高强度聚焦超声制备抗原致敏树突状细胞及其诱导细胞毒性T淋巴细胞杀伤效应的研究

目的 探讨高强度聚焦超声(HIFU)制备抗原致敏树突状细胞(DC)及其诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的杀伤效应.方法 应用小鼠重组GM-CSF和IL-4培养小鼠骨髓DC,用HIFU制备CT26肿瘤细胞抗原致敏DC疫苗,用3H-TdR法检测T细胞增殖反应的能力,标准的4 h 51Cr 释放测定法检测CTL杀伤活性.结果 HIFU组、肿瘤细胞冻融组、肿瘤上清组和PBS组的DC在体外均可以诱导CTL增殖,但HIFU组、肿瘤细胞冻融组的DC体外诱导CTL增殖能力明显高于肿瘤上清组和PBS组(P＜0.05).HIFU组和肿瘤细胞冻融组DC体外诱导的CTL对CT26结肠癌均有明显的细胞毒性作用,与肿瘤上清组DC和PBS组比较差异有统计学意义(P＜0.05),HIFU组体外诱导的CTL杀伤活性与肿瘤细胞冻融组比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 HIFU制备抗原致敏DC可以诱导CTL大量增殖,并能诱导出杀伤效应较强的CTL.     

高强度聚焦超声制备树突状细胞瘤苗对BALB/c小鼠肿瘤主动免疫的实验研究

目的探讨采用高强度聚焦超声(HIFU)制备肿瘤抗原致敏树突状细胞(DC)对正常BALB/c小鼠肿瘤的主动免疫作用。方法采用功率1000W/cm2的HIFU辐照CT-26结肠癌细胞30s,获取肿瘤抗原,与体外培养扩增第5天的DC共孵育,制备DC瘤苗。HIFU辐照法制备的DC瘤苗(HIFU组)一次性免疫正常BALB/c小鼠,7d后再皮下接种活的CT-26结肠癌细胞,然后观察肿瘤发生时间、20d时瘤体重量和体积、小鼠生存时间等。并设立反复冻融法致敏DC组(冻融组)和生理盐水对照组(对照组),比较各组瘤体重量和体积、小鼠生存时间是否有差异。结果HIFU组、冻融组与对照组比较肿瘤发生时间、20d瘤体重量和体积、小鼠中位生存时间等差异均有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。HIFU组与冻融组比较瘤体重量、体积及小鼠中位生存时间差异亦有统计学意义(P<0.05)。结论HIFU辐照法制备的DC瘤苗对小鼠肿瘤的发生有一定的主动免疫作用,并优于反复冻融法制备的DC瘤苗。     

DC-CIK细胞的生物学活性及体外抗白血病作用的研究

本研究探讨树突状细胞（DC）对细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）增殖能力、免疫表型、分泌细胞因子水平及抗白血病细胞的作用。健康人外周血单个核细胞诱导DC和CIK，将DC与CIK共培养，以CIK细胞单独培养为对照。用台盼蓝活细胞计数计算细胞扩增倍数，MTT法测定杀伤活性，流式细胞术分析免疫表型，ELISA双抗体夹心法测定干扰素-γ（IFN-γ）、白介素-12（IL—12）的水平。结果表明：DC—CIK细胞增殖能力明显高于CIK细胞（P〈0．05）；DC、CIK细胞共培养后，CD3^＋CD8^＋、CD3^＋CD56^＋细胞比率较相同条件下CIK细胞组显著增多（P〈0．05）；共培养3天，DC—CIK细胞上清液中IL-12、IFN-γ水平均比CIK细胞单独培养的水平高（P〈0．01，P〈0．05）；在5：1—40：1的效靶比范围内，DC—CIK细胞对白血病细胞的杀伤率显著高于CIK细胞（P〈0．05），且杀伤率与效靶比呈正相关。结论：DC增加CIK细胞的增殖能力和抗白血病活性，有可能作为一种临床有效的抗白血病免疫治疗手段。     

NOD2信号增强对负载白血病抗原的树突状细胞的作用研究

本研究旨在探讨胞壁酰二肽（muramyldipeptide,MDP）激活NOD2信号通路对白血病抗原致敏的树突状细胞（dendriticcells,DC）的免疫调控影响。采用梯度离心法获取健康人外周血单个核细胞（peripheralbloodmononu-clearceus,PBMNC）,体外给予3种细胞因子诱导培养7d,第5d给予白血病细胞株HL-60冻融抗原致敏DC,DC诱导成熟后,给予MDP（2000ng／ml,24h）刺激各组细胞。应用RT．PCR和Westernblot检测NOD2mRNA和蛋白表达,流式细胞仪分析各组DC表面分子,ELISA法检测各组DC培养上清中IL-12和p40表达。结果显示：MDP作用于经不同方式处理的DC后,可以刺激NOD2mRNA和蛋白的表达,并以负载白血病细胞株HL．60冻融抗原并给予MDP刺激DC组（致敏DC4-MDP组）最高,其显著高于仅给予MDP刺激无负载抗原DC组（DC＋MDP组）和无MDP刺激致敏DC组,差异有统计学意义（P〈0．05）;DC表面分子（HLA-DR、CD80、CD83、CD86、CD40）在致敏DC＋MDP组表达明显高于DC4-MDP组和致敏DC组,未处理DC表达最低,差异有统计学意义（P〈0．05）;同样地发现,致敏DC-4-MDP组分泌细胞因子IL-12p40最高为（898．30±61．08）pg／ml,显著高于DC4-MDP组（573．86±32．09）pg／ml和致敏DC组（365．03±28．86）pg／ml,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：MDP可明显上调致敏DC中NOD2mRNA和蛋白表达,同时促进致敏DC表面HLA-DR、协同共刺激分子、黏附分子表达及炎性因子IL-12和p40分泌。本研究有望为DC在白血病免疫治疗中的应用提供新思路。     

高强度聚焦超声制备肿瘤抗原致敏树突状细胞

目的:探讨用高强度聚焦超声辐照肿瘤细胞制备肿瘤抗原致敏树突状细胞的可行性,为高强度聚焦超声开辟新的应用领域。方法:实验于2004-01/2005-04在泰安市中心医院中心实验室完成。①实验材料:BALB/C清洁级小鼠20只。CT-26肿瘤细胞为BALB/C小鼠来源的结肠癌细胞,由解放军第二军医大学免疫学研究所惠赠。②实验方法:应用白细胞介素4 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子联合诱导培养小鼠骨髓细胞。设立4组:高强度聚焦超声辐照组将CT-26细胞置于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中,进入对数生长期后调整细胞浓度为5×109L-1,采用1000W/cm2×30s剂量辐照CT-26细胞,离心,取上清过滤除菌。冻融组将CT-26细胞调整浓度至5×109L-1,-80℃冷冻,35℃水浴复温,循环4次,裂解离心,取上清过滤除菌。单纯CT-26细胞组将CT-26细胞调整浓度至5×109L-1,细胞不经其他任何处理。空白对照组将树突状细胞与抗原按1∶10接种,培养4～6h。从小鼠脾脏制备脾细胞,分离纯化T细胞,调整浓度至2×109L-1,T细胞与上述4组负载的树突状细胞按20∶1接种,培养基中加入白细胞介素2,共孵育48h。③实验评估:对扩增培养的树突状细胞首先进行形态学观察,再采用流式细胞仪分析细胞表型。锥虫蓝染色观察高强度聚焦超声辐照后CT-26细胞拒染率和形态学变化。ELISA法检测各组致敏树突状细胞诱导T细胞分泌白细胞介素12及干扰素-γ的含量。结果:①骨髓源性树突状细胞形态及细胞表面表型分析:体外培养小鼠骨髓细胞6～8d,细胞表面出现较多毛刺样突起,拉长,为典型的树突状细胞特征。流式细胞仪检测树突状细胞表面分子CD80、CD86、H-2Kd及I-Ad呈高表达。②高强度聚焦超声辐照后细胞拒染率和形态学的变化:超声辐照剂量为1000W/cm2×30s时,无细胞存活,完全失去细胞形态,全部被撕裂成碎片。③致敏树突状细胞诱导T细胞分泌细胞因子情况:与空白对照组比较,高强度聚焦超声辐照组、冻融组、单纯CT-26细胞组分泌的白细胞介素12及干扰素-γ含量均明显升高(P均<0.05);且高强度聚焦超声辐照组、冻融组升高幅度大于单纯CT-26细胞组,但此两组比较差异无显著性意义(P>0.05)。结论:高强度聚焦超声能使肿瘤细胞灭活、破碎,其制备的肿瘤抗原可体外致敏树突状细胞,并使树突状细胞分泌白细胞介素12,诱导T细胞分泌干扰素-γ。     

树突状细胞联合射频消融治疗大鼠实体瘤的实验研究

目的通过联合应用树突状细胞（dendriticcell，DC）和射频消融术（radiofrequency ablation，RFA）治疗大鼠Walker256实体瘤的实验，探讨其I临床应用的可能性。方法Walker256细胞经热休克冻融获得肿瘤抗原并致敏大鼠骨髓细胞衍化的DC，38只Walker256实体瘤成瘤SD大鼠随机分成3组：对照组1（n=10）仅行RFA治疗；对照组2（n=10）行RFA＋未致敏DC治疗；实验组（n=18）行RFA＋冻融热休克抗原致敏DC治疗。测量并比较各组治疗前后肿瘤体积变化，记录大鼠的荷瘤生存期。结果治疗后，实验组瘤体平均体积均显著小于2个对照组（P〈0．05）。实验组荷瘤生存期显著长于对照组（P〈0．05）。结论经冻融热休克抗原致敏DC联合RFA治疗大鼠实体瘤可有效地抑制肿瘤生长，延长大鼠荷瘤生存期，具有较好的临床应用前景。     

热休克抗原致敏树突状细胞联合射频消融治疗荷瘤大鼠的免疫效应

目的将热休克抗原致敏后的树突状细胞（DC）应用于射频消融术（RFA）后治疗大鼠Walker 256实体瘤，探讨其对大鼠免疫机能的影响。方法将Walker 256肿瘤细胞经热休克冻融后致敏大鼠骨髓细胞衍化的DC以获得DC瘤苗；48只荷Walker 256实体瘤SD大鼠随机分成4组：对照组1（n=10）仅行RFA治疗；对照组2（n=10）仅行DC瘤苗治疗，对照组3（11=10）行RFA＋未致敏DC治疗，实验组（n=18）行RFA＋DC瘤苗治疗。治疗前及治疗后第4天分别测量各组大鼠外周血中CD4^＋T淋巴细胞、CD8^＋T淋巴细胞及CD4^＋／CD8^＋比值，超声评价各组肿瘤治疗前后体积变化，记录大鼠的荷瘤生存期。结果治疗后，与三组对照大鼠相比，实验组大鼠外周血中CD4^＋T细胞、CD4^＋／CD8^＋比值显著升高，CD8^＋T细胞显著下降（P〈0．05）；实验组实体瘤体积增大明显缓慢于各对照组（P〈0．05），且维持较长的荷瘤生存期（P〈0．05）。结论在RFA后应用冻融热休克抗原致敏DC治疗大鼠实体瘤可有效地改善其抗肿瘤免疫机能，并在延缓残存肿瘤生长，延长大鼠荷瘤生存期中发挥一定作用。     

抗原冲击致敏树突状细胞诱导特异性CTL杀伤Jurkat细胞实验研究

本研究以健康人外周血单核细胞为前体细胞，体外诱导其为树突状细胞（DC），分别负载Jurkat细胞冻融抗原及WT1多肽抗原，产生特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL），以探讨其对白血病Jurkat细胞的杀伤作用。联合应用rhGM—CSF、rhIL-4、rhTNF-α及rhsCD40L等细胞因子，密度梯度离心法、贴壁法从外周血获取单核细胞并进行诱导扩增，培养出DC，分别用冻融抗原及WT1多肽抗原冲击致敏DC。实验分4组：冻融抗原致敏DC组为实验组A，WT1多肽致敏DC组为实验组B，未致敏DC组为对照组A，单核细胞组为对照组B，观察CTL对Jurkat细胞的杀伤作用。结果表明：培养出了具有典型特征的DC，它高表达CD40、CD80、CD1a及CD86等表面标志，能体外诱导强烈的同种异基因混合淋巴细胞增殖反应。实验组显示高水平杀伤率，与对照组比较均具有统计学意义（P〈0.01），实验组A、B间比较无统计学意义。结论：Jurkat细胞冻融抗原及WT1多肽抗原冲击致敏DC能有效诱导T细胞抗白血病作用，为临床研制DC疫苗提供了实验依据。     

脐血DC-CIK细胞增殖及其对淋巴瘤细胞细胞毒作用的研究

目的研究脐血DC-CIK细胞增殖能力、免疫表型、分泌细胞因子水平及其对淋巴瘤细胞的细胞毒作用。方法采集脐血单个核细胞诱导DC和CIK细胞。将DC和CIK细胞按1：5的比例混合培养,以脐血CIK细胞为对照。用流式细胞术分析细胞表型,台盼蓝活细胞计数计算细胞扩增倍数,MTT法检测效应细胞杀伤淋巴瘤细胞的活性,ELISA法测定分泌干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子（TNF—α）、白细胞介素-12（IL-12）的水平。结果脐血DC—CIK细胞增殖能力显著高于单纯CIK细胞（P〈0．05）;DC,CIK细胞共培养后,CD3^＋CD8^＋和CD3^＋CD56^＋细胞比例较同条件下CIK细胞明显增多（P〈0．05）;混合培养3d,脐血DC—CIK细胞上清液中IL-12,IFN-γ,TNF—α含量均比CIK细胞单独培养分泌量高（P〈0．01,P〈0．05,P〈0．05）;在2．5：1～20：1效靶范围内,脐血DC—CIK细胞对淋巴瘤细胞的杀伤率明显高于CIK细胞（P〈0．05）,且对HL和NHL细胞杀伤活性无显著差异。结论脐血DC可增强同源CIK细胞的增殖活性和抗淋巴瘤效应。因脐血来源丰富,且输注不易引起严重的移植物排斥反应,其DC—CIK细胞在免疫治疗方面应有更广泛的临床应用前景。     

脐血DC—CIK细胞增殖及其对淋巴瘤细胞细胞毒作用的研究

目的研究脐血DC-CIK细胞增殖能力、免疫表型、分泌细胞因子水平及其对淋巴瘤细胞的细胞毒作用。方法采集脐血单个核细胞诱导DC和CIK细胞。将DC和CIK细胞按1：5的比例混合培养,以脐血CIK细胞为对照。用流式细胞术分析细胞表型,台盼蓝活细胞计数计算细胞扩增倍数,MTT法检测效应细胞杀伤淋巴瘤细胞的活性,ELISA法测定分泌干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子（TNF—α）、白细胞介素-12（IL-12）的水平。结果脐血DC—CIK细胞增殖能力显著高于单纯CIK细胞（P〈0．05）;DC,CIK细胞共培养后,CD3^＋CD8^＋和CD3^＋CD56^＋细胞比例较同条件下CIK细胞明显增多（P〈0．05）;混合培养3d,脐血DC—CIK细胞上清液中IL-12,IFN-γ,TNF—α含量均比CIK细胞单独培养分泌量高（P〈0．01,P〈0．05,P〈0．05）;在2．5：1～20：1效靶范围内,脐血DC—CIK细胞对淋巴瘤细胞的杀伤率明显高于CIK细胞（P〈0．05）,且对HL和NHL细胞杀伤活性无显著差异。结论脐血DC可增强同源CIK细胞的增殖活性和抗淋巴瘤效应。因脐血来源丰富,且输注不易引起严重的移植物排斥反应,其DC—CIK细胞在免疫治疗方面应有更广泛的临床应用前景。     

负载卵巢癌冻融抗原对树突状细胞分泌细胞因子的影响

目的探讨负载卵巢癌冻融抗原对树突状细胞分泌细胞因子的影响。方法采用反复冻融法获得卵巢癌细胞株SKOV3细胞抗原,联合应用重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、重组人白细胞介素-4和重组人肿瘤坏死因子-α,体外诱导人外周血CD14^＋单核细胞为成熟DCs并负载卵巢癌肿瘤抗原;采用ELISA法检测培养细胞上清液中分泌IL-12p70、IFN-γ和IL-10含量,评价非成熟DCs和成熟DCs以及肿瘤抗原负载DCs和未负载肿瘤抗原DCs激活的CTL分泌细胞因子的能力。结果联合应用重组人的GM-CSF、IL-4和TNF-α可在体外诱导出成熟DCs;经ELISA方法检测,不同状态下的DCs分泌IL-12p70、IFN-γ的量不同,成熟DCs较非成熟DCs有更强的分泌IL-12p70、IFN-γ的能力（P〈0.05）,负载抗原DCs激活的CTL较未负载抗原DCs激活的CTL有更强的分泌IL-12p70[（182.89±4.57）pg/ml和（99.76±5.42）pg/ml,P〈0.01]和IFN-γ的能力[（102.11±5.95）pg/ml和（68.29±5.04）pg/ml,P〈0.01]。而成熟DCs分泌IL-10的能力与非成熟DCs相比,差异无统计学意义（P〉0.05）。负载抗原后DCs激活的CTL与未负载抗原DCs激活CTL上清液中IL-10的浓度相比,两者之间的差异无统计学意义（P〉0.05）。结论细胞因子的分泌量受DCs的成熟状态及某些刺激信号的影响,卵巢癌冻融抗原是其刺激信号之一。     

肿瘤细胞裂解物致敏的树突状细胞对肝癌HepG2细胞杀伤的体外研究

目的：探讨肿瘤细胞裂解物致敏的树突状细胞（DC）作为佐剂对肝癌HepG2细胞系的杀伤作用。方法：反复冻融法裂解培养的肝癌HepG2细胞提取细胞抗原,然后致敏Dc,观察后者对自身T淋巴细胞增殖的影响以及T细胞对HepG2细胞的杀伤作用。结果：肝癌HepG2细胞裂解物致敏的DC能显著促进T细胞的增殖。后者对细胞有明显的杀伤效应。结论：肿瘤细胞裂解物提取方法简单,其作为细胞抗原致敏DC制备的肿瘤疫苗能保证抗肿瘤免疫反应的全面性和有效性,并降低可能出现的肿瘤免疫耐受,将有很好的临床应用前景。     

重组腺病毒AdmIL-12对树突状细胞的基因转染

目的：应用重组腺病毒AdmIL-12转染树突状细胞（DC）制备DC疫苗。方法：以重组腺病毒AdmIL-12转染DC后,用流式细胞仪检测DC的表型,用RT-PCR检测IL-12在DC内的表达,用EILSA法测定细胞培养上清液中的mIL-12和mIFN-γ的含量。通过IL-12刺激T细胞分泌IFN-γ的能力以检测DC分泌的IL-12的生物活性。结果：重组腺病毒AdmIL-12能高效转染DC,转染后DC的表型无显著改变,转染DC能大量分泌具有生物活性的IL-12。结论：腺病毒AdmIL-12成功转染DC,获得有效的DC疫苗。     

冻融人脐血树突状细胞疫苗的抗肝癌活性

目的：观察人肝癌裂解抗原致敏的冻融人脐血树突状细胞(dendriti cells,DC)诱导的CTL抗肝癌活性,并观察与细胞因子联用的效应。方法：应用CD34^+干细胞试剂盒和免疫磁珠标记法分选人脐血CD34^+干细胞,细胞因子扩增培养为成熟DC,液氮冻存;人肝癌裂解抗原致敏冻融DC制备疫苗,进行DC疫苗及其与细胞因子联用的体外抗肿瘤实验,MTT检测各自诱导的CTL活性,并作统计学处理。结果：肝癌抗原致敏的人脐血冻融DC疫苗能诱导高效的CTL活性(P＜0．01),与新鲜DC疫苗差异无显著意义(P＞0．05)。冻融DC疫苗与1μg／mL GM-CSF联用,或与500U／mL TNF-a联用,诱导的CTL活性均明显增高(P＜0．05)。结论：肝癌抗原致敏的人脐血冻融DC疫苗能诱导具有高度针对靶细胞的特异性CTL活性,与细胞因子联用有一定的协同作用。     

用抗原特异性树突状细胞激活的淋巴细胞治疗复发难治性非霍奇金淋巴瘤

本研究探讨负载自身肿瘤裂解物的树突状细胞(dendritic cells,DC)与细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killers,CIK)共培养后,治疗复发难治性非霍奇金淋巴瘤患者的临床免疫学疗效、毒副反应。选择9例复发难治性非霍奇金氏淋巴瘤患者,分离外周血单个核细胞,贴壁细胞体外经GM-CSF和IL-4诱导产生DC,并负载自体肿瘤细胞裂解物,悬浮淋巴细胞经IFN-γ、IL-2、抗CD3单克隆抗体、IL-1α体外诱导产生CIK细胞。7天后将负载抗原的DC与CIK共培养,12天后回输体内。利用流式细胞术、T淋巴细胞核仁形成区嗜银蛋白(Ag-NORs)的检测及ELISA双抗夹心法检测过继免疫生物治疗前后各项免疫指标的变化,并观察临床疗效。结果表明:经细胞治疗后患者外周淋巴细胞Ag-NOR的IS值明显增高,呈上升趋势;CIK细胞培养后可见CD3+CD8+和CD3+CD56+细胞较培养前显著增加(p0.01),负载肿瘤抗原的DC致敏后CD3+CD8+和CD3+CD56+的表达较之单纯的CIK进一步明显提高(p0.01);将负载自身肿瘤抗原的DC与CIK共培养后,上清液中IFN-γ、IL-12的水平显著高于单独CIK对照组(p0.05)。5例患者通过影像学复查显示肿瘤较治疗前明显缩小;除一过性发热、畏寒外未见其它不良反应。结论:负载自身抗原的DC-CIK细胞的具有特异性杀伤淋巴瘤细胞的能力;外周淋巴细胞Ag-NOR的IS值明显增高,分泌细胞因子水平高于单纯CIK细胞,临床治疗效果令人满意。     

细胞因子体外诱导慢性髓细胞性白血病树突状细胞分化的研究

本研究探讨干扰素（IFN）治疗慢性粒细胞性白血病（CML）的可能新机制，为临床治疗CML提供新的思路。用Ficoll密度离心法分离骨髓单个核细胞（BMMNC），用不同细胞因子组合体外诱导培养树突状细胞（DC），在倒置显微镜及光镜下观察DC形态，应用流式细胞术检测其表面标志（CD1a，CD83，CD86，HIA-ABC，HIA-DR，CD54）。MTT法检测其混合淋巴细胞反应（MLR）能力。结果表明：经不同细胞因子组合所诱导出的DC，其特征性表面分子表达率均高于培养前的DC（P〈0．01）；IFN-α＋GM-CSF组DC表达HLA—ABC、HLA-DR明显高于IL-4＋GM-CSF培养组（P〈0．05）；而IFN-α＋GM-CSF4-IL-4组DC的CD86表达率及MLR水平均高于其它细胞因子组合组（P〈0．05）。干扰素耐药组DC表面分子表达率及MLR水平较新诊断组和干扰素治疗有效组均明显减低（P〈0．05），但A、B、C各组的CD86表达率及MLR水平在IFN-α＋GM-CSF4-IL-4因子组合条件下无明显差异。结论：CML骨髓单个核细胞在含有IFN-α的细胞因子组合条件下可分化为具有形态和免疫表型特征的DC，且表达较高的Ⅰ类和Ⅱ类分子、共刺激分子、黏附分子及MLR，表明干扰素治疗CML的机理可能与DC有关，这一结果提示通过增强内源性DC功能可能提高CML临床疗效。     

非致死剂量高强度聚焦超声逆转K562／AO2细胞多药耐药的实验研究

目的探讨非致死剂量高强度聚焦超声（HIFU）逆转K562／AO2细胞多药耐药（MDR）的效能及其作用机制。方法（1）固定辐照时间或超声声强，应用不同声强或辐照时间的HIFU辐照K562、K562／AO2细胞株，观察HIFU的剂量-效应关系；（2）将K562／AO2细胞株分组为：阿霉素组（ADM组）、ADM加HIFU辐照组（HIFU组）、ADM加维拉帕米组（VRP组），分别观察各组细胞内的ADM浓度、细胞的抑制率和细胞凋亡情况；（3）检测HIFU干预前后K562／A02细胞的P—gP、PDCD5表达情况。结果（1）当辐照时间一定时（5s）声强越高肿瘤细胞存活率越低，当HIFU声强一定时（400w／cm^2）细胞存活率随HIFU辐照时间延长而下降；（2）在K562／AO2细胞株中HIFU、VRP干预均能提高细胞内ADM浓度，HIFU组、VRP组与ADM组比较P均〈0．01，HIFU组与VRP组比较P〉0．05；HIFU组、VRP组、ADM组均能抑制K562／AO2细胞的增殖和促使K562／AO2细胞发生凋亡。HIFU组、VRP组与ADM组比较P均〈0．01，HIFU组与VRP组比较P〉0．05；（3）HIFU辐照K562／AO2细胞后P—gP表达明显降低，PDCD5表达升高。结论非致死剂量HIFU辐照K562／AO2细胞能够提高耐药肿瘤细胞内的化疗药物浓度，增加耐药肿瘤细胞的抑制率和凋亡率。非致死剂量HIFU逆转MDR的可能机理是下调耐药细胞的P—gP表达和上调PDCD5表达。     

肿瘤细胞裂解物致敏树突状细胞对小鼠乳腺癌作用的研究

目的观察肿瘤细胞裂解物致敏树突状细胞 (DC)对小鼠乳腺癌的治疗作用。方法无菌取小鼠骨髓细胞 ,在体外培养条件下经细胞因子作用诱导为树突状细胞 (DC) ,用EMT6肿瘤抗原裂解物冲击致敏DC细胞 ,检测DC体外刺激活化淋巴细胞作用 ,以及经DC免疫产生的细胞毒T淋巴细胞 (CTL)体外杀伤肿瘤细胞的活性 ,观察致敏DC免疫对小鼠乳腺癌模型的治疗作用。结果镜下可见抗原致敏后的DC可吸引淋巴细胞聚集成团 ;致敏DC诱导生成的特异性CTL在体外对肿瘤细胞可产生杀伤作用 (与PBS对照组比较 ,P =0 .0 2 7) ,而未成熟DC细胞组和肿瘤抗原组与PBS对照组间无显著性差异 (P =0 .17,P =0 .0 72 ) ;经致敏DC注射免疫后 ,小鼠负荷肿瘤得到抑制 (与PBS对照组比较 ,P =0 .0 3 5 ) ,而单纯肿瘤抗原及未致敏DC免疫组与PBS对照组间无显著性差异 (P =0 .2 6,P =0 .11)。结论肿瘤抗原裂解物致敏的DC可有效递呈抗原并诱导淋巴细胞杀伤肿瘤细胞。     

IFN-γ通过PKA-CREB通路影响结肠癌细胞IL-33表达

目的探讨IFN-γ对诱导结肠癌细胞系CT26中IL-33表达的影响。方法分别用IFN-γ、IFN-γ联合PKA抑制剂H89处理CT26细胞(分别设为IFN-γ组和IFN-γ+H89组),同时设置阴性对照组(NC);实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测CT26细胞中PKA、CREB和IL-33 mRNA表达;western blot检测CT26细胞中PKA、CREB、p-CREB和IL-33蛋白的表达;免疫荧光共聚焦试验检测CREB蛋白在CT26细胞中的定位。结果 IFN-γ组细胞中PKA、CREB和IL-33 mRNA相对表达量分别为2.50±0.11、3.10±0.08和2.80±0.22,均明显高于NC组(P均0.05); IFN-γ+H89组PKA、CREB和IL-33 mRNA相对表达量分别为0.21±0.02、0.59±0.05和0.35±0.04,均明显低于NC组和IFN-γ组(P均0.05)。western blot检测PKA、CREB、IL-33蛋白的表达水平与mRNA的表达结果均一致。免疫荧光共聚焦检测结果显示,IFN-γ组CREB的表达较NC组增加;与IFN-γ组相比,IFN-γ+H89组CREB的表达减少(P均0.05)。结论 IFN-γ通过PKA-CREB通路诱导结肠癌CT26细胞表达IL-33。     

抑制VEGF表达对白血病来源树突状细胞免疫功能的影响

目的：探讨抑制血管内皮生长因子（VEGF）对白血病来源树突状细胞（Dc）免疫功能的影响。方法：利用反义寡核苷酸下调K562白血病细胞VEGF表达，K562细胞经细胞因子作用诱生白血病DC。利用MTT法检测DC刺激正常外周血T细胞增殖的能力及DC激发的细胞毒T淋巴细胞（CTL）杀伤活性；ELISA法检测DC培养上清液中IL-12及DC与外周血单个核细胞（PBMNC）共同培养液中IFN-γ的含量。结果：K562细胞经5μmol／LVEGF反义寡核苷酸处理24h后VEGF蛋白分泌下降59％，其诱生的DC与正常K562来源的DC相比，实验组DC刺激T淋巴细胞增殖能力、CTL杀伤活性以及DC分泌IL-12和协同刺激外周血单个核细胞分泌TNF-γ的能力明显增强。结论：抑制VEGF表达可促进白血病来源DC免疫功能的成熟。