维生素C体外诱导多能干细胞向心肌细胞的分化

背景：诱导多能干细胞治疗缺血性心脏病被认为是极具前景的方法,但目前仍未找到一种理想的诱导方式。目的：观察维生素C作为诱导剂对多能干细胞体外分化为心肌细胞的影响。方法：复苏小鼠诱导多能干细胞,传代培养后,采用直接悬浮培养法使小鼠诱导多能干细胞形成拟胚体,用含10-3,10-4,10-5,10-6mol/L4种不同浓度维生素C的分化培养基对其进行诱导分化,以不添加任何诱导剂作为对照组,观察各组出现搏动拟胚体的数量,计算分化比率。结果与结论：维生素C诱导小鼠诱导多能干细胞分化为心肌细胞的最佳浓度为10-4mol/L,有（57.00±3.20）%的拟胚体出现搏动,显著高于不添加任何诱导剂的对照组（5.13%±0.55）%（P〈0.01）。诱导而来的心肌细胞表达心肌特异性蛋白cTnT以及α-actin。提示最佳的维生素C诱导分化条件能够促进小鼠诱导多能干细胞向心肌细胞分化,提高其分化效率。     

MAPK通路对胚胎干细胞向心肌细胞分化的作用

目的研究促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)通路对胚胎干细胞诱导分化心肌细胞的影响。方法采用10-4M维生素C诱导小鼠R1胚胎干细胞分化为心肌细胞。以未经处理ESC心肌细胞分化(ESCM)相应时间点的总RNA作对照组,20μM细胞外信号调节激酶(ERK)特异性抑制剂PD98059和20μM p38 MAPK特异性抑制剂SB203580孵育细胞,诱导分化后期通过计数搏动拟胚体的比率和实时定量聚合酶链式扩增反应(RT-PCR)和免疫印迹(Western Blotting)检测心肌标志物的表达确定其作用。结果与对照组相比,诱导分化第14天,SB203580组搏动拟胚体比率显著降低(24%vs.56%,P=0.025);RT-PCR和Western Blotting结果表明SB203580、PD98059组均可下调心肌特异性标志物表达,SB203580组更加明显。结论 MAPK通路与心肌细胞分化有关,以p38信号通路为主。     

神经调节蛋白1诱导小鼠胚胎干细胞向心肌细胞的分化及其机制探讨

背景:前期研究发现神经调节蛋白1早期干预能够诱导胚胎干细胞向心肌细胞分化。目的:进一步观察神经调节蛋白1诱导小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化的途径。方法:分别观察胚胎干细胞自发与在神经调节蛋白1诱导情况下向心肌细胞的分化,RT-PCR检测胚胎干细胞自发与诱导分化下心肌特异性早期转录因子GATA-4、Nkx2.5mRNA的表达,细胞免疫组织化学检测胚胎干细胞自发与诱导分化下心肌肌钙蛋白T及磷酸化蛋白激酶B的表达,Westernblot半定量分析自发与诱导分化下心肌细胞磷酸化蛋白激酶B的表达结果与结论:神经调节蛋白1诱导心肌分化率显著高于自发心肌分化率。神经调节蛋白1呈剂量依赖性上调GATA-4、Nkx2.mRNA表达;表皮生长因子样受体拮抗剂及磷脂酰肌醇-3激酶抑制剂阻断了神经调节蛋白1对Nkx2.5mRNA的表达上调作用。Westernblot分析显示神经调节蛋白1诱导组拟胚体中自发性搏动心肌细胞团磷酸化蛋白激酶B的相对表达高于自发心肌分化组。提示神经调节蛋白1可能通过磷脂酰肌醇3激酶/磷酸化蛋白激酶B信号通路诱导胚胎干细胞向心肌细胞分化。     

悬滴三步法体外诱导小鼠胚胎干细胞向心肌样细胞的分化

背景:研究胚胎干细胞分化为心肌细胞的条件和技术,进一步提高诱导分化率、细胞纯度,具有重要的理论和临床应用意义。目的:建立体外诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞模型,为体外研究心肌细胞发育提供合适的实验方法。方法:采用悬滴-悬浮-贴壁三步法(悬滴三步法)对未分化的胚胎干细胞进行体外诱导分化培养,并按诱导剂的不同分为6组,Ⅰ组:丹参+5-氮杂胞苷;Ⅱ组:丹参+维甲酸;Ⅲ组:5-氮杂胞苷;Ⅳ组:丹参;Ⅴ组:维甲酸;Ⅵ组:阴性对照。诱导剂加入后9d,免疫细胞化学方法检测拟胚体α-actinin、myosin、α-actin的表达。结果与结论:诱导剂加入后第2天,倒置显微镜下见拟胚体自发性收缩,每个拟胚体可有1个或多个收缩中心。免疫细胞化学示心肌特异性结构蛋白α-actinin、myosin、α-actin均成阳性表达。Ⅰ组心肌细胞的分化率最高,与Ⅱ、Ⅵ组心肌细胞分化率比较差异有非常显著性意义(P<0.01),与Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组比较差异有显著性意义(P<0.05)。结果显示悬滴三步法联合中药丹参与5-氮杂胞苷为诱导剂,可提高体外胚胎干细胞分化为心肌细胞的分化率。     

神经调节蛋白1诱导小鼠胚胎干细胞向心肌细胞的分化及其机制探讨

背景：前期研究发现神经调节蛋白1早期干预能够诱导胚胎干细胞向心肌细胞分化。目的：进一步观察神经调节蛋白1诱导小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化的途径。方法：分别观察胚胎干细胞自发与在神经调节蛋白1诱导情况下向心肌细胞的分化,RT-PCR检测胚胎干细胞自发与诱导分化下心肌特异性早期转录因子GATA-4、Nkx2.5mRNA的表达,细胞免疫组织化学检测胚胎干细胞自发与诱导分化下心肌肌钙蛋白T及磷酸化蛋白激酶B的表达,Westernblot半定量分析自发与诱导分化下心肌细胞磷酸化蛋白激酶B的表达结果与结论：神经调节蛋白1诱导心肌分化率显著高于自发心肌分化率。神经调节蛋白1呈剂量依赖性上调GATA-4、Nkx2.mRNA表达;表皮生长因子样受体拮抗剂及磷脂酰肌醇-3激酶抑制剂阻断了神经调节蛋白1对Nkx2.5mRNA的表达上调作用。Westernblot分析显示神经调节蛋白1诱导组拟胚体中自发性搏动心肌细胞团磷酸化蛋白激酶B的相对表达高于自发心肌分化组。提示神经调节蛋白1可能通过磷脂酰肌醇3激酶/磷酸化蛋白激酶B信号通路诱导胚胎干细胞向心肌细胞分化。     

悬滴三步法体外诱导小鼠胚胎干细胞向心肌样细胞的分化

背景：研究胚胎干细胞分化为心肌细胞的条件和技术,进一步提高诱导分化率、细胞纯度,具有重要的理论和临床应用意义。目的：建立体外诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞模型,为体外研究心肌细胞发育提供合适的实验方法。方法：采用悬滴-悬浮-贴壁三步法（悬滴三步法）对未分化的胚胎干细胞进行体外诱导分化培养,并按诱导剂的不同分为6组,Ⅰ组：丹参＋5-氮杂胞苷;Ⅱ组：丹参＋维甲酸;Ⅲ组：5-氮杂胞苷;Ⅳ组：丹参;Ⅴ组：维甲酸;Ⅵ组：阴性对照。诱导剂加入后9d,免疫细胞化学方法检测拟胚体α-actinin、myosin、α-actin的表达。结果与结论：诱导剂加入后第2天,倒置显微镜下见拟胚体自发性收缩,每个拟胚体可有1个或多个收缩中心。免疫细胞化学示心肌特异性结构蛋白α-actinin、myosin、α-actin均成阳性表达。Ⅰ组心肌细胞的分化率最高,与Ⅱ、Ⅵ组心肌细胞分化率比较差异有非常显著性意义（P〈0.01）,与Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组比较差异有显著性意义（P〈0.05）。结果显示悬滴三步法联合中药丹参与5-氮杂胞苷为诱导剂,可提高体外胚胎干细胞分化为心肌细胞的分化率。     

人胚胎干细胞分化为心肌细胞的体外实验

背景：体外诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞国内外已做了大量研究。然而，在国内对胚胎干细胞分化为心肌细胞的研究只限于小鼠胚胎干细胞，还未见有将人胚胎干细胞诱导为心肌细胞的报道。 目的：将人胚胎干细胞系H14诱导分化为心肌细胞。 设计：体外人胚胎干细胞培养细胞，采用悬浮法让其形成拟胚体，在不同的分化时期观察出现有节律性收缩的拟胚体的比率以及心肌特异性基因的表达。 单位：香港中文大学公共卫生学院何鸿粲防治传染病研究中心分子生物学实验室。 材料：实验所用人胚胎干细胞株H14来源于美国威斯康星大学WiCell研究所并授权使用。 方法：于2006—08／12在香港中文大学公共卫生学院何鸿粲防治传染病研究中心分子生物学实验室完成。采用悬浮法培养人胚胎干细胞株H14，让其形成拟胚体。4d后，将拟胚体培养在包被有明胶的6孔培养板内（5-10个胚胎体/孔），让其自发分化为跳动的拟胚体，显微镜下观察有节律性收缩的拟胚体；然后采用反转录聚合酶链反应方法检测心肌特异性基因的表达。 主要观察指标：不同的分化时期有节律性收缩的拟胚体的比率以及心肌特异性基因的表达。 结果：拟胚体形成8d后，大约有2％的拟胎体出现有节律性的收缩，随着时间的延长，产生收缩的拟胚体越多，到第16天，大约有10％的拟胚体出现节律性跳动，跳动频率为70～100次／min。反转录聚合酶链反应结果显示，有节律性收缩的拟胚体表达心肌特异性的转录因子GATA-4和Nkx25，心肌特异性基因IsI-1和α- MHC。 结论：国内首次成功使人胚胎干细胞诱导分化为心肌细胞。     

诱导间充质干细胞向心肌样细胞的分化

背景:目前很多体内外实验都已表明间充质干细胞具有向心肌样细胞或心肌细胞分化的能力,这使间充质干细胞治疗心脏疾病成为可能。目的:比较诱导间充质干细胞向心肌样细胞分化实验方法的异同及存在的问题。方法:以"mesenchymal stem cells,cardiomyocyte,differentiation;间充质干细胞,心肌细胞,诱导;分化"为检索词,应用计算机检索2000-12/2010-12 PubMed数据库与万方数据库,与间充质干细胞诱导分化为心肌细胞相关的文章。结果与结论:间充质干细胞向心肌细胞分化的方法主要有:①心肌细胞条件培养液:间充质干细胞在体外经药物诱导或模拟体内心肌微环境能定向诱导分化为心肌样细胞。②与希望诱导成的目的细胞共同培养:间充质干细胞可经药物诱导诱导分化为心肌细胞,也可不经任何诱导在心肌微环境中分化为心肌细胞。虽然间充质干细胞在体外心脏病理条件下可分化为心肌细胞,使间充质干细胞治疗心脏疾病成为可能,但其研究有待进一步完善。     

诱导小鼠胎肝干细胞向类心肌细胞的分化

背景：近年来胚胎肝干细胞备受关注,该类细胞是否具有向类心肌细胞方向分化的潜能及相关的诱导分化条件,目前报道极少。目的：探讨体外环境下化学试剂诱导小鼠胎肝干细胞向类心肌细胞方向分化的合适条件。方法：二甲基亚砜联合5-氮杂胞苷以不同的浓度和时间,作用于13.5d胎龄的昆明小鼠胎肝干细胞,观察诱导分化效果。结果与结论：体外环境下,0.8%二甲基亚砜＋5μmol/L5-氮杂胞苷能诱导小鼠胎肝干细胞表达心肌细胞特异性标志物,而增加诱导剂浓度及延长时间不能提高诱导效率。     

鱼卵提取物微量刺激法诱导鼠脾细胞表达干细胞标志抗原

背景:小鼠和人的体细胞能被一些特殊的因子诱导,逆转为类似胚胎细胞的状态,即诱导性多能干细胞。目的:进一步提高鱼卵提取物诱导体细胞逆向分化为多能干细胞的效率。方法:以鱼卵提取物诱导BALB/C小鼠脾细胞分化为多能干细胞,分别以普通诱导法(鱼卵提取物质量浓度分别为0,0.1,0.2,0.4,0.8,1.2g/L)与微量刺激法诱导(鱼卵提取物质量浓度分别为0,0.05,0.1,0.2,0.4g/L)。结果与结论:与普通诱导法比较,微量刺激法诱导的脾细胞表达更多的干细胞标志抗原OCT-3/4,Nanog,SSEA-1。证明微量刺激法可进一步提高体细胞逆向分化为多能干细胞的效率。     

钠钙交换体启动子促进诱导多能干细胞向心肌细胞转化

背景：诱导多能干细胞治疗缺血性心脏病被认为是极具前景的方法,但目前仍未找到一种理想的诱导方式。 目的：探讨钠钙交换体（NCX1）启动子诱导多能干细胞体外分化为心肌细胞的作用。 方法：构建含钠钙交换体1启动子的pLVX-IRES-ZsGreen1慢病毒质粒,使用ViraPowerTM慢病毒包装系统共转染293FT细胞。收集病毒测定病毒滴度后感染小鼠诱导多能干细胞,并使用嘌呤霉素进行筛选。观察胚状体数量以及诱导多能干细胞的分化效率,使用RT-PCR、免疫荧光分析法检测心肌特异标记物。 结果与结论：成功构建了含钠钙交换体1启动子的pLVX-IRES-ZsGreen1慢病毒,感染小鼠诱导多能干细胞后使用流式细胞仪分选NCX1^＋/GFP^＋细胞。与NCX1^-/GFP-细胞相比,NCX1^＋/GFP^＋细胞在4 d即出现细胞分化和跳动,NCX1＋细胞GATA4/MEF2c/Nkx2.5基因表达分别是NCX1^-细胞的4.2,7.5,2.5倍,免疫荧光显示CX43和心肌肌钙蛋白I呈阳性表达。结果表明,钠钙交换体1启动子可以促进小鼠诱导多能干细胞向心肌细胞分化。     

Hydrogels as feeder‐free scaffolds for long‐term self‐renewal of mouse induced pluripotent stem cells

Expanding undifferentiated induced pluripotent stem (iPS) cells in vitro is a basic requirement for application of iPS cells in both fundamental research and clinical regeneration. In this study, we intended to establish a simple, low cost and efficient method for the long‐term self‐renewal of mouse induced pluripotent stem (miPS) cells without using feeder‐cells and adhesive proteins. Three scaffolds were selected for the long‐term subculture of miPS cells over two months starting from passages 14 to 29: 1) a gelatin coated polystyrene (Gelatin‐PS) that is a widely used scaffold for self‐renewal of mouse embryonic stem (mES) cells; 2) a neutral hydrogel poly(N,N‐dimethylacrylamide) (PDMAAm); and 3) a negatively charged hydrogel poly(2‐acrylamido‐2‐methyl‐propane sulfonic acid sodium salt) (PNaAMPS). Each passaged miPS cells on these scaffolds were cryopreserved successfully and the revived cells showed high viability and proliferation. The passaged miPS cells maintained a high undifferentiated state on all three scaffolds and a high level of pluripotency by expressing differentiation markers in vitro and forming teratomas in SCID mice with derivatives of all three germ layers. Compared to Gelatin‐PS, the two hydrogels exhibited much better self‐renewal performance in terms of high proliferation rate and level of expression of undifferentiated gene markers as well as efficiency in pluripotent teratoma formation. Furthermore, the PNaAMPS hydrogel demonstrated a slightly higher efficiency and simpler operation of cell expansion than the PDMAAm hydrogel. To conclude, PNaAMPS hydrogel is an excellent feeder‐free scaffold because of its simplicity, low cost and high efficiency in expanding a large number of miPS cells in vitro. Copyright © 2012 John Wiley & Sons, Ltd.     

三维重构展示类胚体样结构

背景:干细胞因其具有增殖能力及分化潜能,被认为是实施细胞治疗的重要细胞而被广泛研究.实现干细胞与组织三维结构的展示与分析,对阐明干细胞增殖与分化的机制有重要意义.目的:探讨实现对经分化的类胚体样组织结构进行三维重构展示的方法.方法:以来源于骨骼肌干细胞经诱导具有三维立体结构的类胚体作为实验对象,利用多色免疫荧光染色结合Z轴连续图像采集和三维重构技术,对经分化的类胚体样组织结构进行三维重构展示.结果与结论:利用实验方法可实现对类胚体样组织结构进行三维重构,经重构的三维模型可实现任意角度旋转,利用不同荧光通道iso-surface处理后,选择分别显示不同颜色功能或任意横断面展示功能,即可展示心脏特异性肌钙蛋白Ⅰ阳性组织结构与细胞核的空间位置关系,并清晰展示在经分化形成类心肌组织的结构中存在细胞核.提示利用该技术,可对经分化的类胚体样组织结构进行三维重构展示及测量.     

小鼠胚胎干细胞向成骨样时段性细胞分化的形态学特点

背景:纳米羟基磷灰石具有良好的生物活性和相容性,在体外可与细胞短时间内形成紧密结合,是骨组织工程可植入性的材料。目的:观察小鼠胚胎干细胞分化为成骨样时段性细胞的形态学特点。方法:取C57小鼠胚胎干细胞进行培养,将P3胚胎干细胞制备拟胚体。通过碱性磷酸酶、免疫组织化学OCT-4、SOX2、NANOG对原代胚胎干细胞进行鉴定;通过茜素红S、Ⅰ型胶原、冯库萨染色对成骨诱导后的细胞(L-维生素C、β-磷酸甘油、地塞米松)进行检测;扫描电镜观察与纳米羟基磷灰石材料复合培养时细胞的形态及增殖情况。结果与结论:拟胚体贴壁后7d,各组碱性磷酸酶表达即发生变化,14d后碱性磷酸酶表达逐渐增加,光镜下可见轮廓清晰大小不等的绿色结节。茜素红S染色镜下可见橙红色、边界清晰和直径大小不等的结节。冯库萨染色14d可见细胞团内有黑色沉淀,21d后黑色沉淀面积增大。胚胎干细胞与纳米羟基磷灰石材料体外复合培养1,3,5,7,10d,细胞大部分呈细胞团样生长。提示在维生素C、β-磷酸甘油、地塞米松共同作用下,有效促进了胚胎干细胞成骨细胞的产生,胚胎干细胞与支架材料复合培养结合程度高,可用来构建组织工程骨。     

CD271磁珠体外诱导人胚胎干细胞分化为成骨细胞的可行性

背景:来源于人胚胎干细胞的成骨细胞研究结果引人关注,但是能够产生大量有效的成骨细胞且不含有其他杂细胞的诱导方法仍然没有建立起来.目的:探讨利用CD271磁珠从体外诱导分化的人胚胎干细胞中分选出成骨细胞的可行性.方法:人胚胎干细胞株SYSU-2形成拟胚体6 d,贴壁分化14 d后,通过CD271磁珠分选技术获得CD271阳性细胞,进一步检测CD271阳性细胞核型,表面抗原表达及分化潜能.结果与结论:CD271阳性细胞与骨髓来源的间充质干细胞形态相似,为长梭形,并可在体外保持稳定核型至14代左右.同时,这种细胞也具有与骨髓来源的间充质干细胞相似的表面抗原标记(CD45阴性和CD73,CD105,CD166阳性).分化潜能鉴定证明CD271阳性细胞只能诱导形成成骨细胞.这对于研究成骨发育的机制和为骨组织工程提供足量安全有效的种子细胞都有着重要意义.     

不同发育阶段拟胚体对小鼠胚胎干细胞造血分化的影响

目的 通过对拟胚体(Embryoid body, EB)在造血发育过程中三个不同发育阶段的初步探讨,以了解它们对胚胎干细胞(Embryonic stem cells, ESCs)造血分化的影响.方法 根据不同阶段拟胚体的发育特点,将拟胚体分为三个阶段:EB 3-5天、EB 6-8天以及EB 9-13天.通过形态学、流式细胞仪分析、Realtime PCR以及造血集落形成试验来分析不同阶段拟胚体在造血分化过程的特点.结果 EB培养至第5天、第7天、第10天时,每6000个ES细胞形成EB的数量分别是97、100、88个;流式细胞仪检测CD34+/Sca-1+细胞,结果分别是8.91%、9.23%、12.73%;Realtime PCR结果分别显示EB培养到第6天左右时中胚层发育最为活跃,第10天时造血发育比前两个阶段要活跃;造血集落形成试验显示EB发育至第5天、第7天以及第10天时,每1×105个EB细胞形成的集落数分别是21、26、32.结论 EB 3-5天处于分化早期,各种检测参数数值都相对比较低,适合于次级拟胚体以及爆发集落的培养;EB 6-8天中胚层发育最为活跃;EB 9-13天造血发育相对比较成熟.根据不同阶段拟胚体发育的特点,可以选择适当的拟胚体作为体外造血分化模型来满足不同研究目的 需要.     

含人AGM区、胎肝及骨髓基质细胞培养体系程序化诱导小鼠胚胎干细胞向造血干细胞的分化

背景：前期已分别制备人主动脉-性腺-中肾区基质细胞系及胎肝基质细胞系,发现前者可促进小鼠胚胎干细胞定向分化为造血干细胞。目的：模拟胚胎发育过程中永久造血发育的时空顺序,探讨人主动脉-性腺-中肾（AGM）区、胎肝（FL）及骨髓（BM）基质细胞对小鼠胚胎干细胞体外诱导分化为造血干细胞的支持作用,以寻求更佳的诱导条件。方法：将小鼠E14胚胎干细胞诱导为拟胚体（EB）,并利用Transwell非接触共培养体系依次在人主动脉-性腺-中肾区、胎肝及骨髓基质细胞饲养层上进一步诱导分化,按不同诱导阶段分为拟胚体对照、EB/AGM、EB/AGM＋FL和EB/AGM＋FL＋BM共4组。共培养6d后分别收获各组拟胚体来源细胞,以流式细胞仪检测Sca-1＋c-Kit＋细胞含量,进行各系造血细胞集落形成单位分析并观察细胞形态。结果与结论：①EB/AGM＋FL组和EB/AGM＋FL＋BM组收获细胞涂片均发现原始造血细胞。②拟胚体来源细胞经AGM区基质细胞诱导后Sca-1＋c-Kit＋细胞明显升高（P〈0.05）。③拟胚体对照组造血细胞集落形成单位低于其他各组（P〈0.05）,而EB/AGM＋FL、EB/AGM＋FL＋BM组造血细胞集落形成单位计数亦较EB/AGM组明显增高。提示AGM＋FL和AGM＋FL＋骨髓基质细胞微环境对原始造血干细胞的扩增效应均明显高于单纯主动脉-性腺-中肾饲养层。     

酸性成纤维细胞生长因子与胚胎干细胞的造血分化

背景：有研究表明,在卵黄囊造血、胎肝造血和胚胎干细胞向造血干细胞分化过程中,酸性成纤维细胞生长因子可强烈表达。目的：探讨酸性成纤维细胞生长因子对小鼠胚胎干细胞造血分化的作用,在拟胚体培养阶段施加酸性成纤维细胞生长因子,验证酸性成纤维细胞生长因子对造血形成细胞产生的调控作用。方法：培养小鼠胚胎干细胞,将饲养层上生长状态良好的小鼠胚胎干细胞用胰酶消化成单个细胞后,利用悬滴法制备拟胚体,拟胚体继续悬浮培养,以1,2和50g／L酸性成纤维细胞生长因子分别培养3,5,7,9d,通过免疫荧光法检测胚胎干细胞与拟胚体中酸性成纤维细胞生长因子的表达,流式细胞术检测FIk-1^＋与CD133^＋阳性细胞率。结果与结论：酸性成纤维细胞生长因子在拟胚体中呈阳性表达。在5μg／L酸性成纤维细胞生长因子作用下,FIk-1^＋细胞随时间增加表达增加,CD133^＋细胞表达模式与FIk-1^＋细胞类似。在1μg／L时,FIk-1^＋细胞在7d时表达达到高峰,随后下降。CD133^＋细胞表达结果类似。而在2pg／L时,5d时FIk-1^＋细胞表达升高,随后下降,在9d时表达又增高。而CD133^＋细胞则总体呈现升高趋势。酸性成纤维细胞生长因子可促进FIk-1^＋与CD133^＋细胞的产生,证明酸性成纤维细胞生长因子能够有效促进拟胚体的扩增以及成血管血液干细胞的产生与增殖。     

Comparison of osteogenesis of human embryonic stem cells within 2D and 3D culture systems

The objective of this study was to compare the osteogenic potential of human embryonic stem cells (hESCs) within two- and three-dimensional (2D and 3D) culture systems. hESCs of the H1 line (Wicell Inc., Madison, Wisc., USA) were induced to form embryoid bodies (EBs) through 5 days of suspension culture within non-adherent culture dishes. Following enzymatic dissociation, the EB-derived single cells were seeded on either novel 3D porous PLGA scaffolds or 2D culture dishes with the same total cell number. Osteogenic differentiation was induced through culture media supplemented with dexamethasone, L-ascorbic acid and beta-glycerophosphate. After 3 weeks of in vitro culture, quantitative and qualitative assays of osteogenic differentiation were conducted. Osteocalcin secretion and alkaline phosphatase (AP) activities were detected at significantly higher levels within 3D culture compared with the 2D system. Subsequently, the cell-scaffold constructs were implanted in iliac crest defects of immunosuppressed rabbits. After 4 weeks, the constructs were subsequently explanted and characterized by histology and X-ray analysis. Formation of new bone was detected within and around the implanted scaffolds. The results demonstrate that the osteogenic differentiation of human embryonic stem cells is enhanced in a 3D culture system compared to a 2D culture environment. Upon implantation in situ, the differentiating human embryonic stem cells can contribute positively to the repair and regeneration of bone defects.