IL-4诱导THP-1细胞表达DC-SIGN的信号通路调节研究

目的 研究IL-4诱导THP-1细胞表达DC-SIGN的信号调节通路,探索DC -SIGN表达的信号调控网络.方法 以佛波脂(PMA)刺激THP-1细胞24h后加入IL-4作用48 h诱导DC-SIGN的表达,并设ERK阻断剂、NF-κB阻断剂、JAK-STAT阻断剂和MAPK阻断剂处理组.用RT-PCR检测DC-SIGN的mRNA表达,Western blot检测胞质内DC-SIGN蛋白的表达,流式细胞术检测细胞表面DC-SIGN的表达.另外,提取IL-4诱导0、10、20、30、60和120 min的THP-1细胞胞质和胞核蛋白,Western blot检测不同信号通路的信号蛋白及其磷酸化蛋白的变化.结果 IL-4可以大幅提高DC-SIGN在THP-1细胞上的表达,包括mRNA和胞膜蛋白水平.在mRNA、胞质和细胞表面蛋白表达3个水平上,ERK通路阻断剂阻断效果最好,几乎完全阻断了IL-4的诱导效果,JAK-STAT和NF-κB通路阻断剂具有部分阻断效果,而p38通路阻断剂无阻断效果.信号蛋白检测结果显示,IL-4诱导0～120 min内,胞质磷酸化ERK1/2、磷酸化STAT6以及NF-κBp65、NF-κBp50、磷酸化IKB和磷酸化AKT随时间推移浓度逐渐升高,而p38MAPK及其磷酸化蛋白浓度无明显改变.胞核内胞质磷酸化ERK1/2、磷酸化STAT6以及NF-κBp65和NF-κBp50随时间推移浓度逐渐升高.结论 ERK、JAK-STAT和NF-κB通路参与了DC-SIGN启动子的活化,其中以ERK通路为主.     

金黄葡萄球菌杀白细胞素(PVL)对THP-1巨噬细胞IL-8、IL-6表达的影响

目的 研究金黄葡萄球菌杀白细胞素( panton-valentine leucocidin,PVL)对THP-1巨噬细胞Toll样受体4(TLR4)/核因子κB(NF-κB)信号通路及IL-8、IL-6的表达影响,探讨PVL相关肺组织损伤的致病机制.方法 实验前用100nmol/L佛波酯(PMA)孵育THP-1细胞48...     

β-胡萝卜素对脂多糖刺激巨噬细胞RAW264.7炎症因子的影响及其机制

目的:探讨β-胡萝卜素对脂多糖(LPS)刺激巨噬细胞RAW264.7炎症因子的影响及其机制。方法:采用5μg/ml的LPS刺激巨噬细胞24 h后用不同浓度的β-胡萝卜素(20、40、80、160μmol/L)处理细胞3 h,MTT法测细胞活性,荧光定量PCR测炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA相对表达量,ELISA测炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌量,Western blot测NF-κB p65蛋白相对表达量。5μg/ml的LPS和不同浓度的NF-κB抑制剂PDTC(1、5、10μg/ml)共同处理巨噬细胞24 h,Western blot测NF-κB p65蛋白相对表达量,荧光定量PCR、ELISA测炎症因子的表达和分泌。比较LPS+PDTC组和LPS+PDTC+β-胡萝卜素组炎症因子和NF-κB p65蛋白相对表达的变化。结果:与LPS组相比,不同浓度的β-胡萝卜素对LPS刺激的巨噬细胞的细胞活性有提升作用,对炎症因子和NF-κB p65蛋白的表达有抑制作用;抑制NF-κB蛋白的表达可以抑制LPS刺激的巨噬细胞炎症因子的分泌;LPS+PDTC+β-胡萝卜素组对炎症因子的抑制作用比LPS+PDTC组明显,且差异显著(P0.05),但两组对NF-κB p65蛋白的表达不明显。结论:β-胡萝卜素可以通过抑制NF-κB通路中NF-κB p65蛋白的表达抑制LPS刺激的巨噬细胞炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌,且此通路不是唯一相关的通路。     

熊果酸减轻LPS诱导的THP-1细胞损伤

目的探讨熊果酸减轻脂多糖诱导的THP-1细胞损伤的作用及其机制。方法以脂多糖诱导的THP-1炎性细胞为模型,MTT法检测不同浓度的熊果酸(0.1、1、5、10、20、40和80μmol/L)对细胞增殖的影响,RT-PCR法检测TLR4、MCP-1和IL-6 mRNA的表达,ELISA法检测MCP-1和IL-6表达,Western blot法检测P65、磷酸化P65蛋白表达,荧光素酶报告系统检测核转录因子κB(NF-κB)活性。结果与对照组比较,LPS作用组能显著增高MCP-1、TLR4、IL-6 mRNA和MCP-1、IL-6、P65、磷酸化P65蛋白的表达并上调NF-κB活性(P0.05);与LPS单独作用组比较,熊果酸(1和5μmol/L)干预组能够显著降低MCP-1、TLR4、IL-6mRNA和MCP-1、IL-6表达水平并下调NF-κB活性(P0.05)。结论熊果酸可能是通过下调NF-κB活化减轻脂多糖诱导的THP-1细胞的损伤。     

没食子酸通过拮抗脂多糖诱导的TLR4/NF-κB活化抑制RAW264.7巨噬细胞炎性反应

目的观察没食子酸对脂多糖(LPS)诱导RAW264.7巨噬细胞Toll样受体4/核因子κB(TLR4/NF-κB)通路的影响。方法将巨噬细胞分为空白对照组、LPS组、LPS联合没食子酸组、LPS联合NF-κB抑制剂吡咯二硫代甲酸(PDTC)组和LPS联合地塞米松(DM)组。处理后的细胞培养24 h,ELISA检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1(IL-1)、IL-6水平,实时定量PCR检测TLR4、NF-κB mNRA水平,Western blot法检测p65、p-p65、TLR4、磷酸化的NF-κB抑制蛋白α(IκBα)的蛋白表达水平。结果 LPS诱导RAW264.7巨噬细胞后TNF-α、IL-1、IL-6水平升高,没食子酸可降低LPS诱导引起的TNF-α、IL-1和IL-6表达水平升高。LPS刺激后TLR4 mRNA及蛋白表达增加,NF-κB活化,没食子酸可拮抗以上作用,阻止NF-κB活化。结论没食子酸可通过TLR4/NF-κB通路抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎性反应。     

脂多糖对肺微血管内皮细胞IL-8表达的影响及其调控机理

目的探讨脂多糖(LPS)的直接诱导作用对肺微血管内皮细胞(PMVEC)IL-8表达的影响及通过核因子κB(NF-κB)的调控机理。方法肺微血管内皮(PMVEC)细胞生长至80 %以上融合度时用于实验。加入LPS以100ng/ml浓度刺激细胞分别至0、0.5、1、2、4、6、8h ,或LPS分别以1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml刺激细胞至1h或6h为检测时相点 ,每组6个标本。至预定时相点离心收集培养液上清 ,行IL -8ELISA检。用原位杂交试验检测培养液上清中分泌的IL -8及PMVEC内IL-8mRNA的表达 ;凝胶电泳迁移率分析 (EMSA)检测NF-κB的活化 ,以积分灰度值表示NF-κB的活性变化。观察NF -κB活化抑制 (PDTC)对IL-8表达的影响。结果LPS能显著促进PMVEC表达IL -8,随刺激时间延长IL -8水平逐渐升高 ,与0h相组比 ,100ng/mlLPS刺激后从2小时开始即有明显上升 (P<0.05) ,8h达到峰值 ,为5.86±0.68ng/ml(P<0.01)。与对照组比 ,1ng/mlLPS刺激6h即能显著诱导IL-8的表达(P<0.05) ,10ng/ml、100ng/ml的诱导作用非常显著(P<0.01) ,随着LPS浓度的增加而增加。LPS刺激后能明显地诱导IL -8mRNA的表达。100ng/mlLPS刺激后从1h开始即在胞浆中显示IL-8mRNA的强阳性表达 ,随作用时间延长 ,IL-8mRNA表达增加。至6h达到高峰 ,8hIL -8mRNA表达略有下降。同时显示IL -8mRN     

NF-κB信号通路蛋白和细胞因子在金黄色葡萄球菌PV杀白细胞素相关肺炎症性损伤中的作用

目的 探讨NF-κB信号通路蛋白和细胞因子在金黄色葡萄球菌PV杀白细胞毒素(PVL)介导的肺炎症性损伤中的变化和作用.方法 取30只新西兰大白兔随机分为2组,每组各15只.rPVL组用重组PVL灌入,正常对照组使用PBS灌人.造模后,于3、6、9h处死兔,每个时间段5只,取肺组织做病理学检查;ELISA方法检测肺组织匀浆IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α蛋白含量;免疫组织化学染色检测肺组织中NF-κB p65蛋白.结果 rPVL组兔肺组织病理检查显示有弥漫性炎性细胞浸润、出血、水肿等肺损伤表现;肺组织匀浆中IL-6、IL-8、TNF-α含量随感染时间延长逐渐升高,IL-10含量于9h开始升高;NF-κB p65蛋白活化强度随感染时间延长逐渐增强.结论 NF-κB信号通路蛋白激活及细胞因子大量释放是PVL相关肺损伤重要的发病机制之一,下调肺内NF-κB激活细胞数量有望成为治疗PVL相关肺损伤的途径.     

NF-κB在抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物诱导THP-1细胞表达组织因子中的作用探讨

目的:探讨核因子κB(NF-κB)在抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物诱导单核细胞株THP-1表达组织因子(TF)中的作用。方法:使用一定剂量的抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物处理THP-1细胞一定时间,收集细胞总RNA和总蛋白,实时定量PCR(RT-qPCR)检测细胞TF mRNA水平,TF活性试剂盒检测TF活性;Western blot检测细胞NF-κB p65、磷酸化-NF-κB p65及NF-κB抑制蛋白IκB-α的表达情况;进一步采用NF-κB抑制剂(PDTC)观察是否能干预抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物对细胞的刺激效应,并利用上游信号分子MAPKs的抑制剂观察抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物对NF-κB p65磷酸化的影响。结果:抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物(100μg/ml)能够诱导THP-1细胞表达TF mRNA及活性,与对照相比差异显著(P<0.05);能够增强细胞内NF-κB p65磷酸化(P<0.05 vs media),降低IκB-α水平(P<0.05 vs media);NF-κB抑制剂PDTC(20μmol/L)能够抑制抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物(100μg/ml)诱导THP-1细胞表达TF及NF-κB磷酸化的效应;MAPKs抑制剂均能影响抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物(100μg/ml)诱导THP-1细胞NF-κB p65磷酸化。结论:在抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物诱导THP-1细胞表达TF过程中,NF-κB被激活并发挥重要作用,MAPKs为NF-κB的关键上游分子。     

同型半胱氨酸对单核细胞NF-κB活化及巨噬细胞炎性蛋白-1α表达的影响

目的　探讨同型半胱氨酸对体外培养的人单核细胞株THP -1核因子-κB(NF -κB)、抑制因子(IκB- α)活性的影响及其与巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP- 1α)表达上调的关系。方法　THP -1单核细胞分别用同型半胱氨酸和NF- κB抑制剂PDTC预处理后,应用Northernblot和流式细胞术分别检测MIP- 1αmRNA和蛋白的表达,并应用Western蛋白印迹进一步检测核蛋白NF -κB蛋白含量和胞质IκB -α含量。结果　与未加任何处理因素的对照组比较,MIP- 1αmRNA和蛋白在0. 1mmol/L同型半胱氨酸处理后明显增加,分别为对照组的3 .69倍和1 .16倍(P<0 .01),同时NF κBP65亚基核转位亦增加。而加入100μmol/LNF κB抑制剂PDTC预处理30min后,再用同样浓度的同型半胱氨酸刺激,则MIP -1αmRNA和蛋白表达受到明显的抑制,NF- κBP65核转位增加。单独加入PDTC对MIP -1αmRNA、蛋白表达及NF -κBP65核转位无明显影响。此外,同型半胱氨酸( 0 .1mmol/L)处理THP- 1可引起IκB -α蛋白水平显著降低, 120min后有所回升。结论　同型半胱氨酸在病理浓度可促进NF -κB活化,发生核转位,进而促进THP -1细胞表达MIP 1αmRNA和蛋白,这种作用与IκB -α蛋白磷酸化降解有关。     

核因子-κB 激活与一氧化氮合酶 mRNA 表达在重症急性胰腺炎肺损伤中的作用

目的:探讨重症急性胰腺炎(SAP)大鼠肺组织核因子-κB(NF-κB)活化及诱导型一氧化氮合酶 mRNA 表达与肺损伤的关系.方法:SD 大鼠随机分为对照组、SAP 组、二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)预处理组.建立各组模型后取肺组织行病理学观察,免疫组织化学法观察 NF-κB 的表达,实时荧光定量 PCR 法检测 iNOS mRNA 表达.结果:对照组仅极少量NF-κB 活化,iNOS mRNA 呈低水平表达.SAP 组NF-κB 出表达明显增加,并呈动态变化,6 h达高峰,主要表达于中性粒细胞、单核/巨噬细胞、支气管黏膜七皮细胞、肺泡上皮细胞的胞质和胞核内,iNOS mRNA 表达明显上调.PDTC 预处理组NF-κB 表达明显减少,iNOS mRNA 表达亦下调,但仍高于对照组.结论:SAP 时肺组织NF-κB 活化并通过调控 iNOS mRNA 的表达参与肺损伤.PDTC 可能通过抑制 NF-κB 出活性进而下调 iNOS mRNA 的表达,减轻肺损伤.     

NO供体V-PYRRO/NO抑制大鼠肝脏I/R损伤早期LTC4S基因表达

目的探讨肝脏特异性NO供体V-PYRRO/NO对肝脏缺血再灌注(I/R)早期白三烯C4合酶(LTC4S)基因表达的作用机制。方法将大鼠随机均分为假手术组(sham)、缺血再灌注组(I/R)(70%左右肝脏缺血60 min再灌注5 h模型)和V-PYRRO/NO+缺血再灌注组(V-PYRRO/NO)[经静脉给予V-PYRRO/NO 1.06μmol/(kg·h)]。用RT-PCR法检测肝脏组织LTC4S mRNA的表达,Western blot法检测肝细胞胞质和细胞核提取物中NF-κB p65、p50和IκB蛋白表达。结果 I/R组肝脏组织中LTC4S mRNA的表达显著高于假手术组(P0.05),而V-PYRRO/NO干预组LTC4S mRNA的表达则明显降低(P0.05);与假手术组相比,I/R组肝细胞核提取物中NF-κB p65和p50蛋白表达上调(P0.01),而胞质中的相关蛋白明显下调(P0.01);V-PYRRO/NO组则完全逆转了I/R期间肝细胞核提取物中NF-κB p65和p50蛋白表达增强(P0.05),以及胞质中的相关蛋白降低(P0.01,P0.05)。但各实验组IκB蛋白的表达无显著差异。正常大鼠肝脏中,胞质和胞核内NF-κB p65几乎不着色;I/R组肝细胞胞质和胞核中NF-κB p65表达强阳性,但V-PYRRO/NO I/R组肝细胞胞质和胞核中NF-κB p65阳性反应明显减弱。结论在大鼠肝脏I/R损伤早期,V-PYRRO/NO下调了LTC4S mRNA的表达,其机制可能涉及抑制不依赖于IκB降解的NF-κB信号传导途径。     

NF-κB信号通路介导AngⅡ诱导THP-1巨噬细胞表达MMP-9

目的： 探讨血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导人单核/巨噬细胞（THP-1细胞）基质金属蛋白酶-9（MMP-9）表达的机制。方法: 用0.1 μmol/L佛波酯（PMA）作用48 h,诱导THP-1单核细胞分化为巨噬细胞后,随机分为4组：（1）PMA组,即对照组;（2）PMA+AngⅡ组（10-7mol/L,1 h）;（3）PMA+AngⅡ+2-硫代氨基甲酸吡咯烷组［PDTC（10 μmol/L,30 min）］;（4）PDTC组。用Western blotting蛋白印记技术分别检测总蛋白MMP-9及磷酸化核转录因子-κB p65（NF-κB p65）的变化,用RT-PCR检测MMP-9 mRNA表达的变化。结果: 与对照组相比,AngⅡ诱导THP-1巨噬细胞磷酸化NF-κB p65增加（1.02±0.10,P<0.05）,MMP-9蛋白量也增加（1.06 ±0.11,P<0.05）,MMP-9 mRNA表达上调（1.22±0.08,P<0.05）,而使用NF-κB的抑制剂PDTC后磷酸化NF-κB p65（0.99±0.12,P<0.01）减少,MMP-9表达明显受到抑制（1.04±0.14, P<0.01）,MMP-9 mRNA表达下调（0.90±0.06, P<0.01）。结论: NF-κB信号转导途径是AngⅡ诱导THP-1巨噬细胞表达MMP-9的重要途径之一。     

梅毒螺旋体膜蛋白Tp0971 经TLR2 / NF-κB 诱导巨噬细胞分泌细胞因子

目的:探讨梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)膜蛋白Tp0971 诱导巨噬细胞分泌细胞因子的分子机制。方法:以Tp Nichols 株基因组为模板,PCR 扩增Tp0971 基因并构建重组质粒pET28a(+) / Tp0971,随后将其转化至表达宿主菌E.coli Rosseta 中,IPTG 诱导表达,Ni-NTA 亲和层析柱纯化重组蛋白。经去除Tp0971 重组蛋白中的内毒素后,将其刺激巨噬细胞,ELISA 检测细胞因子IL-8、IL-1β和IL-6 的分泌水平。并采用Toll 样受体2(TLR2)中和抗体或TLR2 siRNA,以及核转录因子资B(NF-κB)抑制剂PDTC 处理细胞,观察TLR2 和NF-κB 在介导细胞因子分泌中的作用。结果:成功构建pET28a(+) /Tp0791 原核表达载体,并表达出一相对分子量为29 kD 的重组蛋白。ELISA 结果显示,0.5 ~ 10 g/ ml Tp0791 能以剂量依赖性方式诱导巨噬细胞分泌IL-8、IL-1β和IL-6。采用siRNA 沉默TLR2 表达,或用TLR2 中和抗体封闭后,IL-8、IL-1β和IL-6 分泌明显减少。此外,Tp0791 也能增加细胞核中NF-κB p65 的表达水平,采用NF-κB 抑制剂PDTC 处理后,细胞因子分泌水平也显著降低。结论:Tp0971 经TLR2/ NF-κB 可诱导巨噬细胞分泌细胞因子。     

梅毒螺旋体膜蛋白Tp0971经TLR2/NF-κB诱导巨噬细胞分泌细胞因子北大核心CSCD

目的:探讨梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)膜蛋白Tp0971诱导巨噬细胞分泌细胞因子的分子机制。方法:以Tp Nichols株基因组为模板,PCR扩增Tp0971基因并构建重组质粒p ET28a(+)/Tp0971,随后将其转化至表达宿主菌E-.coli Rosseta中,IPTG诱导表达,Ni-NTA亲和层析柱纯化重组蛋白。经去除Tp0971重组蛋白中的内毒素后,将其刺激巨噬细胞,ELISA检测细胞因子IL-8、IL-1β和IL-6的分泌水平。并采用Toll样受体2(TLR2)中和抗体或TLR2 siRNA,以及核转录因子κB(NF-κB)抑制剂PDTC处理细胞,观察TLR2和NF-κB在介导细胞因子分泌中的作用。结果:成功构建p ET28a(+)/Tp0791原核表达载体,并表达出一相对分子量为29 k D的重组蛋白。ELISA结果显示,0.5~10μg/ml Tp0791能以剂量依赖性方式诱导巨噬细胞分泌IL-8、IL-1β和IL-6。采用siRNA沉默TLR2表达,或用TLR2中和抗体封闭后,IL-8、IL-1β和IL-6分泌明显减少。此外,Tp0791也能增加细胞核中NF-κB p65的表达水平,采用NF-κB抑制剂PDTC处理后,细胞因子分泌水平也显著降低。结论:Tp0971经TLR2/NF-κB可诱导巨噬细胞分泌细胞因子。     

雌二醇通过与雌激素受体β结合抑制骨关节炎滑膜细胞的NF-κB通路发挥抗炎作用

目的探讨雌二醇在骨关节炎病程中对滑膜细胞产生抗炎作用的机制。方法分离并鉴定滑膜细胞,利用免疫荧光染色观察滑膜细胞表达雌激素受体β(ERβ)的情况;而后对滑膜细胞进行分组:空白对照组,10 ng/m L白细胞介素1β(IL-1β)处理组、雌二醇处理组(用10 ng/m L IL-1β预处理同时,添加10-7mol/L的雌二醇培养)、雌二醇联合雌激素受体阻断剂四氢大麻酚(THC)处理组(用10 ng/m L IL-1β预处理同时,添加10-7mol/L雌二醇和10-5mol/L THC),各组处理36 h。实时定量PCR检测滑膜细胞中核因子κB抑制蛋白α(IκBα)和IL-6的mRNA水平,Western blot法检测滑膜细胞中IκBα和IL-6的蛋白水平。结果骨关节炎滑膜细胞中有ERβ表达;IL-1β组IL-6的mRNA和蛋白水平表达均增高;IκBα蛋白水平降低,而mRNA水平升高,同时磷酸化IκBα蛋白水平升高;与IL-1β组相比,IL-1β联合雌二醇组,IL-6、IκBα、p-IκBα蛋白及mRNA水平下降。用IL-1β、雌二醇、雌激素受体阻断剂三者联合组,则可见IL-6、IκBα、p-IκBα蛋白及mRNA水平较IL-1β处理组无明显变化。结论雌二醇通过结合ERβ抑制NF-κB通路激活从而发挥抗炎作用。     

肺泡巨噬细胞TLR4/MyD88信号通路参与并介导了机械通气所致的肺损伤

目的探讨肺泡巨噬细胞Toll样受体4/髓样分化因子88(TLR-4/My D88)信号通路在呼吸机相关性肺损伤中的作用。方法 30只成年SD大鼠行经口气管插管,给予40 m L/kg潮气量通气240 min,建立呼吸机相关性肺损伤模型,机械通气结束后,使用4℃PBS经气管导管缓慢注入并回收支气管肺泡灌洗液(BALF),提纯肺泡巨噬细胞。收集并培养肺泡巨噬细胞,随机分为3组:PBS刺激组(CON组);TNF-α刺激联合PBS组(STI组);TNF-α刺激联合抗TLR4单克隆抗体(m Ab)干预组(ANT组);每组8个样本。CON组细胞用PBS结合2 h后,继续用PBS培养16 h;STI组细胞用PBS结合2 h后,采用20 ng/m L TNF-α培养16 h;ANT组细胞用PBS液及TLR4 m Ab结合2 h后,用20 ng/m L TNF-α培养16 h。ELISA检测各组上清液TNF-α、IL-1β、IL-6的表达;反转录PCR检测各组肺泡巨噬细胞TLR4、TLR9、髓样分化因子88(My D88)、核因子κB(NF-κB)的mRNA表达,Western blot法检测各组肺泡巨噬细胞TLR4、TLR9、My D88、NF-κB的蛋白表达。结果与CON组比较,STI组及ANT组细胞培养上清液TNF-α、IL-1β、IL-6的浓度明显增高;STI组肺泡巨噬细胞TLR4 mRNA、My D88 mRNA、NF-κB mRNA表达水平与蛋白表达水平明显增高;ANT组肺泡巨噬细胞TLR4 mRNA、My D88 mRNA、NF-κB mRNA表达水平与蛋白表达水平无明显变化。与STI组比较,ANT组细胞培养上清液TNF-α、IL-1β、IL-6的浓度明显降低;肺泡巨噬细胞TLR4 mRNA、My D88 mRNA、NF-κB mRNA表达水平与蛋白表达水平明显下调。3组TLR9 mRNA与蛋白表达水平相近。结论炎症因子刺激可调节TLR4、My D88、NF-κB分泌增加,肺泡巨噬细胞TLR4-My D88信号通路参与并介导了机械通气所致的肺损伤。     

铜绿假单胞菌活菌诱导不同分化状态的U937细胞表达IL-8的研究

目的探讨铜绿假单胞菌（Pseudomonas aenginasa，Pα）活菌对不同分化状态的U937细胞表达IL-8的诱导作用及通过蛋白激酶C（PKC）和核因子κB（NF-κB）的调控机理。方法采用ELISA和RT-PCR法，分别对Pα诱导不同分化状态的人单核白血病细胞系U937细胞分泌IL-8及U937细胞IL-8 mRNA表达进行研究，应用Western blot检验IκB及NF-κB的蛋白表达，观察PKC和NF-κB活化抑制剂对IL-8表达的影响。结果Pα可促进U937细胞及佛波酯（PMA）分化的U937细胞IL-8 mRNA的表达及IL-8的分泌，而且具有明显的量效和时效关系。Pα能直接诱导并迅速活化NF-κB，1h达到高峰，以后逐渐下降。PKC阻断剂calphostin C及NF-κB阻断剂PDTC均能显著抑制NF-κB的活化及IL-8的表达（P〈0．01）。结论IL-8的产生可能与U937细胞的分化状态有关；Pα可能通过PKC信号通路促进NF-κB的活化，从而启动IL-8的高效表达和分泌。     

切应力诱导内皮细胞表达IL-8基因的信号转导

目的现已确定动脉粥样硬化是一种炎症疾病,单核/巨噬细胞在动脉内膜下集聚是导致动脉粥样硬化损伤发展的基础;血流低切应力促进其损伤的发展.趋化细胞因子MCP-1对单核/巨噬细胞起强力趋化和激活作用,并有报告切应力可诱导其基因的表达.新近报道在层流作用下IL-8亦是单核/巨噬细胞与内皮细胞相互作用的重要调节因子.本研究旨在观察切应力诱导人脐静脉血管内皮细胞IL-8mRNA的表达,探讨Toll/NF-κB信号转导通路对其基因激活的介导作用.方法4.2dyn/cm2层流切应力处理人脐静脉血管内皮细胞,提取总RNA,应用RT-PCR和Northern杂交技术检测切应力作用不同时间后IL-8、TLR-2和TLR-4mRNA的表达.免疫印迹技术检测IκB磷酸化和降解.免疫荧光细胞化学染色检测NF-κB胞核易位.结果切应力作用0.5h后IL-8mRNA表达逐渐增高,2h时达到很高水平.胞浆蛋白IκB和磷酸化IκB的免疫印迹显示4.2dyn/cm2层流切应力作用10min后磷酸化IκB水平即显著增加,30min后又逐渐下降,与之相应IκB含量随切应力作用时间而逐渐下降,到1h时几乎测不出,表明在切应力作用下内皮细胞胞浆NF-κB抑制因子IκB发生了磷酸化和降解.NF-κBp65亚基免疫细胞化学染色显示在4.2dyn/cm2切应力作用0.5h后内皮细胞核逐渐着色,1.5h时细胞核几乎全着色,表明胞浆NF-κB在切应力作用下发生了易位,从胞浆进入胞核.RT-PCR检测和Northern杂交分析显示内皮细胞固有表达TLR-2和TLR-4mRNA,在4.2dyn/cm2切应力作用1h后TLR-4mRNA的表达显著增强,而TLR-2mRNA的表达变化不明显.结论流体切应力可诱导血管内皮细胞表达IL-8,活化转录因子NF-κB.在切应力作用下内皮细胞TLR-4mRNA表达增强,提示Toll/NF-κB信号转导通路可能参与动脉粥样硬化性炎症反应.     

肺炎克雷伯菌黏附素FimH蛋白通过TLR4/NF-κB途径诱导巨噬细胞分泌炎症因子

目的初步探讨肺炎克雷伯菌黏附素FimH蛋白诱导巨噬细胞分泌炎症因子及其作用机制,为阐明肺炎克雷伯菌的致病机制提供实验证据。方法使用肺炎克雷伯菌FimH蛋白刺激巨噬细胞,然后用ELISA法检测IL-1β、TNF-α和IL-6的含量,用Western blot检测iκB-α的表达量。分别用TAK-242、PDTC、SB203580和SP600125预处理巨噬细胞,抑制TLR4、NF-κB、p38和c-Jun活性,再使用ELISA法检测FimH蛋白刺激后IL-1β、TNF-α和IL-6的表达。结果使用FimH蛋白刺激人源性巨噬细胞,IL-1β、TNF-α和IL-6的分泌量明显高于对照。FimH蛋白刺激会够降低细胞中iκB-α的含量。当使用TAK-242抑制TLR4的活性后,FimH蛋白诱导的IL-1β、TNF-α和IL-6表达量下降。使用PDTC和SB203580分别抑制NF-κB和p38的活性,也发现FimH蛋白诱导炎症因子能力下降。但是抑制c-Jun的活性不影响FimH蛋白诱导IL-1β、TNF-α和IL-6的表达。结论肺炎克雷伯菌FimH蛋白能够通过TLR4/NF-κB途径诱导巨噬细胞分泌IL-1β、TNF-α和IL-6。     

NF-κB活化在IL-1β诱导的小鼠肾小球系膜细胞表达IL-6中的作用

目的：研究NF-κB在rhIL-1β刺激引起的体外培养的鼠肾小球系膜细胞表达IL-6中的作用。方法： NF-κΒ活性检测采用电泳迁移率改变法(EMSA),IL-6 mRNA表达采用逆转录/聚合酶链反应(RT/PR)检测,培养上清IL-6蛋白含量采用ELISA检测。结果：rhIL-1β刺激肾小球系膜细胞时,在上调IL-6蛋白和基因表达的同时亦激活NF-κB,而且这种上调作用可被NF-κB特异性抑制剂PDTC所阻抑。结论： IL-1β诱导鼠肾小球系膜细胞表达IL-6是通过NF-κB调控,NF-κB可能参与肾小球肾炎的免疫炎症反应。