ、ｉｎｈＡ基因片引物，聚合酶链反应扩增产物，克隆后制质粒、直接测定ＤＮＡ序列。结果 １５株耐异烟肼菌株均有ｋａｔＧ基因突变，主要为点突变，其中１４株有４６３位和３１５位ＡＡＰ２密码改变，在１８个耐异烟肼菌株中，全部出现基因ｉｎｈＡ 基因变异，主要为点突和人，以单个点变异主，各菌株变异不同，ｋａｔＧ、ｉｎｈＡ基因同时出现变异     

结核分枝杆菌Rv3671c基因的克隆表达及免疫印迹检测

摘要：目的:构建结核分枝杆菌Rv3671c蛋白的重组质粒,在大肠埃希菌中表达并纯化重组蛋白Rv3671c,并评价结核分枝杆菌Rv3671c结构域多肽的免疫学特性。 方法：将编码结核分枝杆菌Rv3671c蛋白的基因克隆到pET-28a载体,并在大肠埃希菌中表达,镍亲和层析和离子层析法纯化重组Rv3671c蛋白,透析复性和Lowry法测定蛋白质浓度。对蛋白质悬液进行SDS-PAGE分析并进行免疫印迹检测。 结果：结核分枝杆菌Rv3671c蛋白在大肠埃希菌中成功表达,层析纯化获得纯度为95.0％的重组Rv3671c蛋白,免疫印迹检测显示重组表达蛋白与结核病患者混合血清具有良好亲和性。 结论：Rv3671c结构域多肽可作为新的结核病血清学检测方法的候选抗原肽组分。     

结核分枝杆菌对氧氟沙星、左氧氟沙星体外耐药监测

目的了解菌阳肺结核患者对氟喹诺酮药物的耐药现状,为临床制定标准化方案提供参考依据。方法选取2008年3月至2009年3月期间天津市海河医院门诊及住院菌阳肺结核病患者119例,对其结核分枝杆菌（MTB）临床分离株做氧氟沙星（OFLX）,左氧氟沙星（LVFX）药物敏感性试验。结果初治患者耐OFLX 10例（14.5%）,耐LVFX 3例（4.3%）;复治患者耐OFLX 30例（60.0%）,耐LVFX 22例（44.0%）;敏感菌耐OFLX 16例（19.0%）,耐LVFX 8例（9.5%）,耐药菌耐OFLX 24例（68.6%）,耐LVFX 17例（48.6%）;单耐药、多耐药、耐多药、严重耐多药耐OFLX分别为2例（40.0%）、10例（66.7%）、7例（77.8%）、5例（83.3%）,耐LVFX分别为2例（40.0%）、6例（40.0%）、5例（55.6%）、4例（66.7%）;氟喹诺酮用药时间≤2周、2周至1月、〉1-3月、〉3-6月、〉6月,耐OFLX分别为2例（33.3%）、4例（36.4%）、7例（50.0%）、9例（100%）、5例（100%）;耐LVFX分别为1例（16.7%）、2例（18.2%）、6例（42.9%）、6例（66.7%）、5例（100%）。结论复治结核病对氟喹诺酮的耐药率较高,耐药结核菌对氟喹诺酮耐药率也明显高于敏感菌,而严重耐多药及耐多药菌株耐药率明显高于其他耐药类型结核病。试管内耐药浓度与耐药率呈负相关。制定标准方案时LVFX优于OFLX。     

结核分枝杆菌抗原Rv2654c、Rv1985c和Rv3868的克隆表达及血清诊断学初步评价

目的 评价结核分枝杆菌蛋白抗原Rv2654c、Rv1985c和Rv3868的血清诊断价值和潜在应用前景。方法 以结核分枝杆菌H37Rv标准株全基因组DNA为模板扩增得到Rv2654c、Rv1985c和Rv3868基因的完整序列, 并与表达载体pET-32a构建重组质粒。原核表达Rv2654c、Rv1985c和Rv3868蛋白, 利用亲和层析的方法进行纯化。采用棋盘滴定的方法, 确定各抗原的酶联免疫吸附试验(ELISA)最佳反应条件, 并应用190份血清进行血清IgG抗体检测, 结合受试者工作特征曲线(ROC)对其诊断效能进行分析和评价。通过ROC计算各抗原组合的诊断效能, 确定最佳组合方案。结果 成功构建了重组蛋白, 对重组后的片段进行测序, 经BLAST比对与目的基因完全一致, 且能够稳定表达。对经纯化后的3种蛋白进行ELISA检测, 经统计学分析, Rv2654c、Rv1985c和Rv3868抗原的诊断效能分别达到73.16%、56.84%和71.05%。结合ROC得到最佳的抗原组合方案为Rv2654c+Rv3868, 其敏感性、特异性和诊断效能分别达到78.95%、72.63%和75.79%。结论 结核分枝杆菌重组抗原Rv2654c、Rv1985c和Rv3868具有作为结核病诊断抗原的潜力, 可以作为结核病免疫学快速诊断的候选蛋白。抗原组合Rv2654c+Rv3868具有较高的诊断效能, 有较好的潜在应用价值。     

三种外排泵抑制剂对氧氟沙星药物抗结核分枝杆菌最低抑菌浓度的影响

目的研究三种外排泵抑制剂对氧氟沙星(OFLX)抗结核分枝杆菌最低抑菌浓度(MIC)的影响。方法在96孔板上应用加入变色剂的7H9培养基进行实验。OFLX经倍比稀释后一系列药物浓度对12株结核分枝杆菌临床分离株的抑菌作用作为对照。经过实验确定羰基氰氯苯腙、维拉帕米和利血平三种常用外排泵抑制剂对OFLX抗结核分枝杆菌MIC的影响。结果三种泵抑制剂对OFLX抗8株OFLX耐药菌MIC呈现了不同程度的影响。在8株耐药菌中利血平对OFLX的MIC值降低了32～64倍,影响均非常明显。8株耐药菌中的6株菌维拉帕米与羰基氰氯苯腙两种泵抑制剂对OFLX的MIC影响程度相同,其中4株菌的MIC值几乎不影响,另外2株菌的MIC值降低了32倍。8株耐药菌中的另2株菌维拉帕米与羰基氰氯苯腙对OFLX的MIC值影响的差异却高达32倍。三种泵抑制剂对4株敏感菌OFLX的MIC影响相对一致,影响总体表现较小。结论三种抑制剂因其机制不同导致其对OFLX抗结核分枝杆菌的影响存在差异。对敏感菌影响相对一致,对耐药菌呈现不同的影响程度。     

浙江省丽水市结核分枝杆菌临床分离株耐药性及基因突变情况

目的 调查浙江省丽水市结核病定点医院患者结核分枝杆菌（MTB）临床分离株耐药特征及耐药基因突变情况，为该地区耐药结核病防控提供依据。方法 采用荧光PCR熔解曲线法对培养自丽水市结核病定点医院结核病患者MTB临床分离株进行抗结核药物耐药性及耐药基因突变位点检测及分析。结果 242株MTB总耐药突变占16.53%(40/242)，耐多药率为4.96%(12/242)，耐药顺位分别为异烟肼>链霉素>利福平>氟喹诺酮类>乙胺丁醇。链霉素耐药株基因突变位点主要发生在rpsL43位密码子，占比为65.00%(13/20)；异烟肼耐药基因突变位点主要发生在katG315密码子，占比为76.19%(14/21)；利福平耐药基因突变位点主要发生在rpoB基因529-533位密码子，占比为61.11%(11/18)；乙胺丁醇耐药基因突变位点主要发生在embB306位密码子，占77.78%(7/9)。结论 丽水市结核患者总体耐药突变低于全国耐药水平，但耐药模式和耐药基因突变情况仍较为复杂，需进一步加强耐药结核病监测及防控工作。     

Drug resistance in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from Brazil: Phenotypic and genotypic methods

We determined the susceptibility profile of 80 Mycobacterium tuberculosis (MTB) clinical isolates from Brazil against isoniazid (INH) and rifampicin (RIF) drugs by two phenotypic methods (Resazurin Microtiter Assay - REMA and BACTEC™ MGIT™ Mycobacterial Detection System). DNA polymorphisms were also determined by PCR-SSCP in isolates resistant to INH and RIF. BACTEC™ MGIT™ 960 detected 22 susceptible isolates to INH and RIF, 48 MDR isolates (resistant at least to INH and RIF) and nine mono-resistant isolates (eight to INH and one to RIF). REMA performance was determined by Receiver Operating Characteristic curve, whose assay was validated utilizing as reference the BACTEC™ MGIT™ 960 system. ROC curve showed cut-off values of 0.0625 μg/mL and 0.125 μg/mL, for INH and RIF, respectively. REMA-INH demonstrated sensitivity and specificity of 100% while REMA-RIF showed sensitivity of 97.2% and specificity of 100%. PCR-SSCP detected DNA polymorphisms in 87.5% and 75.5% of isolates classified as INH-resistant and RIF-resistant, respectively. One discordant sample found to RIF (resistant by BACTEC™ MGIT™ 960 and susceptible by REMA) showed no mutation by PCR-SSCP. In conclusion, our studies demonstrated that the combination of phenotypic method REMA, which allowed rapid detection of MDR-MTB with higher levels of sensitivity and specificity, with the genotypic method PCR-SSCP, which demonstrated high accuracy in the search of polymorphisms in the resistance genes, proved to be a useful strategy to study MDR-MTB clinical isolates from national reference center located in São Paulo city.     

A simple gold nanoparticle probes assay for identification of Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium tuberculosis complex from clinical specimens

We had previously developed a nested polymerase chain reaction (PCR)–immunochromatography test (ICT) for identification of Mycobacterium tuberculosis (MTB) and differentiation of MTB from other members of M. tuberculosis complex (MTBC) from clinical sputum samples (Soo P.C. et al., Journal of Microbiological Methods. 2006, 66(3):440–8.). To further improve the detection flexibility, simplicity and efficiency, and reduce the cost, in this study, an alternative molecular diagnosis assay that utilizes gold nanoparticles derivatized with thiol modified oligonucleotides was developed. The gold nanoparticles probes, GP-1/GP-2 for IS6110 and GP-3/GP-4 for Rv3618, were designed to specifically hybridize with target DNAs of MTBC and MTB strains, respectively. Efficacy of the gold nanoparticle probes assay was evaluated by directly and simultaneously detecting not only MTBC but also MTB from 600 clinical sputum specimens. Results were compared with traditional culture and biochemical identification methods together with patients' clinical assessments. This assay showed a 96.6% sensitivity and 98.9% specificity towards detection of MTBC, and a 94.7% sensitivity and 99.6% specificity for detection of MTB. In conclusion, the gold nanoparticle probes assay is a simple, rapid, cost-effective and accurate detection system and shows great potential in clinical application of MTBC and MTB detection, especially in developing countries.     

广西壮族自治区结核分枝杆菌异烟肼与利福平耐药基因联合突变特征分析

  目的   了解广西壮族自治区（广西）结核分枝杆菌异烟肼与利福平耐药基因联合突变特征，为耐多药结核病的分子诊断和治疗提供依据。  方法   2017—2018年从广西30个结核病防治定点机构收集的结核分枝杆菌中选取49株耐多药菌株和459株全敏感菌株进行全基因组测序。  结果   耐多药表型与基因联合突变的符合率为71.43%。 单基因突变率和基因联合突变率在耐多药菌株中均高于全敏感菌株（χ2=5.753，P=0.016; χ2=284.034，P<0.001）。 katG和rpoB的单基因突变率在耐多药菌株中高于全敏感菌株（χ2=7.524，P=0.006; χ2=4.353，P=0.037）。 katG＋rpoB基因联合突变在耐多药菌株中高于全敏感菌株（χ2=279.956，P<0.001）。 在基因联合突变的位点分布中，以katG315＋rpoB450和katG315＋rpoB445位点突变为主，占40.82%（20/49），2种形式的基因位点联合突变率在耐多药菌株中均高于全敏感菌株（χ2=144.232，P<0.001; χ2=19.014，P<0.001）。  结论   对异烟肼和利福平耐药基因联合突变的检测可作为广西耐多药筛查的重要指标。 广西结核分枝杆菌异烟肼和利福平耐药基因突变以katG315、rpoB450和rpoB445位点突变为主，基因联合突变以katG＋rpoB形式为主。 katG315＋rpoB450和katG315＋rpoB445位点突变是广西地区耐多药产生的主要分子机制。     

老年科鲍曼不动杆菌耐药性及外排泵基因研究

目的 观察老年科临床分离鲍曼不动杆菌对常用抗菌药物的敏感性及外排泵基因携带情况,为医院感染防控和临床合理用药提供理论依据。方法 收集老年科临床分离的非重复鲍曼不动杆菌85株,采用纸片扩散法检测其对临床常用的15种抗菌药物的敏感性,并采用聚合酶链反应(PCR)方法检测adeB、adeG和adeJ基因的携带情况。结果 鲍曼不动杆菌对多黏菌素B的敏感率为100.0%,对米诺环素(29.4%)、头孢哌酮-舒巴坦(35.3%)、阿米卡星(38.8%)和庆大霉素(41.2%)的耐药率较低,对其他检测药物的耐药率均超过50.0%,其中多重耐药菌为49株(占57.6%)。PCR结果显示,多重耐药鲍曼不动杆菌adeB、adeG和adeJ外排泵基因的阳性率分别为73.5%、77.6%和71.4%,高于非多重耐药鲍曼不动杆菌,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 老年科鲍曼不动杆菌耐药形势较严峻,其多重耐药与携带adeB、adeG和adeJ基因相关。     

鲍曼不动杆菌耐药性监测与外排泵adeB基因表达水平检测

目的 探讨鲍曼不动杆菌临床分离株的耐药性以及外排泵adeB基因的表达情况.方法 琼脂稀释法检测最低抑菌浓度(MIC)、聚合酶链反应(PCR)扩增adeB基因,逆转录PCR(rt-PCR)检测adeB基因的mRNA表达水平.结果 药敏试验结果显示,60株鲍曼不动杆菌对哌拉西林耐药率最高(92.3%),对亚胺培南耐药率最低...     

两种常见非结核分枝杆菌与结核分枝杆菌基因同源抗原、B细胞抗原表位和抗体交叉反应研究

目的 探讨我国常见两种非结核分枝杆菌与结核分枝杆菌蛋白抗原的交叉免疫反应状况，为以非结核分枝杆菌研制新型结核疫苗提供参考依据。方法 平均核酸一致性计算器计算胞内分枝杆菌、脓肿分枝杆菌和结核分枝杆菌的基因组同源性，OrthorFinder软件分析3种菌的同源基因，与结核分枝杆菌B细胞抗原表位编码基因进行比对。分别制备3种菌的灭活菌体抗原和全菌蛋白抗原，对新西兰大白兔进行皮下注射免疫。采用间接酶联免疫吸附试验技术，分别检测3种免疫兔血清抗体Ig G水平及交叉免疫的血清抗体Ig G水平。结果 脓肿分枝杆菌、胞内分枝杆菌与结核分枝杆菌同源基因分别为2 350个和2 740个，其同源基因中分别有479个和521个富含B细胞抗原表位。结核分枝杆菌、胞内分枝杆菌和脓肿分枝杆菌的蛋白抗原均能刺激兔产生较高水平的抗体滴度，分别达到1∶320 000、1∶160 000和1∶80 000。胞内分枝杆菌和脓肿分枝杆菌免疫兔血清均可与结核分枝杆菌抗原产生高水平的交叉反应，抗体滴度分别达到1∶40 000和1∶80 000。结论 胞内分枝杆菌、脓肿分枝杆菌与结核分枝杆菌之间均存在高水平的抗体交叉免疫反应，提示上...     

泛耐药鲍曼不动杆菌主动外排泵adeB基因表达及耐药性研究

目的：探讨细菌主动外排泵adeB基因在临床分离的泛耐药鲍曼不动杆菌耐药性中的作用。方法琼脂稀释法检测临床分离泛耐药鲍曼不动杆菌经外排泵抑制剂羰基氰氯苯腙(CCCP)处理前后对抗生素最小抑菌浓度(MIC)变化,以聚合酶链反应(PCR)、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测外排泵基因adeB及其表达水平。结果50株泛耐药鲍曼不动杆菌临床株加入CCCP后,MIC值小于原值的1/4或1/4以下的四环素42株(84％)、氧氟沙星45株(90％)、亚胺培南45株(90％)、头孢噻肟50株(100％)、庆大霉素50株(100％)。50株泛耐药鲍曼不动杆菌临床株和4株敏感菌株均检测到adeB基因,但泛耐药株表达水平明显高于敏感株(P<0.01)。结论泛耐药鲍曼不动杆菌耐药性与外排泵adeB基因高表达密切相关。     

Plasmid-mediated fluoroquinolone efflux pump gene, qepA, in Escherichia coli clinical isolates in Korea

The qepA gene was detected in 4 (0.6%) of 621 nonduplicate Escherichia coli clinical isolates collected from blood cultures in Korea. Three of the 4 qepA-positive isolates contained bla_CTX-M-14 and/or bla_TEM-1 genes, but not the E8700 isolate. The qepA gene was successfully transferred and conferred resistance to hydrophilic quinolones, such as norfloxacin and ciprofloxacin, in the recipient. The gene was located in part of IS26. Two isolates were linked to the truncated rmtB gene.