长链非编码 RNA Gm15577参与小鼠小脑神经元增殖与分化

目的鉴定新的参与奈美亨综合征（ NBS ）小鼠模型中与小脑发育缺陷相关的长链非编码RNA（ lncRNA）,并探讨其与小脑增殖分化相关的功能。方法利用芯片技术分析野生型（野生组,Nbs1CNS-ctr）小鼠及Nbs1神经元特异性敲除（突变组,Nbs1CNS-del）小鼠小脑中RNA的表达差异;利用即时荧光定量PCR技术对芯片结果加以验证;针对目的RNA,检测其全身表达及小脑中表达模式、细胞内定位以及对母基因的表达调控模式。结果 lncRNA Gm15577是由神经生长调节因子-1（ Negr1）基因内部的内含子区反向转录而成,特异性表达于小脑,且在其发育过程中呈动态变化趋势,而Nbs1缺失之后整体表达水平显著降低;同时,与未分化期比较,分化后的小鼠小脑原代神经前体细胞中Gm15577及其母基因Negr1均有显著升高;Gm15577敲低之后导致Negr1以及小脑增殖分化相关因子Shh与β-catenin 在RNA水平的表达显著下调;人髓母细胞瘤临床样本数据分析表明Negr1基因在正常人群与肿瘤患者之间有显著的表达差异。结论从神经特异性敲除Nbs1小鼠模型出发报道了一个新的与小鼠小脑发育相关的lncRNA Gm15577,初步结果表明Gm15577通过调控Negr1进而影响小脑神经元增殖与分化进程中的Shh与β-catenin信号通路,其基因行为异常有可能与髓母细胞瘤发病有一定的相关性。     

甲基转移酶样蛋白3(METTL3)通过NF-κB信号通路促进小鼠巨噬细胞活化和炎症反应

目的研究参与腺嘌呤第6位氮原子上的甲基化修饰(m~6A)的甲基转移酶样蛋白3(METTL3)在巨噬细胞活化中的作用。方法体外培养小鼠RAW264.7巨噬细胞,并以1μg/mL脂多糖(LPS)刺激0、 2、 4、 6 h,检测METTL3的表达情况。设计合成的针对小鼠METTL3的小干扰RNA(siRNA)敲低METTL3的表达,通过实时定量PCR和Western blot法检测干扰效率;利用siRNA下调METTL3表达48 h后,以1μg/mL LPS刺激RAW264.7细胞,采用实时定量PCR检测白细胞介素6 (IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、 IL-12、IL-1β的mRNA水平, Western blot法检测核因子κB (NF-κB)信号通路中p65和磷酸化p65蛋白水平。结果 LPS刺激后RAW264.7细胞METTL3的表达上调,设计合成的METTL3 siRNA能有效敲低METTL3的水平。敲低METTL3后,巨噬细胞LPS刺激诱导表达的IL-6、 IL-12、 TNF-α和IL-1β显著降低,同时伴有NF-κВ信号通路p65蛋白的磷酸化水平降低。结论 METTL3通过激活NF-κВ信号通路促进LPS刺激的巨噬细胞活化和炎症反应。     

基于生物信息学挖掘m6A阅读蛋白YTHDC1在卵巢癌中的表达及作用机理北大核心CSCD

目的:基于生物信息学方法挖掘m6A阅读蛋白YTHDC1在卵巢癌中的表达及可能的作用机制,为进一步研究YTHDC1在卵巢癌中的意义提供理论依据。方法:收集Oncomine数据库YTHDC1基因表达信息,分析其在卵巢癌中的表达。利用Kaplan-Meier数据库分析YTHDC1基因与卵巢癌患者生存的关系。通过STRING数据库研究YTHDC1基因相关蛋白网络及相关蛋白功能富集分析。TIMER数据库挖掘YTHDC1基因与免疫浸润细胞的关系,探究其作用机制。结果:在Oncomine数据库中共有11项与YTHDC1基因在卵巢癌组织和正常组织中表达的相关研究,与正常组比较,YTHDC1在卵巢癌中呈低表达,差异有统计学意义(P<0.05),通过Kaplan-Meier生存分析发现,YTHDC1基因低表达组无病生存率明显高于高表达组(P=0.00014)。通过STRING数据库收集到YTHDC1主要相关蛋白有METTL3,METTL14等10个。以上蛋白主要富集在生物代谢、免疫进程等方面。通过TIMER数据库分析YTHDC1与免疫浸润细胞的关系,发现YTHDC1基因与CD4+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞呈正相关,与B细胞、树突状细胞、NK细胞呈负相关(P<0.05),与CD8+T细胞无明显相关性(P>0.05)。结论:YTHDC1在卵巢癌中低表达,其可能通过m6A修饰调节生物代谢,促进抗肿瘤免疫,抑制肿瘤细胞的发生发展,发挥抑癌基因作用,该基因也许可以作为卵巢癌诊疗的一个靶点,但其具体的作用机制还需要进一步的研究及实验验证。     

与小鼠小脑发育相关的一种长非编码RNA Gm2694的鉴定

目的鉴定与小鼠小脑发育相关的长非编码RNA,并验证其各剪接变异体的存在。方法用芯片技术分析小鼠小脑发育不同阶段RNA的表达差异;用实时定量PCR技术对芯片结果加以验证;针对目的 RNA,验证其各剪接变异体的存在及在小鼠小脑中的表达量。结果 1)长非编码RNA Gm2694在小鼠小脑发育过程中呈动态变化趋势;2)其在小鼠小脑中特异性表达;3)在小鼠小脑中检测到Gm2694有8种表达水平各不相同的剪接变异体,其中除Ensembl数据库预测的7个之外,发现了1个新的表达于小脑的剪接变异体。结论 Gm2694是一种在小鼠小脑特异性表达的长非编码RNA,存在8种表达量各不相同的剪接变异体。     

N6-甲基腺嘌呤调控因子对宫颈癌预后及免疫浸润的作用

目的：探究N6-甲基腺嘌呤（m6A）RNA甲基化调控因子对宫颈癌预后及肿瘤免疫微环境的潜在作用及机制。方法：从TCGA和GEO数据库下载宫颈癌转录组表达数据和相应临床数据，通过生物信息学方法和组织验证实验分析m6A调控因子表达及相关性，LASSO Cox回归分析建立m6A预后相关风险预测模型，一致性聚类分析确定2种m6A修饰模式，ssGSEA分析两组间免疫细胞浸润相对丰度。结果：与正常组织相比，宫颈癌组织RBM15、IGF2BP2、IGF2BP3、FMR1、YTHDF1、METTL3和YTHDF2表达显著上调，而ZC3H13、METTL14、YTHDC1、FTO和ALKBH3表达显著下调。选择5个m6A调控因子HNRNPC、LRPPRC、METTL3、ELAVL1和FMR1建立风险预后模型，HPA数据库和qRT-PCR验证其在宫颈癌组织中的表达，该模型具有较好的预测价值，可作为独立的预后指标（AUC=0.734）。基于25个m6A调控因子表达确定了2种m6A修饰模式，即m6Acluster A和m6Acluster B，两组生物学功能及信号通路和肿瘤微环境中免疫细胞浸润水平存在差异。结...     

小脑发育过程中Atoh1时空表达模式

目的 探究小脑发育过程中转录因子Atoh1 mRNA及其蛋白的时空表达模式。方法 取不同发育阶段的小鼠小脑冷冻切片，RNA scope技术分析Atoh1 mRNA在小脑中的时空表达模式，每组n=3。同时，使用Atoh1转基因和基因敲入两种不同遗传学策略的报告小鼠，采用免疫荧光染色技术分析Atoh1在蛋白水平的时空表达，每组n=3。结果 Atoh1 mRNA在胚胎小脑菱唇和外颗粒细胞层中呈高表达；Atoh1-3^*V5-P2A-tdTomato/+基因敲入小鼠染色结果显示，Atoh1主要表达在菱唇和有增殖能力的外颗粒细胞层的外层；Atoh1-Cre; tdTomato/+转基因小鼠显示，Atoh1阳性细胞在菱唇和整个颗粒细胞发育过程中包括外颗粒细胞层和内颗粒细胞层中均呈高表达。结论 小脑发育过程中，Atoh1 mRNA和蛋白在胚胎期的菱唇和出生后的外颗粒细胞层中高丰度表达；但在蛋白水平上，基因敲入小鼠和转基因小鼠Atoh1在菱唇和外颗粒细胞层中的表达略有不同。     

类甲基化转移酶3(METTL3)在免疫细胞和造血干细胞中的作用研究进展

腺嘌呤第6位氮原子上发生的甲基化修饰(m~6A)是真核生物mRNA中最常见的甲基化修饰,m~6A作为一种动态可逆修饰,参与众多生物学过程。类甲基化转移酶3(METTL3)是构成m~6A甲基转移酶复合体的核心组分,负责催化RNA发生m~6A修饰。近年的研究发现,METTL3通过调控m~6A水平,调节T淋巴细胞的分化和功能的维持、巨噬细胞的活化和极化以及树突状细胞的激活等过程,进而调控免疫反应和有关疾病的发生和发展;同时很多研究也报导,METTL3在内皮造血转化、造血干细胞的自我更新、增殖分化以及细胞周期调控方面也具有重要作用,这为临床上治疗血液系统的有关疾病提供了新思路。     

小鼠髓母细胞瘤细胞系的建立与鉴定

目的 建立表达PARP-1和P53基因双缺失的小鼠髓母细胞瘤细胞系,为研究髓母细胞瘤（medulloblastoma,MB）发生机制提供细胞模型。方法 对小鼠髓母细胞瘤细胞进行原代培养,体外传代观察,传代30次以上对培养细胞进行形态学观察、细胞标志性蛋白的免疫荧光分析、用Western blot法检测PARP-1蛋白的表达、用含有PARP-1蛋白功能区域的重组质粒pEGFP-C1-Hparp-1和绿色荧光蛋白空质粒pEGFP-C1转染细胞进行检测。结果 新建立的小鼠髓母细胞瘤细胞系,呈多角形、短梭形,免疫荧光分析可见未成熟神经元标志性蛋白Vimentin、Dcx、 III-Tubulin等表达阳性,Western blot检测PARP-1蛋白阴性,导入外源PAPR-1基因后呈阳性。结论 成功的建立了DNA损伤修复蛋白功能缺陷的小脑神经源性髓母细胞瘤细胞系,有助于深入研究髓母细胞瘤的病因及发病机制。     

髓母细胞瘤与幕上原始神经外胚叶肿瘤中RASSF1A基因的甲基化差异

目的通过研究髓母细胞瘤与幕上原始神经外胚叶肿瘤（SPNET）中RASSF1A基因的甲基化改变,探讨颅内原始神经外胚叶肿瘤（PNET）的不同亚型中该基因的表遗传学差异及其意义。方法收集25例原发髓母细胞瘤,9例原发SPNET,3株髓母细胞瘤细胞系和2株SPNET细胞系。采用甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）检测RASSF1A基因启动子区的甲基化状态。应用去甲基化试剂5-aza-2’deoxycytidine处理存在基因表达缺失的细胞系,探讨基因表达与甲基化之间的关系。结果100％（25／25）的原发髓母细胞瘤、6／9的原发SPNET及全部PNET细胞系中均检测到RASSFIA基因的甲基化。相反,该基因甲基化在全部正常组织（包括2例小脑,5例大脑）中均未检测到。并且,RASSF1A在SPNET中的甲基化率明显低于髓母细胞瘤（Fisher精确检验,P=0．014）。在经去甲基化试剂处理的PNET细胞中,该基因表达得以恢复,证明甲基化与该基因沉默相关。结论RASSF1A甲基化是肿瘤特异性的,RASSF1A甲基化与PNET的发生有一定关联,不同亚型的PNET之间RASSF1A基因的不同甲基化状态提示髓母细胞瘤和SPNET是表遗传学上存在差异的两类肿瘤。     

RNA m6A去甲基化酶ALKBH5基因敲除对老年小鼠小脑形态和功能的影响

目的观察RNA m6A去甲基化酶ALKBH5基因敲除之后对老年小鼠小脑形态和功能的影响, 探究ALKBH5在小脑退行性病变中的作用。方法免疫印迹实验检测不同年龄C57BL/6野生型小鼠(包括2月龄、6月龄、12月龄、18月龄)小脑中ALKBH5的蛋白水平。通过免疫组织化学实验检测中年(12月龄)及老年(18月龄)野生型小鼠和ALKBH5基因敲除(ALKBH5-/-)小鼠中NeuN、Calbindin-D28K、MAP2、胶质纤维酸性蛋白等蛋白的表达情况。平衡木实验和步态实验检测小鼠平衡能力以及运动协调能力。结果 ALKBH5蛋白在小脑中的表达水平随着小鼠生理性衰老的进行而逐渐升高。在中年小鼠中, 野生型和ALKBH5-/-小鼠的体重、脑重以及小脑的形态大小没有明显差别, 同时颗粒神经元、浦肯野细胞及神经元树突的形态和数量均未见明显改变。在老年小鼠中, 相较于野生型小鼠, ALKBH5-/-小鼠的体重、全脑重和小脑重分别下降15%、10%和21%(P<0.05)。ALKBH5在浦肯野细胞中的表达高于其他类型的神经细胞, 与之对应在老年ALKBH5-/-小鼠中浦肯野神经元的数量下降4...     

ALDH18A1调控神经母细胞瘤MYCN表达

目的探究乙醛脱氢酶18家族成员A1(ALDH18A1)与神经母细胞瘤恶性程度的关系及调控机制。方法免疫组化检测88例神经母细胞瘤患者中ALDH18A1和MYCN的表达以及同神经瘤恶性程度的关系,用转染ALDH18A1过表达和敲低载体对神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y进行干预,Western blot检测MYCN蛋白表达;定量PCR检测MYCN的mRNA水平。结果在神经母细胞瘤组织中,ALDH18A1的表达在不同发病时间、肿瘤分期以及转移程度的患者中均呈显著差异(P0.001),同时MYCN同ALDH18A1的表达呈显著正相关(P0.001)。在ALDH18A1过表达组的SH-SY5Y细胞中,MYCN的蛋白及mRNA水平均大于ALDH18A1敲低组(P0.001)。结论 ALDH18A1能够通过促进MYCN的表达而加剧神经母细胞瘤的恶性程度。     

Prdx1基因敲减促进氧糖剥夺/复氧诱导的小鼠神经母细胞瘤N2a细胞凋亡

目的:观察过氧化还原蛋白1(Prdx1)基因敲减对氧糖剥夺/复氧(OGD/R)诱导的小鼠神经母细胞瘤N2a细胞凋亡的作用,并进一步探讨其可能机制。方法:体外培养小鼠神经母细胞瘤N2a细胞,构建OGD/R诱导的N2a细胞损伤模型。将对数生长期的N2a细胞随机分为正常对照组、OGD/R组、OGD/R+c-Jun氨基末端激酶(JNK)抑制剂(SP600125)组、OGD/R+阴性对照序列(siNC)组、OGD/R+siPrdx1组和OGD/R+siPrdx1+SP600125组。用siRNA转染细胞;CCK-8比色法检测细胞活力;TUNEL染色法检测细胞凋亡;RT-qPCR检测Prdx1 mRNA的表达;Western blot检测Prdx1、JNK、磷酸化JNK(p-JNK)及凋亡执行蛋白cleaved caspase-3的蛋白水平。结果:体外培养的小鼠神经母细胞瘤N2a细胞经OGD/R处理后出现明显损伤,表现为细胞活力显著降低(P0.05),细胞凋亡率显著增高(P0.05);此外,Prdx1蛋白表达水平亦增高(P0.05)。Prdx1基因敲减显著促进了OGD/R诱导的JNK和caspase-3激活(P0.05),细胞活力显著降低(P0.05),同时显著加剧细胞凋亡(P0.05)。SP600125可显著抑制OGD/R诱导的JNK和caspase-3激活(P0.05),减少细胞凋亡(P0.05),逆转OGD/R条件下Prdx1基因敲减对N2a细胞的损伤作用。结论:Prdx1基因敲减促进OGD/R诱导的小鼠神经母细胞瘤N2a细胞凋亡,其机制与进一步激活JNK/caspase-3信号通路有关。     

RNA N6-甲基腺苷(m6A)修饰相关酶在哺乳动物精子发生中的研究进展

N6-甲基腺苷(m6A)核酸修饰是近10年来研究较多的一类表观修饰，RNA通过经典m6A修饰蛋白“Writers”(METTL3/14/WTAP等)、m6A去修饰蛋白“Erasers”(FTO和ALKBH5)和m6A识别蛋白“Readers”(YTHDC1/2、YTHDF1/2/3等)组成的协同调节体系进行转录后核酸m6A修饰、去修饰和识别结合，进而调控转录本下游命运。精子发生是雄性哺乳动物性成熟和维持生育能力的重要过程，涉及生精上皮支持细胞、间质细胞和精原细胞等增殖分化和维持生精微环境过程。多项研究表明m6A调节体系参与哺乳动物精子发生进程，异常的m6A修饰水平和m6A调节体系失衡均会导致睾丸发育异常、精子发生异常和雄性不育。本文综述了精子发生过程中m6A修饰相关酶的作用，深入分析m6A差异修饰转录本之于正常精子发生的作用，对认知哺乳动物精子发生和解析临床生精障碍的分子机制具有重要意义。     

METTL3调控SPRING1促进巨噬细胞脂质蓄积

目的 探讨METTL3调控SPRING1促进巨噬细胞脂质蓄积的作用及机制。 方法 100 ng/mL PMA诱导THP-1细胞贴壁后,50 μg/mL Ac-LDL孵育THP-1细胞。Western blot测定METTL3和SPRING1蛋白;qRT-PCR测定SPRING1mRNA水平;细胞内总胆固醇、胆固醇酯以及游离胆固醇变化用高效液相色谱法检测;SRAMP和RMBase网站分析SPRING1 mRNA上的m6A修饰位点情况;质膜红色荧光标记探针Dil-Ac-LDL观察巨噬细胞脂滴摄取情况。 结果 与对照组相比,Ac-LDL孵育后THP-1细胞METTL3和SPRING1蛋白表达上调,并且SPRING1 mRNA水平上调;过表达METTL3会使SPRING1蛋白表达上调,巨噬细胞对脂质摄取增加,细胞内Dil-Ac-LDL明显增多;反之,沉默METTL3表达,SPRING1蛋白表达下调;甲基化抑制剂环亮氨酸处理可部分抑制METTL3过表达对SPRING1表达的促进作用;生物信息学分析显示,SPRING1 mRNA存在m6A修饰位点。 结论 METTL3上调SPRING1表达,促进巨噬细胞脂质蓄积。     

ALK表达是WNT活化型儿童髓母细胞瘤新的标志物和预后良好指标

<正>ALK基因重排已被证实存在于包括神经母细胞瘤在内的多种肿瘤中,ALK表达与不良预后相关。近期发现在儿童脑髓母细胞瘤中存在ALK基因突变,微阵列数据表明,ALK在这些肿瘤的亚型中呈高表达。为此,作者对ALK表达与髓母细胞瘤的转录模式及临床特征的相关性进行分析。作者分别从RNA和蛋白水平分析116例儿童髓母细胞瘤患者的ALK表达情况。RNA水平及蛋白检测分别采用NanoS tring技术及免疫组化技术,结果显示,髓母细胞瘤的4     

β淀粉样蛋白及代谢酶类在阿尔茨海默病和糖尿病模型小鼠脑内的表达

目的观察阿尔茨海默病(AD)和糖尿病模型小鼠脑内β淀粉样蛋白(Aβ)及代谢相关酶类的表达情况,以便从分子水平找到糖尿病并发AD的实验室依据。方法 5月龄双转基因痴呆症模型小鼠(APP/PS1双转基因小鼠)、ob/ob T2DM肥胖模型小鼠和野生型C57BL/6J小鼠为对照,分别用免疫组化染色、ELISA和Western blot检测脑内老年斑(SP)、Aβ含量及Aβ代谢酶类的表达情况。结果 APP/PS1小鼠大脑皮质及海马均可见一定数量的SP;ob/ob小鼠大脑皮质内偶可见SP,而对照组未见SP。与对照小鼠相比,APP/PS1与ob/ob小鼠脑内Aβ40、Aβ42的含量明显升高(P0.05);但APP/PS1小鼠脑内Aβ水平显著高于ob/ob小鼠(P0.05)。APP在APP/PS1小鼠脑内的表达显著高于其他两组小鼠;在ob/ob小鼠脑内的表达要强于对照小鼠(P0.05)。Aβ生成的关键酶BACE1在APP/PS1与ob/ob小鼠脑内的表达显著高于对照小鼠(P0.05),但其在APP/PS1小鼠脑内的表达要强于ob/ob小鼠(P0.05)。Aβ降解的关键酶IDE在APP/PS1与ob/ob小鼠脑内的表达显著低于对照小鼠(P0.05),且在ob/ob小鼠脑内表达最低。结论 Aβ生成与降解的异常以及其异常聚集沉积不仅发生在早期AD脑内,同时也发生在T2DM脑内,提示Aβ过表达可能是促进2型糖尿病并发AD的重要原因之一。     

周期蛋白依赖性激酶2对小鼠神经母细胞瘤免疫微环境的影响北大核心CSCD

目的探讨周期蛋白依赖性激酶(CDK2)对小鼠神经母细胞瘤免疫微环境的影响。方法评估CDK2抑制剂PF-07104091对皮下MYCN阴性神经母细胞瘤细胞SH-EP在C57BL/6N WT小鼠体内肿瘤生长的影响。评估CDK2稳定敲低MYCN的阴性神经母细胞瘤细胞在C57BL/6N WT小鼠体内的成瘤能力。评估CDK2抑制剂或者敲低CDK2对MYCN阴性神经母细胞瘤细胞增殖水平和凋亡水平的影响。探索CDK2抑制剂或者敲低CDK2是否影响MYCN阴性神经母细胞瘤免疫微环境。结果PF-07104091显著抑制MYCN阴性神经母细胞瘤生长并增加小鼠总生存率。CDK2敲低能够显著抑制肿瘤生长并增加小鼠总生存率。CDK2抑制剂或者敲低CDK2并不影响MYCN阴性神经母细胞瘤细胞的增殖水平和凋亡水平。CDK2抑制剂或者敲低CDK2的MYCN阴性神经母细胞瘤中观察到的CD3+T细胞、CD4^(+)T细胞、CD8^(+)T细胞和DC细胞的比例显著升高。CDK2抑制剂处理或者敲低CDK2后,MYCN阴性神经母细胞瘤中IFN-γ的水平上升,并且IFN-γ通路中的关键基因IFNB1、STAT1、TLR3、DDX58、CCL17、TAP1、TX2表达上调。腹腔注射或不注射CDK2抑制剂PF-07104091并不影响IFNGR1^(-/-)小鼠的生长速度和生存率。敲低与未敲低CDK2的MYCN阴性神经母细胞瘤在IFNGR1^(-/-)小鼠身上生长肿瘤的速度相似并且生存率相似。结论CDK2通过IFN-γ通路影响肿瘤免疫微环境中CD3+T细胞、CD4^(+)T细胞、CD8^(+)T细胞和DC细胞的比例。     

Expression of apoptosis protein caspase 3 in developing mouse cerebellum

目的:观察C57/BL6小鼠小脑发生发育过程中的凋亡蛋白caspase 3表达变化,探讨小脑发生发育的可能机制.方法:应用免疫组织化学技术、免疫印迹对胚龄(E)12、14、16、18、20 d和生后(P)1、3、7、14、21、28 d的仔鼠及生后2、3、6、15个月的C57/BL6小鼠小脑的形态变化及caspase 3的分布进行系统观察和定量分析.结果:免疫组织化学结果显示,E12 d～P21 d,caspase 3在小鼠小脑中均有阳性表达,主要分布在神经元的细胞质和细胞核中.E12 d～P7d,caspase 3表达逐渐增多,P14 d～P21 d逐渐减少.免疫印迹分析表明,E18 d～3个月,caspase 3蛋白表达先逐渐增加后逐渐减少,P7d达高峰,3个月后维持在较低水平.结论:小鼠小脑的片层化结构主要形成于胚胎期,出生后片层化结构逐渐发育成熟,小脑得以迅速发育长大.此外,在小脑发育中存在着大量的细胞凋亡现象,其可能在小脑的塑形中发挥重要的作用.     

分子伴侣Rer1参与人胚胎肾上皮细胞系HEK293T中hERG钾通道蛋白转运

目的探讨分子伴侣Rer1在hERG钾通道蛋白转运中的作用机制,并进行可能恢复hERG转运异常的药物Baf A1研究。方法将A561V突变体及野生型hERG载体瞬时转染人胚胎肾上皮细胞系(HEK293T),建立野生、突变及混合转染细胞模型;运用免疫荧光、蛋白免疫印迹检测hERG及Rer1的表达;采用小干扰RNA技术敲低Rer1表达后检测hERG蛋白的表达;V-ATP酶抑制剂Bafilomycin A1(Baf A1)以1 mmol/L孵育各组细胞6 h后Western blot检测hERG蛋白表达;用膜片钳对有潜在功能的混转细胞给予Baf A1孵育后测定膜电流。结果与野生组相比,A561V突变可致hERG蛋白转运缺陷并表现不同条带水平,突变组hERG蛋白的膜表达明显减少(P0.01);Rer1在突变、混转组中表达明显下降(P0.01),进一步敲低Rer1后可促进部分相对成熟hERG蛋白的顺向转运;此外,与对照组相比,Baf A1孵育可使野生、突变组中成熟hERG蛋白明显增加(P0.05),混转组中未成熟hERG蛋白则显著上调(P0.05);而在混转细胞中,Baf A1孵育可使尾电流相对密度明显增强(P0.05)。结论 Rer1参与hERG钾通道蛋白的转运,并能抑制部分异常hERG蛋白在细胞中的顺向转运,Baf A1能明显增强混转细胞的尾电流密度。     

RSUME促进小鼠垂体腺瘤细胞AtT-20凋亡

目的探讨小泛素化修饰增强子(RSUME)、核转录因子-κB抑制因子-α(IκB-α)及核转录因子-κB 1(NF-κB1)在小鼠垂体腺瘤中表达及其细胞凋亡的影响。方法用RSUME小干扰RNA(siRNA)转染At T-20细胞后,用蛋白印迹及实时荧光定量PCR检测RSUME、NF-κB1和IκB-α蛋白的表达及mRNA的表达,流式细胞计量术检测细胞凋亡。结果在蛋白水平,RSUME-siRNA转染后RSUME及IκB-α表达下调(P0.05),NF-κB1则上调(P0.05);在mRNA水平,转染后RSUME mRNA表达水平明显低于转染前(P0.05),而IκB-α及NF-κB1 mRNA水平无明显变化;转染后细胞凋亡率明显升高。结论 RSUME可以通过NF-κB1促进小鼠At T-20垂体腺瘤细胞的凋亡。