阴离子交换蛋白1与P16蛋白在HeLa细胞中共表达

目的 在人宫颈癌细胞株(HeLa)中共表达具有阴离子转运活性的阴离子交换蛋白(anion exchanger 1,AE1)与P16蛋白,观察两者之间的相互作用.方法 用脂质体将目的基因转入HeLa,Western blot及免疫荧光方法验证蛋白表达及定位,描绘细胞生长曲线,运用6-甲氧基-N-(3-磺丙基)喹啉铵(SPQ)测定细胞阴离子转运活性.结果 P16和AE1均成功在HeLa细胞中过表达.共同转染pEGFP-C1-p16和pRBG4-AE1后HeLa细胞的阴离子交换功能明显增强,且细胞增殖能力明显下降.结论 P16与AE1之间存在相互作用和/或协同作用,为进一步研究AE1在细胞增殖和肿瘤发生、发展过程中作用奠定了基础.     

一种高效稳定的磷酸钙转染293T细胞方法的建立及评价

目的：探讨2种磷酸钙转染法转染293T细胞的效果,建立一种实现高效稳定磷酸钙转染293T细胞的方法。方法：荧光显微镜观察采用2种磷酸钙转染方法（传统磷酸钙转染法和改良磷酸钙转染法）转染pCDH-GFP-3xflag-TRAF6质粒进入293T细胞的转染效率。采用Real-time PCR法和Western blotting法分别检测2种磷酸钙转染方法转染pCDH-GFP-3xflag-TRAF6质粒进入293T细胞后,肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6） mRNA和flag蛋白表达水平。结果：荧光显微镜下观察,与传统磷酸钙转染法比较,改良磷酸钙转染法转染pCDH-GFP-3xflag-TRAF6质粒进入293T细胞24和48 h后的转染效率明显升高（P<0.01）;Real-time PCR法和Western blotting法检测,与传统转染方法比较,磷酸钙转染改良法转染pCDH-GFP-3xflag-TRAF6质粒进入293T细胞24和48 h后,TRAF6 mRNA和flag蛋白表达水平均明显升高（P<0.01）。结论：本研究建立的改良磷酸钙转染方法是一种高效、稳定的DNA转染方法。     

心肌细胞内的Cl~-/HCO_3~-交换蛋白及其在实验性心肌缺血损伤中的作用

心肌细胞中存在阴离子交换蛋白(AE),其主要作用是转运Cl-/HCO3-,调节细胞内PH和细胞内[Cl-]。文献表明AE1、AE2、AE3在心肌细胞mRNA水平均有表达,但在蛋白水平上表达的主要有nAE1和cAE3。缺血条件下,心肌细胞膜上Cl-/HCO3-交换蛋白可激活,导致[Cl-]i增加与酸中毒,造成心肌细胞     

心肌细胞内的Cl-/HCO3-交换蛋白及其在实验性心肌缺血损伤中的作用

心肌细胞中存在阴离子交换蛋白(AE),其主要作用是转运Cl-/HCO3-,调节细胞内PH和细胞内[Cl-].文献表明AE1、AE2、AE3在心肌细胞mRNA水平均有表达,但在蛋白水平上表达的主要有nAE1和cAE3.缺血条件下,心肌细胞膜上Cl-/HCO3-交换蛋白可激活,导致[Cl-]i增加与酸中毒,造成心肌细胞损伤.除去细胞外Cl-或运用Cl-阻断剂,多种原因诱导的再灌注性心律失常发生率显著降低,表现出较好的抗心律失常作用.     

Asp896～Val911缺失的阴离子交换蛋白1C末端表达质粒的构建

目的 构建Asp896-Val911缺失的阴离子交换蛋白1（Anion Exchange1,AE1）C末端表达质粒。方法 利用PCR方法，以pFAST-AE1-C-end为模板，扩增出AE1后16位氨基酸Asp896-Val911缺失的C末端基因，将其克隆至pGADT7载体上。用醋酸锂法将构建好的pGADT7-AE1-c-end-truncation转染酶母菌AH109，观察其在选择性培养基上的表达情况。结果 成功构建了AE1缺失后16位氨基酸的C末端表达质粒。结论 重组质粒pGADT7-AE1-c-end-truncation对酵母无毒性，不能激活检测基因，可作为酵母双杂交系统中的靶基因。     

G6PD缺乏红细胞膜Band3蛋白阴离子转运功能的改变

目的：探讨葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏红细胞膜Band3蛋白阴离子转运功能的改变及影响因素。方法：利用测定细胞在等渗氯化铵溶液中的溶血t1/2来揭示正常与异常红细胞阴离子转运动能的改变及巯基还原剂的修复。结果：G6PD缺乏红细胞。Band3蛋白阴离子转运活性较正常对照明显减弱。而DTT或巯基乙醇可恢复其阴离子转运活性。结论：氧化通过修饰G6PD缺乏红细胞膜蛋白巯基来降低阴离子转运活性。这可能成为红细胞溶血的一个重要机制。而巯基还原剂则可修复其转运活性。     

含HIV-1 Tat基因重组反转录病毒表达载体构建与表达Tat蛋白功能检测

目的：构建含HIV-1 Tat基因重组反转录病毒表达载体及评价表达Tat蛋白的功能。方法：使用HindⅢ将HIV-1 Tat101蛋白编码基因从pEV质粒中切出，插入到表达质粒LZRSpBMN—Z中，构建成重组反转录病毒表达质粒IZRS-Tratl01。采用磷酸钙转染法将重组质粒LZRS-Tat101转染进含反转录病毒erw、gal和pol编码基因的包装细胞phoenix(φNX)中，嘌呤霉素筛选获得稳定细胞系。免疫组化(IHC)染色检查Tat在临时转染和稳定转染删x细胞中的表达水平。收集临时转染和稳定转染包装细胞分泌的病毒上清，并分别感染293细胞，Western blot检测Tat在293中表达。与此同时，收集感染293细胞培养上清，加入到HL3T1细胞(HELa—HIV-1-LTR／CAT报告基因)中，共培养72h后收集细胞，提取蛋白作CAT活性检测。结果：①含Tat101基因重组反转录病毒表达质粒转染包装细胞后，Tat在临时转染φNX中表达水平显高于在稳定转染中的水平；②临时转染病感染293细胞，Tat在感染细胞中得到了表达，且分泌至上清中的Tat蛋白能够激活靶细胞HL3T1中HIV-1的LTR启动子，使得其下游的CAT基因得到表达。结论：重组IZRS-Tat101反转录病毒能够在其感染靶细胞中表达Tat蛋白，且表达蛋白具有转录激活功能。     

非小细胞肺癌红细胞膜带3蛋白功能的观察

目的 观察早晚期非小细胞肺癌患者红细胞膜带3蛋白功能变化.方法 正常对照组:健康成年人15名;早期组:Ⅰ、Ⅱ期非小细胞肺癌15例;晚期组:Ⅳ期非小细胞肺癌15例.应用Cl-荧光探针6-甲基-3-磺丙基-1-喹啉-水化合物(SPQ)分别检测3组红细胞膜带3蛋白的阴离子转运活性.结果 晚期组患者红细胞膜带3蛋白的离子转运活性明显比早期组升高.结论 晚期非小细胞肺癌红细胞膜带3蛋白的离子转运活性升高.提示带3蛋白的阴离子转运活性与非小细胞肺癌的发生、发展有关.     

Decorin基因过表达对HEK293T细胞微管相关蛋白LC3和自噬基因beclin1表达的影响

目的:构建人核心蛋白聚糖(DCN)重组质粒,研究其对微管相关蛋白LC3和自噬基因beclin1表达的影响.方法:从人胚肺二倍体成纤维细胞(2BS)提取总RNA,经RT-PCR获得decorin的全长cDNA,克隆至T-载体pUM-T并测序,亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1/V5-His,再次测序正确后以磷酸钙共沉淀法瞬时转染HEK293T细胞,利用RT-PCR、Western Blot方法检测空载体组和重组质粒转染组微管相关蛋白LC3和自噬基因beclin1转录水平及翻译水平的表达.结果:经DNA测序证实人DCN cDNA片段正确插入真核表达载体中.Western Blot结果显示经磷酸钙共沉淀法转染的HEK 293T细胞中目的基因高表达.RT-PCR和Western Blot结果显示,与空载体组相比,重组质粒转染组LC3转录水平显著降低,beclin1和LC3-Ⅱ的翻译水平均显著降低.结论:成功构建人DCN重组质粒,其在HEK 293T中过表达可以显著降低微管相关蛋白LC3和自噬基因beclin1表达,为进一步研究DCN与自噬的相互作用奠定了基础.     

链亲和素标记的人粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子融合蛋白的制备(英文)

目的制备链亲和素(SA)标记的人粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(hGM-CSF)融合蛋白SA-hGM-CSF和hGM-CSF-SA,并鉴定其生物学活性。方法构建原核表达质粒PET24a-6His-SA-L-hGM-CSF和PET24a-hGM-CSF-L-SA-6His,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),用镍金属螯合(Ni-NTA)层析柱进行纯化,并对其进行复性。复性后蛋白用DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析进一步纯化。MTT法检测融合蛋白对人红白血病细胞(TF-1)的增殖活性。流式细胞仪分析融合蛋白对生物素化的MB49细胞锚定修饰效率。结果 SA-hGM-CSF和hGM-CSF-SA两种融合蛋白在大肠杆菌中实现了高效表达,目标蛋白占菌体蛋白的20%以上,纯化后纯度达到96%以上。两种融合蛋白均具有双功能活性,即同时具有hGM-CSF的促进人红白血病细胞增殖的活性和SA介导的高效结合至表面生物素化的MB49细胞的功能(锚定修饰率大于99%)。结论研制的SA/hGM-CSF融合蛋白具有双重活性,可为研制hGM-CSF表面修饰的新型肿瘤细胞疫苗提供基础。     

rAAV-hBMP7的包装纯化及感染滴度的测定

目的:包装纯化具有感染性的腺相关病毒rAAV-hBMP7,检测其包装效率及感染滴度。方法:应用AAV Helper-Free System、磷酸钙三质粒共沉淀法,将病毒质粒pAAVIRES-hrG-FP-hBMP7、辅助质粒pAAV-Helper和包装质粒pAAV-RC转染AAV-293细胞,进行病毒包装,荧光计数法测定病毒包装效率;反复冻融收获病毒液,按氯仿处理、PEG/NaCl沉淀的方法浓缩纯化;纯化的病毒液感染AAV-HT1080细胞观测荧光表达,原位β-半乳糖苷酶染色测定病毒感染效率和滴度。结果:转染AAV-293细胞后6h即有绿色荧光表达,包装效率为94.16±0.13%。纯化的rAAV-hBMP7在HT1080细胞中的感染效率为78%,计算病毒物理滴度为2.34×1011v·g/ml。结论:磷酸钙三质粒共沉淀法可实现病毒在AAV-293细胞中的高效包装,纯化的rAAV病毒载体能介导hBMP7基因转染真核细胞并具有较高的转染效率和感染滴度。     

慢病毒载体表达外源PON1对小鼠巨噬细胞的影响

目的:为探讨对氧磷酯酶1(PON1)在机体代谢性疾病中的作用及机制,本实验构建含人源性PON1基因的慢病毒表达载体,研究其表达分泌PON1的能力及对小鼠巨噬细胞的影响。方法:根据人肝cDNA文库的PON1序列设计特定引物,定点诱变PCR获得两端为PmeⅠ内切酶位点的目的基因,经酶切连接到pWPI-GFP载体上,筛选及DNA测序鉴定。磷酸钙法瞬时转染293T细胞,荧光显微镜观察GFP表达反映转染效率,Western Blotting检测细胞培养基中PON1分泌表达量,采用对氧磷为底物检测PON1活性。含PON1的培养基与小鼠腹腔巨噬细胞共孵育,ELISA法检测氧化条件下细胞分泌肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)的水平。结果:构建的pWPI-PON1慢病毒表达载体序列正确,高效转染293T细胞(转染效率可达到80%-90%)可有效分泌表达PON1至培养基,显著提高培养基PON1活性,与对照组相比,培养基中PON1可明显抑制巨噬细胞炎症因子TNF-α、IL-6的分泌(P<0.01)。结论:pWPI-PON1慢病毒载体高效表达分泌的外源PON1能有效降低巨噬细胞的炎症反应。     

人趋化因子受体CCR6的克隆、表达及其功能分析

目的构建人趋化因子受体6（CCR6）cDNA序列的真核表达载体．并在HEK293细胞中表达．为研究CCR6生物学功能和筛选CCR6拮抗剂奠定基础。方法采用RT-PCR方法从人扁桃体克隆CCR6受体的DNA片段．并将该片段插入真核表达质粒pcDNA3．1（＋）中,构建重组真核表达质粒pcDNA3、1（＋）-CCR6;将该质粒pcDNA3、1（＋）-CCR6转染HEK293细胞．用流式细胞术检测转染pcDNA3．1（＋）-CCR6质粒的HEK293细胞;采用体外趋化实验、钙流实验,验证转染pcDNA3.1（-）．CCR6质粒的HEK293细胞表面表达的CCR6的生物学活性。结果经RT-PCR获得了编码人CCR6受体的DNA片段．构建了重组真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-CCR6：转染HEK293细胞．经流式细胞仪检测、趋化实验、钙流实验证实．表达CCR6的HEK293细胞具有趋化因子受体CCR6的生物学活性。结论重组人趋化因子受体CCR6克隆成功．并在HEK293细胞中获得了表达．为研究CCR6的生物学功能及筛选CCR6拮抗剂奠定了基础。     

大鼠GPR17基因真核表达载体的构建及其功能鉴定

目的:构建大鼠GPR17(rGPR17)基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-rGPR17,并对其功能进行初步研究.方法:从大鼠脑组织提取总RNA,通过RT-PCR扩增rGPR17 cDNA,与载体pcDNA3.1(+)连接,并转化到大肠杆菌DH5α以获得重组载体pcDNA3.1(+)-rGPR17,以PCR、双酶切和测序鉴定;将重组载体pcDNA3.1(+)-rGPR17通过脂质体转染方法,转染HEK293细胞,RT-PCR、免疫荧光法检测rGPR17的表达,Fluo-4测定激动剂LTD_4处理后细胞内钙变化.结果:RT-PCR、双酶切和测序证明,重组的真核表达载体pcDNA3.1(+)-rGPR17构建成功,并在HEK293细胞获得表达,加入外源性激动剂LTD_4可诱导细胞内钙的增加.结论:成功构建了rGPR17的真核表达载体pcDNA3.1(+)-rGPR17,并在HEK293细胞功能性表达,为GPR17受体及其拮抗剂的研究提供了基础.     

32例晚期及术后复发肺肉瘤样癌患者的治疗及生存分析

目的 探讨Ⅳ期及术后复发肺癌肉瘤患者经三代化疗药物治疗的疗效及影响预后的因素。方法 回顾性分析经病理学确诊的32例肺肉瘤样癌患者临床资料,并对其治疗方案及可能影响预后的因素（性别、年龄、肿瘤部位、大小、术后复发或Ⅳ期、病理类型、吸烟状况）进行统计学分析。结果 32例肺肉瘤样癌患者中初诊Ⅳ期10例,复发或转移肺肉瘤样癌患者22例。所有患者均先后接受吉西他滨联合顺铂(GP)或紫杉醇联合顺铂(TP)方案化疗。中位总生存时间（OS）为14个月、中位无进展生存时间（PFS）为5个月,客观缓解率21.9%（7／32）。不同性别、年龄、部位、病理类型、接受TP或GP方案化疗及吸烟史的患者, OS差异均无统计学意义。肿瘤直径在>6 cm与≤6 cm患者,中位OS分别为16个月、12个月,两组间差异有统计学意义（P P6 cm是独立的不良预后因素。结论 在我们的研究中,TP和GP方案化疗对术后复发及Ⅳ期肺肉瘤样癌患者的疗效与其他研究中同期别的非小细胞肺癌近似,初次诊断为Ⅳ期和肿瘤直径>6 cm是独立不良预后因素。     

VR1受体稳定真核表达细胞系的建立

目的：为研究VR1（Vanilloid receptor subtypel)受体的功能，建立VR1稳定真核表达细胞系。方法：采用RT－PCR的方法从大鼠脊髓克隆VR1 cDNA，并构建VR1表达载体。将VR1质粒通过电穿孔方法转染HEK293细胞，经G418筛选获得稳定表达的细胞克隆。采用RT－PCR，Western blotting，免疫荧光，细胞Ca^2 浓度测定等方法检测VR1受体的表达。结果：筛选的阳性细胞克隆含有VR1的mRNA及蛋白质，细胞Ca^2 浓度的改变提示VR1受体的功能性表达。结论 建立了稳定表达VR1受体的真核表达细胞系。     

氧浓度和钙离子对野生型及突变型低氧诱导因子-1α基因真核表达的影响

目的 对已构建的突变型人低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)真核表达载体pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala(单突变)和pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala-803Ala(双突变)进行进一步的功能鉴定.方法 将pcDNA3.1+/HIF-1α、pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala和pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala-803Ala分别用脂质体法短暂转染人胚肾上皮细胞(human embryo kidney 293,HEK293);Western blotting法检测正常氧、低氧无钙离子或有钙离子条件下各组转染细胞HIF-1α蛋白水平:RT-PCR法检测正常氧条件各组转染细胞血管内皮生长因子(VEGF)mRNA表达.结果 正常氧条件下,转染突变体的细胞较转染野生型HIF-1α载体的细胞HIF-1α蛋白和VEGFmRNA水平增高;低氧条件下,转染野生型HIF-1α载体的HEK293细胞HIF-1α蛋白水平增高:Ca~(2+)刺激减少低氧时转染野生型HIF-1α载体细胞HIF-1α蛋白水平,但对转染突变体细胞HIF-1α蛋白水平无明显影响.结论 pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala和pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala-803Ala两种突变体产物在蛋白水平上具耐氧和耐蛋白酶降解的特性.

Abstract：

Objective To study the effects of oxygen and calcium on the expression of eukaryotic vectors harboring wild-type or mutated hypoxia-inducible factor-1α(HIF-1α)in HEK293 cells.Methods HEK293 cells were transiently transfected with pcDNA3.1+/HIF-1α,pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala and pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala-803Ala via lipofectin.Western blotting were used to detect HIF-1α protein after normoxic or hypoxic exposure of the transfected HEK293 cells in the presence or absence of Ca~(2+).The levels of vascular endothelial growth factor(VEGF)mRNA in the transfected cells in normoxic condition was detected using RT-PCR.Results The levels of HIF-1α protein and VEGF mRNA increased in HEK293 cells transfected with the vectors harboring mutated HIF-1α, but not in the cells transfected with wild-type HIF-1α vectors in normoxia.Hyooxia increased the levels of HIF-1α protein in the cells transfected with wild-type HIF-1α vectors,which was inhibited by the application of Ca~(2+). Ca~(2+) showed no inhibitory effect on HIF-1α levels in HEK293 cells transfected with the vectors containing mutated HIF-1α. Conclusion The protein products of pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala and pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala-803Ala in HEK293 cells enhance the cell tolerance to oxygen and protease.     

人Slit2全长cDNA的真核表达及鉴定

目的:对人神经轴突导向因子Slit2(hSlit2)全长cDNA进行真核表达并进行鉴定。方法:采用分段克隆的方法获得hSlit2全长cDNA的克隆,并构建hSlit2全长cDNA真核表达重组质粒pCMV-GFP-C/hSlit2,用磷酸钙共沉淀法将其转染到人胚肾细胞HEK-293细胞中,通过免疫印迹法鉴定其蛋白表达。结果:经酶切鉴定证实hSlit2全长cDNA的真核表达载体构建成功,免疫荧光蛋白和Western blot结果证实hSlit2全长cDNA在HEK-293细胞中的表达。结论:人神经轴突导向因子hSlit2真核表达载体构建成功,为进一步完善hSlit2蛋白及各水解片段功能研究提供了实验基础。     

S1P1真核表达载体的构建及在HEK293细胞膜上的表达

目的构建含人Ⅰ型1-磷酸鞘氨醇受体(SIPI)-全长cDNA序列及HA和/或EGFP标签的真核表达载体,并观察其在HEK293细胞上的表达。方法合成2条HA寡核苷酸,克隆入S1P1-Myc-EGFP-N1载体。以HA-S1P1-Myc-EGFP-N1为模板,用PCR的方法扩增HA-S1P1并克隆入pcDNA3.1(+)载体。限制性酶切消化、PCR、测序的方法鉴定,载体经Polyfect转染入HEK293细胞。G418筛选出稳定细胞株。用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测S1P1在HEK293细胞上的表达。结果限制性酶切消化、PCR、测序结果证实载体构建成功。S1P1表达在HEK293稳定细胞株的表面。结论成功构建带有HA和/或EGFP标签的S1P1真核表达载体,表面表达S1P1的HEK293稳定细胞株可作为我们进一步研究的细胞模型。