用焦磷酸微测序技术进行HLA-DRB基因型分析

目的:探索应用焦磷酸微测序技术进行HLA-DRB基因型分析. 方法:PCR扩增外显子2基因片段后,应用焦磷酸微测序技术进行实时测序和HLA-DRB基因分型. 结果:磷酸微测序反应可以判读HLA-DRB基因的多态性位点,最长可判读90个核苷酸,采用特异性等位基因和PCR反应所得到的纯化DNA对血样中的杂合子进行分析,测序结果与HLA数据库基因序列比较,可准确进行HLA-DRB基因型分析. 结论:用焦磷酸微测序技术进行HLA-DRB基因型分析具有高分辨率的优点,该方法可应用于临床器官移植的供体/受体筛查.     

大规模并行焦磷酸测序技术简介

在后基因组时代,基因研究的焦点已经转移到每个人的基因组,因此迫切需要高通量的测序方法。近几年,出现了基于焦磷酸的新测序方法——大规模并行焦磷酸测序技术。在这项技术中,双链DNA首先被片段化,每单个寡核苷酸链分子结合到磁珠支持物上,用乳液PCR对结合的片段进行扩增。扩增后的片段-磁珠复合物被分别置于光纤芯片上的皮升级反应容器中。然后将DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷二磷酸酶等反应试剂加入到反应容器,经过聚合、硫酸化、氧化即可产生强度与结合的核苷酸数目线性相关的光信号,每个反应容器发出的光就能被探测到。利用这项技术在4.5h内可测序2000万～3000万碱基对,准确度达到99%或更高,并且无需在细菌体内进行亚克隆。大规模并行焦磷酸测序开启了个体化基因组学的新时代。     

DNA甲基化的焦磷酸测序通过率

目的 研究不同的PCR产物投入量 (2.5μL, 5μL和10μL) , 对焦磷酸测序通过率的影响.方法从20例酒依赖患者和20例健康对照全血样本中提取DNA.按各样本的DNA用量200 ng进行亚硫酸盐转化, 经PCR扩增后, 按PCR产物不同投入量 (2.5μL, 5.0μL和10.0μL) , 对目的基因序列进行焦磷酸测序.结果 比较各组平均峰高值和焦磷酸测序通过率, 5μL体系的平均峰高以及焦磷酸测序通过率均高于2.5μL体系;10.0μL体系高于5μL体系, 10μL体系为最佳.3组平均峰高和焦磷酸测序通过率, 差异有统计学意义 (P<0.05) .结论 在DNA量统一为200 ng进行亚硫酸盐转化的前提下, 所得PCR产物投入量以10μL为最佳, 焦磷酸测序通过率最高, 达100%.     

焦磷酸测序法和Sanger测序法检测丙型肝炎病毒基因分型的方法学比较

目的探讨焦磷酸测序法检测丙肝分型在临床应用中的准确性和敏感性,评价其方法的优缺点。方法收集100 例丙肝患者的血浆标本,分装相同的2 份,通过焦磷酸测序法和Sanger 测序法分别进行丙型肝炎病毒基因分型的检测,对两种测序方法的结果进行比较。结果焦磷酸测序法和Sanger 测序法检测HCVRNA基因分型时,100 例标本中,92例结果一致,8例结果不一致,一致率为92%。其中,HCV-RNA病毒载量>1×104 IU/ml 有80 例,其测序结果完全一致为100%,HCV-RNA 病毒载量<1×104 IU/ml 有20 例,其中焦磷酸测序共检测20 例,Sanger测序法共检测14 例,12 例结果相同。结论焦磷酸测序法检测丙型肝炎病毒基因分型,不仅结果准确可靠,而且与Sanger 测序法比较,其敏感性更高。此外,焦磷酸测序还可以进行定量分析。     

焦磷酸测序法鉴定临床常见病原菌

目的 建立高效的焦磷酸测序鉴定临床常见病原菌的方法.方法 在细菌16S rRNA的V1及V3可变区两端保守序列设计PCR扩增通用引物及焦磷酸测序引物,PCR扩增后焦磷酸测序测定V1及V3可变区序列,测序结果与数据库比对判断细菌种属.结果 在4 h内完成96株细菌的鉴定,所有菌株鉴定结果与常规鉴定结果一致.结论 焦磷酸测序技术可以用于临床分离菌株的鉴定,且具有费用相对低廉、高通量、鉴定能力强等优点.     

高灵敏度焦磷酸测序平台的建立及应用研究

焦测序技术是一种基于生物发光法测定焦磷酸盐的测序技术,在进行DNA序列分析时不需要电泳和荧光标记,定量性能好,结果准确,可实现自动化。但其应用过程中存在3个技术瓶颈：一是测序试剂灵敏度低、成本高;二是测定仪器价格昂贵;三是测序模板制备过程繁琐。本课题组针对这些技术瓶颈,提出了一整套解决方案,包括高灵敏度焦测序反应试剂的研制、小型便携式焦测序仪的研制、测序模板的制备方法研究等。建立的高灵敏度微型化焦测序平台在分子诊断的各个领域得到了充分的应用,如细菌病毒转基因成分等的序列测定、单核苷酸多态性测定、拷贝数变异测定、基因突变位点测定、microRNA测定、基因表达量测定和药物基因组学研究,具有测序灵敏度高、仪器体积小、成本低、操作简便快速等优点,应用前景广阔。本文详细介绍了本课题组在提高焦磷酸测序反应灵敏度、简化测序过程、改进测序仪器和拓展焦磷酸测序应用范畴所做的系列创新性工作。     

焦磷酸测序技术对阿司匹林个体化用药相关SNP位点分型

阿司匹林的抗血小板作用在临床存在显著的个体差异,而rs5918、rs12041331和rs730012 3个单核苷酸多态性位点与阿司匹林的药效和不良反应有着密切的联系。本文基于PCR结合焦磷酸测序技术,建立了阿司匹林相关SNP位点的基因分型方法。自主设计扩增引物和测序引物;优化PCR扩增条件,使3个位点能够在相同的条件下扩增并通过梯度稀释基因组DNA检测方法的灵敏度;最后,分别基于本文建立的新方法和Sanger测序技术对20例临床样本进行3个位点的基因分型,验证该方法的准确性。结果显示,本文成功建立了阿司匹林个体化用药相关SNP位点的基因分型方法,检测下限低至0.4 ng 基因组DNA,用两种方法对20例临床样本进行3个位点的基因分型,结果完全一致,说明该方法有较高的准确性。     

噬菌体展示随机肽克隆的一种快速、高通量测序技术

目的:探索应用焦磷酸微测序(Pyrosequencing)技术建立一种针对噬菌体展示随机肽的高通量序列测定方案。方法:环7肽噬菌体展示随机肽库的淘筛后随机挑选10个蓝色噬菌斑作为模板,PCR扩增随机7肽区序列,应用Pyrosequencing技术进行实时测序和分析。结果:应用Pyrosequencing技术对10例样品的随机7肽区进行序列分析,得到一个GXXXHPQ的同源基序(X为任意氨基酸),此基序为链亲合素的结合肽基序,结果与预期相符合。结论:Pyrosequencing技术具有操作简易快速、高通量的优点,必定可以广泛应用于各种随机肽库的筛选测序。     

异柠檬酸脱氢酶1基因突变焦磷酸测序检测方法的建立

目的建立异柠檬酸脱氢酶1（isocitrate dehydrogenase 1,IDH1）基因突变的焦磷酸测序检测方法,确定该方法的检测灵敏度。分析焦磷酸测序法与直接测序法对于鉴定IDH1突变的差异。方法构建携带野生型和突变型IDH1基因的质粒,使用质粒优化焦磷酸测序方法。使用已知比例的野生型和突变型质粒作为模版,确定突变的检测灵敏度。针对96例胶质瘤患者手术切除标本的基因组DNA,分别使用直接测序法和焦磷酸测序法,鉴定IDH1基因突变类型,并比较。结果使用焦磷酸测序能够检测到低至2%的IDH1突变。直接测序检出突变阳性率为32.3%、焦磷酸测序检出突变阳性率为74.0%。结论焦磷酸测序法检测IDH1基因突变灵敏可靠,适合临床分子诊断。     

巢式PCR联合焦磷酸测序法在乙型肝炎病毒耐药基因检测中的敏感性与特异性分析

目的评价巢式PCR联合焦磷酸测序法在乙型肝炎病毒(HBV)耐药基因检测中的敏感与特异性。方法选取rtM204I(ATT)突变型和rtM204(ATG)未突变型质粒,按照不同比例混合后,采用巢式PCR联合焦磷酸测序法对突变位点进行检测,并与常规PCR焦磷酸测序法进行比较,对两种方法的线性及一致性进行分析;选取不同病毒载量临床标本,采用巢式PCR焦磷酸测序法检测耐药突变位点,并与巢式PCR Sanger测序法进行比较,对两种方法的敏感性及特异性进行分析。结果常规PCR焦磷酸测序和巢式PCR焦磷酸测序结果拟合曲线R2>0.99,P<0.05,线性模型有显著性意义。分别将常规PCR焦磷酸测序和巢式PCR焦磷酸测序结果与预测值的差值进行分析,巢式PCR能够较常规PCR更好的反映实际值,在90%比例处优于常规PCR。临床75例患者标本巢式PCR Sanger测序与巢式PCR联合焦磷酸测序结果灵敏性比较提示,Sanger测序的灵敏性为92%,巢式PCR联合焦磷酸测序的灵敏性达到100%,差异有统计学意义(P<0.01)。对于不同病毒拷贝数标本的灵敏性不同,其差异主要表现在低浓度组(HBV DNA≤3log10 copies/ml),Sanger测序的灵敏性为78%,而焦磷酸测序的灵敏性可以达到100%,差异有统计学意义(P<0.01)。阴性对照,两种方法均未检出HBV病毒,两种方法的特异性均较好。结论巢式PCR联合焦磷酸测序的方法监测乙肝病毒变异同巢式PCR联合sanger测序相比,有更好的灵敏性,尤其是在低病毒拷贝数时,差异明显,这对于临床提早发现耐药突变株,指导临床及时更换用药有重要意义。     

载脂蛋白E基因多态性与冠心病的关联研究

目的探讨载脂蛋白E（ApoE）基因多态性对冠心病发病的意义。方法选择30例冠心病患者（CHD组）及30例正常人对照者，应用聚合酶链反应（PCR）-限制性片段长度多态性分析（RFLP）法，以CfoI内切酶及聚丙烯酰胺凝胶电泳确定上述人群中ApoE基因的多态性。结果冠心病组Apoε3／4基因型及84等位基因频率都比对照组高，差异有显著性（P＜0．01）。结论Apoε3／4等住基因频率升高是CHD发病的重要危险因素。     

载脂蛋白E基因多态性与冠心病的关联研究

目的探讨载脂蛋白E(Apoe)基因多态性对冠心病发病的意义。方法选择30例冠心病患者(CHD组)及30例正常人对照者,应用聚合酶链反应(PCR)—限制性片段长度多态性分析(RFLP)法,以CfoI内切酶及聚丙烯酰胺凝胶电泳确定上述人群中ApoE基因的多态性。结果冠心病组Apoε3/4基因型及ε4等位基因频率都比对照组高,差异有显著性(P<0.01)。结论Apoε3/4等位基因频率升高是CHD发病的重要危险因素。     

焦磷酸测序用于COL1A1基因多态性与骨肉瘤易感性关系分析

目的观察骨肉瘤患者Ⅰ型胶原α1(COL1A1)基因多态性,探讨骨肉瘤与COL1A1基因多态性的相关性。方法收集骨肉瘤以及正常患者外周血样本,应用焦磷酸测序方法(Pyrosequencing)对54例骨肉瘤患者与126例健康对照者COL1A1基因rs1061970位点进行分析。结果 54例骨肉瘤患者COL1A1rs1061970位点基因型频率中,TT(13.0%)和CT(48.1%)要显著高于正常对照组TT基因型频率11.9%及CT等位基因频率30.2%(P<0.05),骨肉瘤患者组中T等位基因的频率为37.0%,高于对照组的27.0%,OR为1.59,95%CI 0.99~2.57,差异无统计学意义(P>0.05),但是骨肉瘤的发病风险仍呈上升趋势。结论 COL1A1基因多态性与骨肉瘤的发生具有相关性,携带COL1A基因T等位基因的发生骨肉瘤的风险增高。     

丙型肝炎病毒单基因型感染与非单基因感染患者基因型分析

目的 研究慢性丙型肝炎患者基因型分布情况,并对相关基因型进行血清学指标分析。方法 收集安徽省立医院感染病院114例慢性丙型肝炎患者血清样本,采用聚合酶链反应（PCR）-荧光探针法对患者丙型肝炎病毒进行分型,利用实时荧光定量PCR检测外周血丙肝病毒核糖核酸（HCV-RNA）,同时检测肝功能[谷氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、γ-谷氨酰转移酶（GGT）]、凝血指标 [凝血酶原时间（PT）、凝血酶原活动度（PTA）、血小板（PLT）]及自身抗体[抗核抗体（ANA）、抗U1小核糖核蛋白抗体（抗RNP）、抗狼疮细胞抗体（抗Sm）、抗52?kD的多肽条段（抗Ro-52）、着丝粒蛋白B抗体（抗CENP B）、M2型线粒体抗体（AMA-M2）、抗肝/肾微粒体1型抗体（LKM1）]等相关血清学指标。结果 在114例慢性丙型肝炎患者中,丙型肝炎病毒基因型主要为1b型（80.70%）,2a型（7.01%）,6a型（1.75%）,未分型（0.88%）。除了单基因型,还发现非单基因型11例（9.65%）。对单基因型和非单基因型相关实验室指标分析发现,非单基因型ALT及自身抗体检测阳性率要高于单基因型（Z?=1.999,P?=0.045;χ2=13.408,P?=0.000）,而对AST、GGT、PT、PTA、PLT等指标,单基因型与非单基因型患者比较,差异无统计学意义（P?>0.05）。结论 该研究的丙型肝炎病毒感染的患者中,丙型肝炎病毒基因型以1b为主;非单基因型对肝损害要高于单基因型,自身抗体出现的阳性率也更高,可能也更易出现自身免疫性疾病。     

Severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus genotype and its characterization

Objective To study the severe acute respiratory syndrome (SARS)-associated coronavirus genotype and its characteristics.Methods A SARS-associated coronavirus isolate named ZJ01 was obtained from throat swab samples taken from a patient in Hangzhou, Zhejing province. The complete genome sequence of ZJ01 consisted of 29 715 bp ( GenBank accession : AY297028, version : gi : 30910859). Seventeen SARS-associated coronavirus genome sequences in GenBank were compared to analyze the common sequence variations and the probability of co-occurrence of multiple polymorphisms or mutations.Phylogenetic analysis of those sequences was done.Results By bioinformatics processing and analysis, the 5 loci nucleotides at Z J01 genome were found being T, T, G, T and T, respectively. Compared with other SARS-associated coronavirus genomes in the GenBank database, an A/G mutation was detected besides the other 4 mutation loci( C: G: C: C/T: T: T: T) involved in this genetic signature. Therefore a new definition was put forward according to the 5 mutation loci. SARS-associated coronavirus strains would be grouped into two genotypes (C:G:A: C: C/T: T: G: T: T), and abbreviated as SARS coronavirus C genotype and T genotype. On the basis of this new definition, the ZJ01 isolate belongs to SARS-associated coronavirus T genotype, first discovered and reported in mainland China. Phylogenetic analysis of the spike protein gene fragments of these SARS-associated coronavirus strains showed that the GZ01 isolate was phylogenetically distinct from other isolates, and compared with groups F1and F2 of the T genotype, the isolates of BJ01and CUHK-Wl were more closely related to the GZ01 isolate. It was interesting to find that two(A/G and C/T) of the five mutation loci occurred in the spike protein gene, which caused changes of Asp to Gly and Thr to lie in the protein, respectively.Conclusion Attention should be paid to whether these genotype and mutation patterns are related to the virus‘ s biological activities,epidemic characteristics and host clinical svmotoms.     

应用荧光标记基因分型对中国汉族人群进行遗传多态性研究

目的 :为了确定我国汉族人群遗传多态性片段大小范围与法国人群的差异 ,更好的进行基因组扫描和个体识别等方面研究。方法 :4 0 0个微卫星位点分别在 32个反应管中进行扩增。在 5 μl反应体系中加 6～ 17对PCR引物 ,多个微卫星位点同时扩增 ,产物在ABI377XLDNA测序仪上进行电泳。结果 :4 0 0个微卫星位点共有 30 6个有满意的结果 ,其中 12 4个微卫星位点与法国CEPH家系存在片段范围的差异。结论 :遗传多态性片段大小范围在种族间存在较大差异 ;在对中国汉族人群进行基因分型时 ,应在Genethon提供的范围基础上向两侧各扩大 10bp。     

76例重庆地区汉族正常人谷胱甘肽S 转移酶P1基因多态性研究

目的 探讨重庆地区正常人谷胱甘肽S转移酶P1(GST P1)5号外显子105位氨基酸基因型频率分布情况。方法 用聚合酶链反应(PCR)技术和限制性片段长度多态性(RFLP)技术检测76例重庆地区汉族正常人GST P1 5号外显子105位氨基酸基因型和等位基因分布。结果 重庆地区汉族正常人GST P1 5号外显子105位点氨基酸基因型分布以野生型纯合子Ile(异亮氨酸)105 Ile基因型为主，占93．42％，而杂合子IIe 105 Val(颉氨酸)和突变型纯合子Val 105 Val基因型均较少，仅占3．95％和2．63％。GST P1 5号外显子105位点氨基酸等位基因分布以IIe 105等位基因为主(95．39％)，而Val 105等位基因极少(4．6％)。结论 中国重庆地区汉族正常人GST P1 5号外显子105位点氨基酸基因型频率和基因频率分布与国外其它民族分布情况有显著性差异，与国内其它地区的报道结果也有差异，提示在中国汉族人群内部其不同的地区GST P1基因多态性可能不一特     

基因多态性对实体器官移植 钙神经蛋白抑制剂处置的影响

钙神经蛋白抑制剂（calcineurin inhibitors, CNIs）他克莫司（tacrolimus, FK506）和环孢素（cyclosporine A, CsA）是目前广泛应用于器官移植术后的2种基础免疫抑制剂,具有治疗指数窄,药物代谢动力学个体差异大的特点。如何根据患者个体差异来制定FK506和CsA的个体化治疗方案,使其疗效达到最佳而毒副作用降至最低,是临床工作者所面临的一大难题。遗传药理学和药物基因组学通过研究编码药物代谢酶、药物转运体以及药物靶分子相关基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)对CNIs处置的影响,为免疫抑制剂的个体化治疗提供了一条有益的临床途径。     

重庆地区血红蛋白病的患病率及其基因型和血液学表型分析

目的：分析重庆地区血红蛋白病的携带率、基因型构成及血液学特征,为血红蛋白病筛查及诊断方法的合理选择提供依据。方法：对49 551例进行血红蛋白病筛查的患者外周血样本,采用多重PCR-导流杂交或测序等方法检测地中海贫血常见23种基因位点及血红蛋白变异体(hemoglobin variants,HbVs)相关突变位点;再对确诊血红蛋白病患者的血常规和血红蛋白电泳结果进行回顾分析,评估血常规、血红蛋白电泳二者联合检查在血红蛋白病筛查诊断中的价值。结果：共检出3 511例血红蛋白病(7.09%),其中α地贫携带者1 840例,以--^SEA/αα、-α^3.7/αα和-α^4.2/αα为主;β地贫携带者1 540例,以CD17、IVS-Ⅱ-654、CD41-42为主;异常血红蛋白病65例,β链变异体为主;复合血红蛋白病64例,α地贫复合β地贫携带者57例,地贫复合异常血红蛋白病7例。血红蛋白病患者的血红蛋白、红细胞平均体积、红细胞平均血红蛋白量指标降低与α或β链合成的减少程度呈正相关,而血红蛋白A2(adult hemoglobin ...