胶质细胞源性神经营养因子促进培养的背根神经节神经元中P物质的释放

目的探测胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）对培养的胎鼠背根神经节（DRG）神经元中P物质（SP）释放的影响作用。方法Wistar胎鼠DRG神经元分散培养72h，观察有GDNF（5ng/mL, 50ng/mL）和没有GDNF孵育的神经元活细胞生长状况,计数用微管相关蛋白2（MAP2）和4′, 6二脒基-2-苯吲哚（DAPI）双染的DRG神经元数目，用放射免疫分析法（RIA）检测辣椒素孵育前后SP的释放。结果用GDNF孵育的神经元生长状况良好，单位视野内神经元数目多于无GNDF孵育的标本，SP的基础释放量和辣椒素刺激后的释放量均高于无GDNF孵育的标本。结论GDNF可促进培养的胎鼠DRG神经元的存活，能增加培养中神经递质SP的基础释放量，可能增加辣椒素诱发神经递质SP释放的敏感性。     

HIVgp120对胎鼠背根神经节神经元突起生长的影响

探讨人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus, HIV）gp120对体外培养的背根神经节神经元胞体和突起生长的影响。方法：分散培养的胎鼠背根神经节神经元用不同浓度的HIV gp120 (125、250、500?pmol/L和1?nmol/L) 处理,对分散培养的背根神经节神经元用MAP2免疫荧光标记后,用共聚焦激光扫描显微镜观察神经元胞体和突起的改变。结果：应用gp120后7?d,神经元突起的数目减少,长度变短,而神经元的胞体则没有明显变化。结论：HIV gp120可直接影响分散培养的背根神经节神经元突起的生长。     

人参皂苷Rb1对胎鼠背根神经节损伤的保护作用

目的观察不同浓度人参皂苷Rb1对损伤胎鼠背根神经节（DRG）神经元形态学改变的影响,探讨人参皂苷Rb1对谷氨酸引起的兴奋性神经毒损伤的保护作用,为Rb1的进一步研究和临床应用提供理论依据。方法选择胎龄为15 d的SD大鼠,获取DRG神经元并进行体外分散培养48 h后,随机分为对照组、谷氨酸损伤组、谷氨酸损伤＋低浓度Rb1（10μg/ml）保护组和谷氨酸损伤＋高浓度Rb1（100μg/ml）保护组,继续培养12 h。终止培养后,倒置相差显微镜观察各组神经元的生长状态,MTT检测不同浓度人参皂苷Rb1孵育的背根神经节神经元的凋亡增殖情况。结果对照组DRG神经元细胞贴壁呈单层散在分布,少部分出现细胞聚集现象,突起较长且互相交织形成网状;谷氨酸损伤组DRG神经元细胞聚集现象明显,神经元突起变短、断裂甚至消失;谷氨酸损伤＋Rb1保护组DRG神经元细胞部分呈簇状聚集,部分呈单个散在分布,突起仍然相互交织。MTT结果显示谷氨酸损伤＋Rb1保护组细胞存活率均高于谷氨酸损伤组,但高浓度Rb1保护组与低浓度Rb1保护组之间差异无统计学意义。结论人参皂苷Rb1可以影响损伤胎鼠DRG神经元的形态学改变和凋亡增殖情况,对胎鼠背根神经节神经元具有一定的保护作用。     

胰岛素样生长因子 1对背根神经节神经元谷氨酸损伤的保护作用

目的探测胰岛素样生长因子 1（IGF 1）对背根神经节（DRG）神经元谷氨酸（Glu）损伤的保护作用。方法Wistar胎鼠DRG神经元分散培养48?h后,用Glu（200?μmol/L）造成神经元损伤,并同时给予IGF 1（10?nmol/L）,观察添加IGF 1和未添加IGF 1孵育的Glu损伤的神经元的活细胞生长状况,并用流式细胞仪检测神经元的凋亡率,用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）检测细胞内钙离子荧光强度。结果用IGF 1孵育的神经元生长状况良好,凋亡率、细胞内钙离子荧光强度均低于无IGF 1孵育的标本。结论IGF 1可通过减低钙离子内流,抑制细胞凋亡,从而对Glu损伤的DRG神经元产生保护作用。     

辣椒素对背根神经节神经元钙离子浓度和线粒体膜电位的影响

目的探讨辣椒素对体外原代培养的胎鼠背根神经节（dorsal root ganglion，DRG）神经元钙离子浓度（［Ca²⁺］_i）和线粒体膜电位（mitochondiral membrane potential，MMP）的影响作用。方法分散培养的胎鼠DRG神经元用不同浓度的辣椒素（0.001μmol/L, 0.01μmol/L, 0.1μmol/L, 1μmol/L, 10μmol/L）孵育1min，用共聚焦激光扫描显微镜检测神经元［［Ca²⁺］_i的改变。对于能引起［Ca²⁺］_i升高的浓度组，在辣椒素孵育1min时，用流式细胞术检测神经元MMP的变化；并且在移去辣椒素后10min，重新检测神经元［Ca²⁺］_i的变化。结果0.001μmol/L、0.01μmol/L辣椒素孵育1min，神经元胞内［［Ca²⁺］_i没有变化；0.1μmol/L、1μmol/L和10μmol/L辣椒素孵育1min，神经元胞内［Ca²⁺］_i升高，移去辣椒素后10min，0.1μmol/L、1μmol/L辣椒素孵育的DRG神经元胞内［Ca²⁺］_i恢复到基础水平，10μmol/L辣椒素孵育的标本升高的［Ca²⁺］_i没有明显改变。辣椒素孵育时用无钙溶液，则神经元胞内［Ca²⁺］_i不升高。10?μmol/L辣椒素孵育1min的DRG神经元MMP降低，0.1μmol/L和1μmol/L辣椒素孵育的标本MMP无明显变化。结论一定浓度的辣椒素可使原代培养的DRG神经元胞内［Ca²⁺］_i升高，MMP降低。低浓度辣椒素引起的［Ca²⁺］_i的升高在10min内可以恢复到基础水平，而高浓度辣椒素引起的［Ca²⁺］_i的升高在10min内则不能恢复。辣椒素所致的胞内［Ca²⁺］_i升高可能是由于胞外钙离子内流引起的。     

培养大鼠下丘脑神经元生长规律及免疫细胞化学研究

目的：探讨体外培养胎鼠下丘脑CRH神经元的形态、生长变化规律及CRH的表达变化。方法：取17d胎鼠下丘脑分散培养下丘脑神经元，镜下连续观察神经元胞体直径、突起长度、数目等变化规律，应用免疫组织化学染色方法观察CRH神经元的生长变化规律。结果：培养下丘脑CRH神经元3-6d生长速度最快；7-10d神经元细胞数量、胞体直径、突起长度和CRH染色强度均达高峰；12d以后部分神经元出现退形性改变。结论：培养下丘脑CRH神经元7-10d迅速生长趋于成熟，是神经元机能测试的最佳时期。     

大鼠脊髓神经元原代细胞的分散培养

目的　建立一种简单、易行、满足基本科研需要的脊髓神经元原代细胞分散培养法。方法　取Wistar大鼠胎鼠或新生鼠的脊髓 ,以胰蛋白酶消化和机械吹打相结合 ,将组织分散成细胞悬液 ,培养于含10 %胎牛血清和阿糖胞苷 (抑制胶质细胞的增殖 )DMEM培养基中 ,观察脊髓神经元细胞生长状况。结果　3～ 6h细胞开始贴壁 ,胞体周围渐有突起 ;2～ 3d胞体明显增大 ,突起生长旺盛 ,连接呈网络 ;10d时细胞形态最为丰满 ;3周后细胞开始退化 ,胞内出现空泡。结论　培养的脊髓神经元形态发育符合正常规律变化 ,适用于形态学、生化、遗传、药理等学科研究     

大鼠皮质神经元的体外培养和纯化

目的：探讨大鼠皮质神经元分离纯化的有效方法。方法：取胎鼠大脑皮质细胞，分别在不同的培养液中进行原代培养，利用相差显微镜对培养的细胞进行动态观察；并以免疫细胞化学技术对神经元进行染色。结果：在相差显微镜下可见加用N2添加剂和胎牛血清培养的神经元生长良好，胞体形态多样，突起数目多，长度长，与邻近神经元的胞体或突起形成接触，而胶质细胞则大量死亡，神经元纯化率达94％以上，未加用N2添加剂培养的神经元胶质细胞大量存在，神经元纯化率达50％左右。结论：N2添加剂和胎牛血清联合应用可使大鼠皮质神经元得到良好的生长和有效纯化。     

壳寡糖促神经元生长的作用

目的研究壳寡糖（COSs）对大鼠神经元生长的影响。方法以体外培养的背根神经节（DRG）和DRG神经元为研究模型,通过神经丝蛋白-H（NF—H）免疫荧光细胞化学染色和LeicaQWin软件检测不同浓度壳寡糖（0．0、0．1、0．2mg／m1）作用5d对DRG和DRG神经元突起生长的影响;通过Westernblot检测不同浓度壳寡糖（0．05、0．1、0．2mg／m1）作用DRG神经元12h后,对DRG神经元中NF—H和生长相关蛋白-43（GAP-43）表达的影响。结果与对照组相比,中、高剂量壳寡糖（0．1、0．2mg／m1）显著促进DRG突起的生长（均P〈0．01）;0．2mg／ml剂量的壳寡糖明显促进DRG神经元突起的生长（P〈0．05）。与对照组相比,体外培养的DRG神经元加入壳寡糖作用12h后,0．2mg／ml剂量壳寡糖组的NF—H和GAP43表达量明显增加（分别P〈0．05和〈0．01）。结论壳寡糖可有促进体外培养的DRG和DRG神经元突起的生长,并可促进NF—H、GAP43的表达。     

胎鼠脊髓内源性NT—3及BDNF对脊髓神经元的营养作用

目的：研究发育中的胎鼠脊髓中神经营养因子－3（NT－3）和脑源性的神经营养因子（BDNF）的营养作用．方法：用抗NT－3及BDNF的抗体封闭小鼠胚胎脊髓内源性NT－3及BDNF，观察封闭后体外培养的脊髓神经元活性和突起生长的变化．结果：NT－3在小鼠脊髓神经元中广泛表达，其作用主要为促进脊髓神经元突起生长，不加抗体封闭式，突起平均长度为（362．062±166．381）μm，当封闭抗体浓度为5mm／L时，突起长度为（262．011±109．168）μm．BDNF免疫反应阳性细胞主要为大细胞和DRG神经元，其作用主要是促进神经元的存活，在封闭抗体浓度为6．25mg／L，4．34mg／L时吸光度（A）值显著低于对照组．结论：发育中胚胎小鼠脊髓中NT－3促进神经元突起生长，BDNF则促进神经元存活．     

果蝇三龄幼虫中枢神经元细胞培养

目的：建立果蝇幼虫中枢神经元细胞培养方法，为研究吸入麻醇药相关的离子通道建立实验模型。方法：取晚期三龄幼虫的脑腹神经节经解剖，酶解、冲洗，吹打、接种，培养步骤进行分散细胞的原代培养，并用膜片钳技术记录全细胞电流以检测培养细胞的功能。结果：培养的神经元细胞生长活跃，状态良好，具有神经元的特征-轴突生长及形成网络连接，以“全细胞方式”记录到的电压依赖性K^ 电流在不同细胞之间电流动力学和幅度变化较大，呈多样性。结论：果绳中枢神经元可在体外进行培养，方法稳定可靠；培养的神经元细胞生长活跃，状态良好，为进行吸入麻醉药的电生理机制提供良好实验模型。     

细胞黏附分子L1基因沉默对胰腺癌细胞Capan-2神经侵袭能力的影响

目的 观察沉默细胞黏附分子L1基因(L1CAM)表达后对胰腺癌Capan-2细胞体外神经侵袭能力的影响.方法 应用慢病毒介导的L1CAM-shRNA干扰载体转染胰腺癌Capan-2细胞,以L1CAM-NC转染细胞为对照.分别将L1CAM-shRNA组及L1CAM-NC组细胞与大鼠背根神经节(DRG)、基质胶(matrigel)一起构成共培养神经侵袭模型,倒置显微镜下观察神经突及细胞生长情况并拍照,利用Image pro plus图像分析软件对照片进行分析.结果 共培养模型中,L1CAM-NC对照组细胞向DRG方向不断迁移增殖,包绕神经突起并沿之向DRG爬行,而L1CAM-shRNA组中并未观察到该现象.共培养第3天和第5天时,L1CAM-NC对照组细胞集落面积显著高于L1CAM-shRNA组(P＜0.01),但两组的神经突生长差异无统计学意义.结论 干扰L1CAM的表达可能通过抑制细胞集落形成及迁移爬行的方式抑制胰腺癌Capan-2细胞的神经侵袭作用.     

胚胎神经干细胞的分离和培养

目的：分离培养胚胎神经干细胞,探讨神经干细胞的取材方法。方珐：在解剖显微镜下,从孕11d(E11d)大鼠胚胎剥离神经管,剪成组织块进行培养,同时取部分神经管经胰酶消化后,获取细胞悬液进行单细胞培养;于培养后不同时间观察细胞的生长状况。结果：在组织块培养和单细胞培养中,接种细胞均生长良好;体外培养5d时,从组织块边缘放射状生长、迁移出细胞,并伸出突起;单细胞培养中,细胞增殖成团并长出突起连成网状。结论：组织块和单细胞培养法均可以从胚胎神经管分离、培养神经干细胞。     

针刺及内源性c-Fos、c-Jun对体外培养备用背根节的影响

目的 探讨部分背根切除和针刺及内源性c-Fos和c-Jun对体外培养备用背根节(DRG)的作用.方法 制备备用根猫模型;采用针刺备用根猫模型、细胞培养以及在部分培养液中加入抗c-Fos/c-Jun抗体的方法,将实验分为针刺组、抗c-Fos抗体组、抗c-Jun抗体组及备用DRG组;并用抗神经元特异性烯醇化酶(NSE)抗体行免疫细胞化学ABC法染色进行神经元鉴定.结果 免疫组化染色可见95%以上的细胞为NSE阳性反应的细胞,且为典型的体外培养的DRG神经元.体外培养备用根组、抗c-Fos抗体组、抗c-Jun抗体组神经元突起的平均长度均比针刺组短(P＜0.05);抗c-Fos/c-Jun抗体组均比备用根组长(P＜0.05).结论 针刺可促进体外培养DRG神经元的突起生长作用;内源性c-Fos、c-Jun可能对体外培养DRG神经元突起生长有促进作用.     

Biocompatibility evaluation of electrospun aligned poly(propylene carbonate) nanofibrous scaffolds with peripheral nerve tissues and cells in vitro

Background  Peripheral nerve regeneration across large gaps is clinically challenging. Scaffold design plays a pivotal role in nerve tissue engineering. Recently, nanofibrous scaffolds have proven a suitable environment for cell attachment and proliferation due to similarities of their physical properties to natural extracellular matrix. Poly(propylene carbonate) (PPC) nanofibrous scaffolds have been investigated for vascular tissue engineering. However, no reports exist of PPC nanofibrous scaffolds for nerve tissue engineering. This study aimed to evaluate the potential role of aligned and random PPC nanofibrous scaffolds as substrates for peripheral nerve tissue and cells in nerve tissue engineering.

Methods  Aligned and random PPC nanofibrous scaffolds were fabricated by electrospinning and their chemical characterization were carried out using scanning electron microscopy (SEM). Dorsal root ganglia (DRG) from Sprague-Dawley rats were cultured on the nanofibrous substrates for 7 days. Neurite outgrowth and Schwann-cell migration from DRG were observed and quantified using immunocytochemistry and SEM. Schwann cells derived from rat sciatic nerves were cultured in electrospun PPC scaffold-extract fluid for 24, 48, 72 hours and 7 days. The viability of Schwann cells was evaluated by 3-[4,5-dimethyl(thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl] tetrazolium bromide (MTT) assay.

Results  The diameter of aligned and random fibers ranged between 800 nm and 1200 nm, and the thickness of the films was approximately 10–20 μm. Quantification of aligned fiber films revealed approximately 90% alignment of all fibers along the longitudinal axis. However, with random fiber films, the alignment of fibers was random through all angle bins. Rat DRG explants were grown on PPC nanofiber films for up to 1 week. On the aligned fiber films, the majority of neurite outgrowth and Schwann cell migration from the DRG extended unidirectionally, parallel to the aligned fibers. However, on the random fiber films, neurite outgrowth and Schwann cell migration were randomly distributed. A comparison of cumulative neurite lengths from cultured DRGs indicated that neurites grew faster on aligned PPC films ((2537.6±987.3) μm) than randomly-distributed fibers ((493.5±50.6) μm). The average distance of Schwann cell migration on aligned PPC nanofibrous films ((2803.5±943.6) μm) were significantly greater than those on random fibers ((625.3±47.8) μm). The viability of Schwann cells cultured in aligned PPC scaffold extract fluid was not significantly different from that in the plain DMEM/F12 medium at all time points after seeding.

Conclusions  The aligned PPC nanofibrous film, but not the randomly-oriented fibers, significantly enhanced peripheral nerve regeneration in vitro, indicating the substantial role of topographical cues in stimulating endogenous nerve repair mechanisms. Aligned PPC nanofibrous scaffolds may be a promising biomaterial for nerve regeneration.

     

壳寡糖对神经干细胞分化的影响

目的:探讨壳聚糖的降解产物壳寡糖对神经干细胞分化的影响。方法:将壳聚糖降解为分子量1100能够溶于水的壳寡糖,然后将不同浓度的壳寡糖(0.1mg/ml,0.01mg/ml)与神经干细胞共培养12天,研究壳寡糖对神经干细胞分化的影响,对照组采用无壳寡糖培养。结果:实验组的神经干细胞分化的突起平均长度比对照组要长,表明一定浓度的壳寡糖能够促进神经干细胞的分化。结论:用壳聚糖制备人工神经移植物时,壳聚糖导管不仅在神经再生过程可起到支架,细胞依附的作用,同时其降解产物壳寡糖能够起到促进神经生长的作用,而进一步阐明壳聚糖具有多功能的生物学作用。     

成年猫备用背根节内神经营养素-3对节内神经元的神经营养作用

目的 探讨成年猫部分去传入后备用背根节内神经营养素-3对节内神经元的神经营养作用。方法 切断L1、L3、L5和L7背根．术后第7d摘取L2、L4和L6背根节做分离细胞培养。对正常背根节、备用背根节和备用背根节加抗体封闭3个实验组中神经元存活、突起生长等情况进行观察比较。结果 备用背根节组存活细胞和细胞微团数目以及神经突起长度均明显高于正常组和抗体封闭组。结论 备用背根节内神经营养素-3对节内神经元有维持存活、促进突起生长的作用。