缺失HPI毒力岛的EAggEC O42突变菌株的构建及鉴定

目的构建并鉴定HPI毒力岛缺失的EAggEC突变株.方法运用基因重组方法，以irp8基因部分序列作为同源重组的一侧序列，irp5基因序列作为同源重组的另一侧序列，中间插入有卡那霉素（Km）抗性基因（kan）标记。以pCVD442作为载体，构建含有irp8部分序列和irp5基因的重组自杀质粒pC085。以EAggEC O42为出发菌株．构建缺失irp8-irp5约24kb的HPI毒力岛功能卡受心区区域的全岛缺失侏EAG85．结果通过接合转移和同源重组．利用蔗糖抗性筛选，pC085上的同源序列有效的置换rEAggEC O42的irp8和irp5基凶。PCR方法扩增irp3、ybtA、irp9等基因的结果显示，筛选出的EAG85确为缺失HPI毒力岛基闪的EAggEC菌株结论成功地构建了缺失HPI毒力岛的EAggEC O42突变菌株．为进一步阐明HPI毒力岛存EAggEC菌株中的功能建立了重要的物质基础。     

缺失HPI毒力岛的EAggEC O42突变菌株的构建及鉴定

目的 构建并鉴定HPI毒力岛缺失的EAggEC突变株。方法 运用基因重组方法,以irp8基因部分序列作为同源重组的一侧序列,irp5基因序列作为同源重组的另一侧序列,中间插入有卡那霉素(Km)抗性基因(kan)标记。以pCVD442作为载体,构建含有irp8部分序列和irp5基因的重组自杀质粒pCO85。以EAggECO42为出发菌株,构建缺失irp8～irp5约24kb的HPI毒力岛功能核心区区域的全岛缺失株EAG85。结果 通过接合转移和同源重组,利用蔗糖抗性筛选,pCO85上的同源序列有效的置换了EAggECO42的irp8和irp5基因。PCR方法扩增irp3、ybtA、irp9等基因的结果显示,筛选出的EAG85确为缺失HPI毒力岛基因的EAggEC菌株。结论 成功地构建了缺失HPI毒力岛的EAggECO42突变菌株,为进一步阐明HPI毒力岛在EAggEC菌株中的功能建立了重要的物质基础。     

三种细菌HPI核心区ybtE基因核苷酸序列及推导氨基酸序列的比较研究

目的比较三种肠聚集性大肠埃希菌、小肠结肠炎耶尔森菌和鼠疫耶尔森菌HPI毒力岛核心区ybtE基因的同源性。方法PCR扩增肠聚集性大肠埃希菌(EAEC)17-2ybtE基因的完整序列,克隆后测序。用ABIPRISM软件对该ybtE基因序列与已知的鼠疫耶尔森菌HPI的ybtE基因以及小肠结肠炎耶尔森菌HPI的irp5基因进行核苷酸序列和推导氨基酸序列比较。结果核苷酸序列,EAEC17-2与鼠疫耶尔森菌及小肠结肠炎耶尔森菌之间的同源性分别为99.8%和98.2%,鼠疫耶尔森菌与小肠结肠炎耶尔森菌之间的同源性为98.2%;推导氨基酸序列,EAEC17-2与鼠疫耶尔森菌及小肠结肠炎耶尔森菌之间的同源性分别为99.8%和97.6%,鼠疫耶尔森菌与小肠结肠炎耶尔森菌之间的同源性为97.8%。结论ybtE基因作为HPI的功能基因高度保守,EAEC中的HPI可能来源于YpsHPI。     

PCR检测ETEC中的irp1基因

目的：探讨高致病岛（High Pathogenility Island,HPI)的irp1基因在ETEC菌株中的分布状况。方法：利用小肠结肠耶尔森菌HPI的irp1基因,设计合成引物,对ETEC菌株进行PCR（多聚酶链反应）检测。结果：94株ETEC菌中有10株呈现阳性。结论：HPI的irp1基因在小肠结肠炎耶尔森菌与ETEC（肠致病性大肠杆菌）之间存在着基因的水平转移,但其转移机制如何及转移过程有待于进一步研究。     

国内首次发现携带耶尔森菌HPI毒力岛irp-2基因的阴沟肠杆菌

目的 研究感染性腹泻患者粪便中分离的阴沟肠杆菌携带的小肠结肠炎耶尔森菌HPI毒力岛irp-2基因,并评价其菌株的毒力和耐药情况.方法 PCR扩增法检测毒力岛irp-2基因,小白鼠腹腔注射法检测毒力,药敏试验采用K-B纸片扩散法.结果 从感染性腹泻患者粪便中分离的9株阴沟肠杆菌均扩增出irp-2基因片段,其相对分子量与对照菌株小肠结肠炎耶尔森菌WA株(O8型)的相应PCR片段一致,并具有较强的毒力.结论 检出的阴沟肠杆菌含有小肠结肠炎耶尔森菌HPI毒力岛irp-2基因且为具有毒力的菌株,与致病性密切相关.     

国内首次发现携带耶尔森菌HPI毒力岛rip^-2也基因的阴沟肠杆菌

目的研究感染性腹泻患者粪便中分离的阴沟肠杆菌携带的小肠结肠炎耶尔森菌HPI毒力岛irp-^2基因，并评价其菌株的毒力和耐药情况。方法PCR扩增法检测毒力岛irp^-2基因，小白鼠腹腔注射法捡测毒力，药敏试验采用K—B纸片扩散法。结果从感染性腹泻患者粪便中分离的9株阴沟肠杆菌均扩增出irp^-2基因片段，其相对分子量与对照菌株小肠结肠炎耶尔森菌WA株（08型）的相应PCR片段一致，并具有较强的毒力。结论检出的阴沟肠杆菌含有小肠结肠炎耶尔森菌HPI毒力岛irp^-2基因且为具有毒力的菌株，与致病性密切相关。     

产毒性和致病性大肠杆菌中小肠结肠炎耶尔森菌强毒力岛的检测

目的 了解小肠结肠炎耶尔森菌强毒力岛在产毒性和致病性大肠杆菌中的分布，探讨毒力岛在大肠杆菌中的结构和功能。方法 对毒力岛的关键基因irp2,fyua和asn-intB进行PCR扩增和DNA测序，并对irp2和fyua进行原位杂交。结果 在检测的93株肠产毒性大肠杆菌的10株肠致病性大肠杆菌基因irp2的检出率分别为32.25%(30/93)和30%（3/10),fyua的阳性率为21.51%(20/93)和30%（3/10）。而且这些阳性菌株中的毒力岛大部分连接到天门冬氨酸tRNA(asntRNA）位点。结论 小肠结肠炎耶尔森菌强毒力岛在产毒性和致病性大肠肝菌中较高的阳性率，对于大肠杆菌毒力的变化和毒力的调控以及细菌毒力的进化可能具有重要意义。     

产毒性和致病性大肠杆菌中小肠结肠炎耶尔森菌强毒力岛的检测

目的　了解小肠结肠炎耶尔森菌强毒力岛在产毒性和致病性大肠杆菌中的分布,探讨毒力岛在大肠杆菌中的结构和功能。方法　对毒力岛的关键基因irp2、fyua和asn-intB进行PCR扩增和DNA测序,并对irp2和fyua进行原位杂交。结果　在检测的93株肠产毒性大肠杆菌和10株肠致病性大肠杆菌基因irp2的检出率分别为32.25％（30/93）和30％（3/10）,fyua的阳性率为21.51％（20/93）和30％（3/10）,而且这些阳性菌株中的毒力岛大部分连接到天门冬氨酸tRNA（asn tRNA）位点。结论　小肠结肠炎耶尔森菌强毒力岛在产毒性和致病性大肠杆菌中较高的阳性率,对于大肠杆菌毒力的变化和毒力的调控以及细菌毒力的进化可能具有重要意义。     

利用环介导等温扩增技术检测鼠肠中的致病性小肠结肠炎耶尔森菌

目的利用环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification method,LAMP)检测鼠肠中致病性小肠结肠炎耶尔森菌,为基层现场检验工作提供依据。方法利用PCR法检测致病性小肠结肠炎耶尔森菌的ail毒力基因;根据致病性小肠结肠炎耶尔森菌的ail毒力基因设计4条环状引物,并应用LAMP技术对样本进行检测;利用生化鉴定验证实验的准确性。结果 PCR法共检出10株菌具有ail毒力基因; LAMP技术检测出10株菌结果阳性;生化鉴定有114株小肠结肠炎耶尔森菌,其中10株为O∶3或O∶9血清(为致病株)。结论 LAMP技术可以应用于小肠结肠炎耶尔森菌的检测,与PCR等传统方法检测结果高度吻合;此法可用于接受过培训的基层开展工作。     

产毒性大肠杆菌（ETEC）中毒力岛分布的研究

目的 了解小肠结肠炎耶尔森菌强毒力岛在产毒性大肠杆菌中的分布,以便于进一步深入研究毒力岛在大肠杆菌中的结构的完整性和功能。方法 PCR扩增和原位杂交及基因序列分析,结果 在检测的93株产毒性大肠杆菌（ETEC）的毒力岛的检出率为32.25%(32/93),而且这些阳性菌株中的毒力岛大部分连接到asntRNA(天门冬氨酸tRNA0位点。结论 产毒性大肠杆菌是致病性较强的病原菌之一,而小肠结肠炎耶尔森菌强毒力岛在产毒性大肠杆菌中阳性率较高的分布。对于进一步研究产毒性大肠杆菌的毒力的变化和毒力的调控以及细菌毒力的进化具有重要意义。     

佛山市食品中致泻大肠埃希菌菌型分布及毒力研究

目的 了解佛山市食品中致泻大肠埃希氏菌的菌型分布及毒力携带情况。方法采集佛山市十类食品362件中分离的17株致泻大肠埃希氏菌。按GB4789．6-94国家卫生标准检验方法进行血清分型；用ELISA检测耐热肠毒素(ST)和不耐热肠毒素(LT)；毒力测定采用小鼠致病力试验和采用irp2和irpB基因探针菌落原位杂交检测ES-IEC菌株毒力岛。结果 菌型分布在三类11个型别上，其中EPEC占41．17％(7／17)，EIEC为35．29％(6／17)。ESIEC为23．53％(4／17)；17株致泻大肠埃希氏菌在七类食品中均有存在。对小鼠致病力试验均为阳性；耐热肠毒素(ST)和不耐热肠毒素(LT)均为阴性，其中4株ESIEC中1株携带耶尔森氏菌强毒力岛(HPI)。结论佛山市食品中污染致泻大肠埃希氏菌普遍，对小鼠致病力与耐热和不耐热肠毒素无必然联系；有携带耶尔森氏菌HPI的ESIEC存在。应引起足够重视。     

携带小肠结肠炎耶尔森菌HPI毒力岛大肠杆菌的毒力基因分析

目的探索HPI毒力岛阳性大肠杆菌的毒力基因存在情况。方法使用PER和杂交技术对152株HPI毒力岛阳性的大肠杆菌进行相关毒力基因检测。结果在152株携带HPI毒力岛的大肠杆菌中，基本上未栓出常见的5类致泻性大肠杆菌的毒力基因，但是部分菌株检出泌尿道致病性大肠杆菌PAI毒力岛基因yc73和prrA以及RTX毒力岛基因rtx615。结论这些大肠杆菌和已知的致泻性大肠杆菌有明显不同，携带HPI毒力岛的大肠杆菌可能包括几个不同的群，可能存在其它的尚未发现的毒力因子，有必要继续进行进一步研究。     

弓形虫膜抗原SAG3基因打靶载体构建方法探讨

目的 探讨构建弓形虫膜抗原SAG3基因打靶载体的方法，为建立基因敲除弓形虫基因突变株打下基础。方法 用PCR方法扩增弓形虫SAG3基因同源序列，将所获得的1．53kb和2．81kb序列连接克隆插入TUB5／CAT质粒中，构建置换型打靶载体，采用PCR扩增、酶切分析鉴定。结果 将SAG3基因中1．53kb和2．81kb两个同源序列分别插入TUB5／CAT质粒中，构建了弓形虫RH株5’SAG3-TUB5／CAT-3’SAG3置换型载体，经鉴定所获得的打靶载体结构准确。结论 建立了弓形虫膜抗原SAG3基因打靶载体，并获得了弓形虫RH株SAG3基因置换型打靶载体，为分析弓形虫基因功能提供了可行的方法。