血管平滑肌细胞表型转换与动脉粥样硬化关系的研究进展

动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是心肌梗死、脑卒中等急性心脑血管事件的主要原因,是多种细胞参与的复杂病理过程。作为AS斑块内的主要细胞,血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)由收缩表型向其他表型的转换在AS的形成和进展中发挥着关键作用。     

基于平滑肌细胞表型转化角度探讨中医药治疗动脉粥样硬化进展

动脉粥样硬化是一种以纤维斑块和粥样斑块为主要病理特征的血管系统疾病。当纤维斑块或粥样斑块形成后,使动脉壁增厚、变硬,导致动脉管腔狭窄、弹性下降,甚至可导致急性冠状动脉综合征、缺血性脑卒中等并发症的发生,是多种心脑血管疾病的病理基础。血管平滑肌细胞主要环形分布于血管壁的中膜内,与血管的顺应性及弹性回缩密切相关,在生理情况下,血管平滑肌细胞具有收缩力强的特性,保持着低增殖、低迁移功能,在不同的环境条件影响下,血管平滑肌细胞会发生表型转化,从收缩表型向合成表型转化,促使平滑肌细胞由中膜迁移至内膜,随后在内膜中大量积聚并刺激结缔组织的形成,进而导致斑块失稳、管腔狭窄甚至斑块破裂等病理过程的发生。该文阐述了血管平滑肌与动脉粥样硬化发生发展的关系,并总结近十年中医药通过调控血管平滑肌细胞防治动脉粥样硬化的进展,旨在为中医药防治动脉粥样硬化提供更为可靠的理论依据。     

MicroRNA-145在动脉粥样硬化血管平滑肌细胞增殖迁移及表型转化中的研究进展

微小RNA(microRNAs,miRNAs)是一类长度为22～28个核苷酸的内源性非编码单链RNA,通过降解mRNA或抑制蛋白质翻译后修饰调控转录后基因的表达,是调控蛋白质生物合成的一类重要的非编码RNA。研究发现,miRNAs参与了动脉粥样硬化（atherosclerosis,As）斑块的形成、脂质代谢障碍、血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）损伤等过程的调节。miRNAs在VSMCs中的表达水平,为阐明As的发病机制提供了新视角,也为As的治疗提供了新靶点。miRNA-145是血管壁和新鲜分离的VSMCs中含量最丰富的miRNA,是VSMCs表型和增殖的关键调节因子。文章就miRNA-145对As发生发展过程中的VSMCs增殖、迁移及表型转化的调控作用进行了综述。     

血管平滑肌细胞表型转化影响因素及中药干预研究进展

成熟分化的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)受机体不同刺激时具有表型可塑性,VSMCs由分化型和收缩表型转化为去分化型的过程称之为表型转化.VSMCs表型转化在动脉粥样硬化、高血压、血管成型术后再狭窄、糖尿病血管病变等增殖性血管疾病中具有重要作用.本文主要介绍VSMCs表型转化影响因素及中药干预VSMC表型转化的研究进展,为中药防治增殖性血管疾病提供新思路.     

黑木耳多糖对兔动脉粥样硬化斑块中FAK表达的影响

目的：通过黑木耳多糖对兔动脉粥样硬化斑块中FAK的表达的影响,探讨黑木耳多糖降血脂和抗氧化以外的抗AS形成机制。方法：将40只健康雄性新西兰白兔随机分为三组：①空白对照组（正常组）8只,喂基础饲料;②阳性对照组（模型组）16只,高脂高胆固醇饲料喂养;③木耳多糖组（预防组）16只,每天每兔给高脂高胆固醇饲料＋5克木耳多糖喂养。12周末所有实验用兔麻醉处死,行主动脉粥样硬化病理形态学观察。通过HE染色、免疫组织化学染色对斑块内的病变进行定位、定量分析。结果：FAK在正常组呈弱阳性表达,而在模型组和预防组中血管内膜和中膜呈阳性表达。预防组与模型组对照的结果显示,FAK在预防组中的表达较模型组明显减少。结论：黑木耳多糖可抑制动脉粥样硬化斑块中FAK的表达,从而减少血管平滑肌细胞参与的动脉粥样硬化形成,发挥抗AS形成的作用。     

同型半胱氨酸对大鼠主动脉血管平滑肌细胞表型转化的影响

目的： 验证同型半胱氨酸（Hcy）是否具有促进大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）去分化的作用。 方法： SD大鼠主动脉VSMCs原代细胞培养鉴定,取4～7代细胞用于实验。VSMCs分为对照组、100 μmol/L Hcy干预组、500 μmol/L Hcy干预组、1 000 μmol/L Hcy干预组共4组。MTT法测各组VSMCs的增殖情况;划痕法和Transwell法检测各组VSMCs的迁移情况;ICC法检测各组VSMCs的细胞形态;Western blot法检测各组VSMCs中SM-actin、SM-MHC、Calponin、骨桥蛋白（OPN）的表达情况。 结果： 相比于对照组,Hcy组VSMCs增殖迁移增加;细胞形态变圆;SM-MCH和Calponin表达减少（ P＜0.01〉;OPN表达增加（ P＜0.01）,Hcy的这一作用与浓度呈正相关。 结论：Hcy可以促进VSMCs去分化,这可能是其促进VSMCs增殖和迁移的机制之一。     

血管平滑肌细胞表型转化与骨架蛋白表达之间的关系

目的:探讨体外培养血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)表型与细胞骨架蛋白表达之间的生物学意义.方法:体外培养大鼠主动脉VSMCs,实验分组为:对照组、血清饥饿组、血清再培养组,RT-PCR检测表型基因平滑肌22α(smooth muscle 22 alpha,SM22α)mRNA的表达;免疫细胞化学检测细胞骨架蛋白F-肌动蛋白(F-actin)的表达.结果:在体外培养条件下,对照组SM22α表达较低,细胞呈多角形或短梭形,细胞多有板状突起,F-actin的荧光强度明显减低;血清饥饿组SM22α表达恢复上调,VSMCs多细长,呈梭形,少见分裂相细胞,F-actin的荧光强度升高;血清再培养后SM22α表达减少,细胞呈增殖状态,见核分裂现象,F-actin的荧光强度减低.结论:VSMCs的表型和细胞骨架形态和数量表达之间有着重要的相互联系,它们在维持细胞功能、血管重构及在心血管疾病(高血压、动脉粥样硬化)的发生、发展中起重要作用.     

Geminin在血管平滑肌细胞分化表型转化中的介导作用

目的 通过比较静止状态的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)与血清刺激后的VSMCs在分化表型改变中Geminin的表达变化情况,探讨Geminin对VSMCs表型转化的影响.方法 实验设置静止状态(血清饥饿)对照组、血清刺激组,研究不同时相两个组Geminin的分布、活性及表达水平的差异.血清饥饿法可以诱导出VSMCs表型分化及活性差异;免疫荧光染色后激光共聚焦显微镜观察Geminin核内定位;应用PCR检测Geminin基因表达的变化;Western blot检测Geminin蛋白、VSMC合成型标志物骨桥蛋白(osteopontin,OPN)及收缩型标志物平滑肌肌动蛋白相关蛋白(actin-related proteins,ARP)表达的变化.结果 ①静止状态下(血清饥饿)VSMCs以收缩型为主,血清刺激后以合成型为主;②静止状态Geminin几乎全部存在于细胞质内,而血清刺激后Geminin几乎全部定位于胞核内;③Geminin mRNA在血清刺激时明显升高,且在刺激48 h时差异表达最明显,与无血清比较差异具有统计学意义(P<0 05);④Geminin蛋白和骨桥蛋白在血清刺激时均明显升高,与无血清比较差异具有统计学意义(P<0.05).结论 Geminin参与介导了VSMCs由收缩型向合成型的转化.     

褪黑素抑制人血管平滑肌细胞的巨噬样表型转化

目的探究褪黑素在人血管平滑肌细胞(VSMC)巨噬样表型转化中的作用。 方法VSMC分为对照组、胆固醇组(水溶性胆固醇)、褪黑素组(水溶性胆固醇+褪黑素)。水溶性胆固醇诱导VSMC建立巨噬样表型转化模型。定量PCR检测VSMC巨噬样表型相关基因表达水平;油红O染色观察各组VSMC脂质吞噬能力;Edu染色观察各组VSMC增殖情况;细胞划痕实验观察VSMC迁移情况。 结果10 mg/L水溶性胆固醇显著降低平滑肌收缩表型相关标志基因α-actin和α-tropomyosin mRNA表达,并显著升高巨噬细胞相关标志基因CD68和MAC2 mRNA表达,诱导VSMC巨噬样表型转化。0.5 μmol/L褪黑素可抑制水溶性胆固醇引起的VSMC脂质蓄积和细胞增殖,但对VSMC迁移无影响。 结论褪黑素抑制VSMC的巨噬样表型转化。     

大鼠血管平滑肌细胞的培养与鉴定

目的:改进大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)的培养方法。方法:采用机械刮除、差异贴壁等手段进行组织贴块法原代培养,胰蛋白酶消化传代,并应用相差显微镜和即用型SABC免疫组化染色试剂盒对细胞进行形态学和免疫组化鉴定。结果:镜下培养细胞呈典型的"谷-峰状"生长,免疫组化染色显示胞浆内-αactin阳性表达,锥虫蓝染色检测细胞传代成活率95%。结论:本法可获纯度高、结构和功能良好的VSMCs。     

氧化修饰的低密度脂蛋白促进平滑肌细胞表达VCAM-1

目的 探讨氧化修饰的低密度脂蛋白(ox-LDL)是否诱导培养的平滑肌细胞表达血管细胞粘附分子1(VCAM-1)。方法 采用原位杂交和免疫组化的方法检测。ox-LDL刺激后,原代培养小鼠主动脉中膜平滑肌细胞表达VCAM-1 mRNA和蛋白的情况。结果 ox-LDL作用后,平滑肌细胞VCAM-1 mRNA经原位杂交显色,细胞平均吸光度(A)值为0.2005±0.0190,与对照组(0.1446±0.0055)相比差异有极显著性意义(F=137.12,P<0.01)。平滑肌细胞VCAM-1蛋白表达经免疫组化显色后,细胞平均吸光度值为0.1295±0.0240,较对照组(0.0687±0.0085)亦有所增加,方差分析显示差异有极显著性意义(F=94.58,P<0.01)。结论 ox-LDL能够诱导动脉中膜平滑肌细胞表达高水平的VCAM-1 mRNA和蛋白,从而在动脉粥样硬化斑块形成过程中起重要作用。     

RNA干扰抑制血管平滑肌细胞MT1-MMP基因表达的实验研究

目的 探讨膜型基质金属蛋白酶-1(MT1-MMP)shRNA真核表达载体(pGenesil-1-MT1-MMP)对大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)MT1-MMP基因mRNA表达及蛋白表达的影响.方法 构建质粒表达载体pGenesil-1-MT1-MMP和pGenesil-1-HK;实验分为3组:空白对照组,阴性对照组(加入pGenesil-1-HK),RNA干扰(RNAi)组(加入pGenesil-1-MT1-MMP).用脂质体瞬时转染VSMC,48 h后通过荧光显微镜观察转染效果,流式细胞仪检测转染效率.于转染后72 h采用RT-PCR方法检测MT1-MMP mRNA表达水平,用Western blot方法检测MT1-MMP蛋白质表达水平.结果 瞬时转染VSMC 48 h后通过流式细胞仪检测转染效率高达85.5%,转染pGenesil-1-MT1-MMP质粒72 h后,RNAi组MT1-MMP mRNA及蛋白质水平明显下调(P<0.05).结论 靶向MT1-MMP的短发夹RNA质粒能够高效地转染入VSMC,并能有效下调MT1-MMP基因mRNA和蛋白的表达.     

实验性动脉内膜损伤后抑制血管平滑肌细胞增生的研究

目的 :观察血管内膜损伤后 c- m yc反义 RNA在抑制血管平滑肌细胞 (VSMC)增生、迁移及防止动脉粥样硬化形成和血管再狭窄中的作用。方法 :选雄性日本大白兔 36只 ,经球囊造成腹主动脉内膜损伤的同时 ,局部给予 c- myc反义 RNA、正义 RNA及盐水 ,高胆固醇喂养 12周处死。测量内膜厚度 ,计数增殖细胞核抗原 (PCNA)阳性细胞数。结果 :盐水及正义 RNA对照组动脉内膜明显增厚 (317μm) ,PCNA阳性细胞数明显增多 (6 2 % ) ,可见明显的粥样斑块灶形成。而反义 RNA治疗组内膜增厚度为 2 17μm,PCNA阳性细胞为 30 .5 % ,明显低于对照组 (P <0 .0 1)。结论 :c- myc反义 RNA具有显著抑制 VSMC增生 ,减轻粥样斑块形成的作用。     

血管内皮细胞脂质过氧化对平滑肌细胞和纤维母细胞DNA合成的影响

为探讨血管内皮细胞受脂质过氧化作用后对中膜平滑肌细胞增殖的影响，以氢过氧化枯烯作为引发剂引发培养牛主动脉内皮细胞的过氧化反应，测定其内皮细胞条件培养液对培养的牛主动脉中膜平滑肌细胞和Ｓｗｉｓ３Ｔ３细胞ＤＮＡ合成的影响。结果：氢过氧化枯烯作用后，内皮细胞脂质过氧化物的含量明显增加；各实验组均未见明显的形态改变和乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）含量的增加；由氢过氧化枯烯作用后，内皮细胞的条件培养液使平滑肌细胞和Ｓｗｏｓｓ３Ｔ３细胞的〔３Ｈ〕－ＴｄＲ掺入率明显增高。可以认为：脂质过氧化作用使内皮细胞对平滑肌细胞和纤维母细胞的增殖促进活性增强。为阐明脂质过氧化作用促进和加重体内动脉粥样硬化病变形成的机理提供了实验资料。     

二步酶消化法分离大鼠主动脉血管平滑肌细胞及活性鉴定

目的:建立一种有效、方便的大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)的酶解分离方法.方法:采用二步酶消化法分离VSM-Cs,显微镜下观察细胞形态,锥虫蓝染色观察细胞成活率,荧光显微镜检测细胞内钙荧光强度(FI)在KCl激下的变化,全细胞膜片钳记录电压-依赖性钾电流.结果:分离的VSMCs镜下呈典型的梭状或长条状,成活率达68.0％;VSMCs内钙FI在KCl刺激下可增高;并可记录到稳定的电压-依赖性钾电流.结论:本法可获得大量形态和结构良好的VSMCs,且胞膜离子通道功能良好.     

N-苄基氟哌啶醇氯化物对大鼠血管平滑肌细胞内钙离子的影响

目的:动态观察N_苄基氟哌啶醇氯化物(F3)对大鼠胸主动脉平滑肌细胞内Ca2+的影响。方法:用Ca2+荧光染料Fluo_3_AM负载大鼠胸主动脉平滑肌细胞,在激光扫描共聚焦显微镜上测定细胞内游离钙的变化。结果:在含CaCl2(1.26mmol/L)的细胞外液中,30 mmol/L KCl使细胞内钙荧光强度(FI)迅速增强,F3可以拮抗KCl诱导钙FI增强作用,并呈量效依赖和时间依赖关系。4种浓度F3(0.01、0.1、1.0、10μmol/L)作用3 min时,使KCl诱导细胞内钙FI从(81±4)%分别降至(71±18)%(n=20,P<0.05)、(51±12)%(n=20,P<0.01)、(39±14)%(n=20,P<0.01)、(28±14)%(n=20,P<0.01)。钙FI变化最快的时程是在给药后的0~30 s。结论:F3通过阻断细胞膜电压依赖性钙通道降低平滑肌细胞内钙浓度,这可能是其扩张血管,改善心肌缺血的机制。     

Inhibitory Effects of Roscovitine on Proliferation and Migration of Vascular Smooth Muscle Cells In Vitro

Abnormal proliferation and migration of vascular smooth muscle cells （VSMCs） are the major cause of in-stent restenosis （ISR）. Intervention proliferation and migration of VSMCs is an im- portant strategy for antirestenotic therapy. Roscovitine, a second-generation cyclin-dependent kinase in- hibitor, can inhibit cell cycle of multiple cell types. We studied the effects of roscovitine on cell cycle distribution, proliferation and migration of VSMCs in vitro by flow cytometry, BrdU incorporation and wound healing assay, respectively. Our results showed that roscovitine increased the proportion of Go/G1 phase cells after 12 h （69.57±3.65 vs. 92.50±1.68, P=0.000）, 24 h （80.87±2.24 vs. 90.25±0.79, P=0.000） and 48 h （88.08±3.86 vs. 88.87±2.43, P=-0.427） as compared with control group. Roscovifine inhibited proliferation and migration of VSMCs in a concentration-dependent way. With the increase of concen- tration, roscovitine showed increased capacity for growth and migration inhibition. Roscovitine （30 μmol/L） led to an almost complete VSMCs growth and migration arrest. Combined with its low toxicity and selective inhibition to ISR-VSMCs, roscovitine may be a potential drug in the treatment of vascular stenosis diseases and particularly useful in the prevention and treatment of ISR.     

体外培养中川芎嗪对大鼠血管平滑肌细胞血管细胞粘附分子-1表达的影响

目的　观察川芎嗪对血管平滑肌细胞 (VSMC)表达血管细胞粘附分子 1(VCAM 1)的影响。方法　在建立血管紧张素Ⅱ (AngⅡ )诱导的VSMC表达粘附分子模型的基础上 ,将培养的细胞分为 3组 :正常对照组、AngⅡ刺激组、川芎嗪治疗组。分别在 6、 12、 2 4h 3个时段 ,利用免疫细胞化学技术和原位杂交技术检测各组细胞中VCAM 1的蛋白表达及mRNA转录水平。结果　①各时段正常对照组即有VCAM 1的基础表达 ;②与正常对照组比较 ,AngⅡ能够明显诱导VCAM 1的表达 ,而且其诱导作用在 6h即已出现 (P <0 0 5 ) ,12h表达增强 (P <0 0 1) ,2 4h有所回降 (P <0 0 5 ) ;③川芎嗪在各个时段均能抑制VCAM 1蛋白和mRNA的转录水平 (P <0 0 5 )。结论　AngⅡ能够明显诱导VSMC中VCAM 1的表达 ,而川芎嗪能够通过抑制VSMC中VCAM 1的表达从而延缓早期动脉粥样硬化的病变进展     

补脾益气中药对脾气虚证大鼠血管平滑肌细胞内PDGF、bcl-2、bax表达的影响

目的：探究脾气虚证大鼠血管平滑肌细胞内PDGF、bcl-2、bax表达的变化及补脾益气方药对这种变化的调节作用。方法：将实验动物分成空白组、模型组、四君子汤组、六君子汤组、归脾汤组,用免疫组化法检测血管平滑肌细胞内PDGF、bcl-2、bax的表达。结果：与空白组比较,其他各组PDGF、bax的灰度值低,表达增强,bcl-2灰度值高,表达减弱（P〈0.05）。与模型组比较,其他各组的PDGF、bax灰度值高,表达减弱,bcl-2灰度值低,表达增强,（P〈0.05）。结论：脾气虚证大鼠血管平滑肌细胞内PDGF、bax表达增强,bcl-2表达减弱,而补脾益气中药能改善这种情况,从而为补脾益气中药防治心血管系统疾病提供实验室依据。