MAPKs信号阻断剂U0126对油酸致急性肺损伤大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞中AQP4表达的影响

目的 观察大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AT-Ⅱ)上AQP4与MAPKs信号转导通路在早期急性呼吸窘迫综合征时的相互联系.方法 实验分正常组、油酸肺损伤组及加药组.加药组给予U0126,余两组予二甲基亚砜作为对照.测动脉血气、血管外肺水(EVLW),观察肺组织病理改变评价早期肺损伤程度.急性分离纯化大鼠AT-Ⅱ,行鞣酸染色、碱性磷酸酶染色(AKP)鉴定.采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测肺泡Ⅱ型上皮细胞中AQP-4的mRNA的表达量.结果 血气分析、肺组织HE染色、EVLW 显示损伤组明显高于正常组,加药组较损伤组无明显变化.AQP4 mRNA表达损伤组最高,加药组较损伤组明显减少.结论 大鼠肺泡Ⅱ型细胞上AQP4 mRNA在不同组的表达变化,表明急性肺损伤时启动了MAPKs信号传导通路且增加AOP4 mRNA的表达.

Abstract：

Objective To investigate the relationship between aquaporin 4 (AQP4) in alveolar type II (AT-Ⅱ) cells and MAPK signaling pathway in rats with early-stage oleic acid-induced acute lung injury (ALI) and acute respiratory distress syndrome (ARDS). Methods Three groups of rats, namely the normal control, ALI and U0126 treatment group were used in this study.After oleic acid-induced ALI in the latter two groups, the rats in the treatment group received 100 μ,mol/L U0126 treatment at the dose of 10 μ1, and dimethyl sulfoxide (DMSO) were given in the normal control and ALI groups. Arterial blood gas and the extravascular lung water (EVLW) content were measured after the treatments, and pathological changes in the lung tissues were observed microscopically. ATII cells were isolated from the lung tissues and identified using tannic acid staining and alkaline phosphatase (APK) staining. The expression of AQP-4 mRNA in the cells was detected with RT-PCR. Results Blood gas analysis, HE staining and EVLW content measurement revealed severer injury of the lung tissues in ALI group than in the normal control group, but the severity was comparable between the treatment and ALI groups. RT-PCR demonstrated significantly increased AQP-4 mRNA expression in ALI group as compared with that in the normal control group, and U0126treatment resulted in obvious reduction in AQP-4 mRNA expression in the U0126 treatment group. Conclusions Oleic acid-induced ALI results in the activation of MAPK signaling pathway and up-regulation of AQP-4 mRNA expression in the ATII cells of rats.     

油酸肺损伤时肺泡内液体清除和肺泡II型细胞内cAMP、cGMP水平的变化

目的 观察油酸致大鼠急性呼吸窘迫综合症(ARDS)模型中肺泡Ⅱ型细胞cAMP、cGMP水平的变化及特布他林的作用.方法 随机将SD大鼠分为对照组、ARDS组、特布他林组.用放射免疫分析法测定肺泡Ⅱ型上皮细胞内cAMP、cGMP水平;应用重力法测定血管外肺水含量(EVLW).结果 ARDS组大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞内cAMP明显降低.cGMP水平升高,EVLW明显增多.给予特布他林治疗后,EVLW下降,肺泡Ⅱ型细胞内cAMP含量升高,cGMP变化不明显.结论 油酸致ARDS时,肺水清除能力下降.特布他林可通过提高肺泡Ⅱ型细胞内cAMP水平提高肺水清除能力.肺泡Ⅱ型细胞内cAMP、cGMP水平变化参与急性肺损伤的分子生物学发病机制.     

油酸肺损伤时肺泡II型细胞钠转运功能的变化

目的观察油酸肺损伤模型中肺泡Ⅱ型上皮细胞钠主动转运功能的改变。方法建立大鼠油酸急性呼吸窘迫综合征(ARDS)模型后,分离纯化肺泡Ⅱ型上皮细胞,利用膜片钳全细胞记录模式研究钠转运功能状态以及β2受体激动剂特布他林对其的影响。结果ARDS大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞钠主动转运功能明显减弱,但是特布他林可以使全细胞钠转运增加。结论ARDS时肺泡上皮细胞钠主动转运功能仍然存在,但较正常时明显减弱;而特布他林仍可增加上皮钠转运。     

油酸肺损伤时肺泡Ⅱ型上皮细胞钠水通道的研究

目的测定急性呼吸窘迫综合征（ARDS）状态下肺泡Ⅱ型上皮细胞（ATⅡ）上AOPs的表达量以及全细胞钠电流的大小．以评估病理状态下ATⅡ细胞钠水主动转运能力的状况。方法急性分离纯化油酸ARDS模型大鼠的ATⅡ细胞．用免疫细胞化学、免疫电镜以及Western blotting方法测定AQ1l的表达;用膜片钳技术的全细胞模式测定全细胞钠电流并观察应用特布他林对它的影响。结果ARDS模型组ATⅡ细胞免疫细胞化学AQP1呈阳性,免疫电镜结果细胞膜上可见高电子密度阳性反应。Western blotting分析显示AQP1蛋白条带较对照组明显减弱。全细胞钠电流较对照组明显降低．但对特布他林仍旧敏感。结论ARDS状态下,ATⅡ细胞的钠水主动转运能力明显受损,但并未完全丧失,钠通道激动剂特布他林可以促进钠的转运。ATⅡ细胞钠水通道在肺水的清除中都起着重要的作用。     

油酸肺损伤时肺泡Ⅱ型细胞钠转运功能的变化

目的 观察油酸肺损伤模型中肺泡Ⅱ型上皮细胞钠主动转运功能的改变。方法 建立大鼠油酸急性呼吸窘迫综合征（ARDS）模型后,分离纯化肺泡Ⅱ型上皮细胞,利用膜片钳全细胞记录模式研究钠转运功能状态以及B2受体激动剂特布他林对其的影响。结果 ARDS大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞钠主动转运功能明显减弱。但是特布他林可以使全细胞钠转运增加。结论 ARDS时肺泡上皮细胞钠主动转运功能仍然存在,但较正常时明显减弱;而特布他林仍可增加上皮钠转运。     

急性肺损伤肺泡液转运障碍的发生机制和中医治疗进展

急性肺损伤（ALI）可致急性肺水肿,进一步恶化可导致急性呼吸窘迫综合征或多器官功能障碍综合征。肺泡液转运障碍是ALI的重要病理基础。急性肺损伤肺泡液转运障碍的主要机制包括肺泡毛细血管屏障通透性增加和肺泡上皮清除水肿能力下降两个环节。ALI发生时,肺内皮细胞和上皮细胞直接受损,肺泡毛细血管屏障完整性被破坏,通透性增加,上皮间渗透梯度改变,水再吸收的驱动力丧失;同时,因大量中性粒细胞浸润而产生的促炎因子和活性氧可破坏毛细血管屏障,改变上皮紧密连接,同时使上皮细胞钠离子通道（ENaC）、Na+-K+-ATP酶表达减少,诱导水通道蛋白（AQPs）的表达减少,加重肺水肿程度。中医药疗法干预ALI肺泡液转运障碍方面的基础研究涉及单味中药、中药复方以及电针治疗等。单味中药影响肺泡液转运主要通过以下两条路径实现：一是降低炎症因子的表达而表现出明显的抗炎作用,减轻炎性细胞因子对ENaC、AQPs的抑制,从而保护肺组织;二是调控ENaC、AQPs、紧密连接蛋白的表达,促进肺泡液转运,从而改善肺水肿状态。中药复方和电针则通过多路径协同改善ALI,其具体作用取决于选药与配穴。中药所呈现的多靶点作用潜力,可能为...     

水通道蛋白1、3、4、5在内毒素性急性肺损伤小鼠肺组织中的表达

目的:研究脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的急性肺损伤(ALI)小鼠肺组织中水通道蛋白(AQP)1、3、4、5的表达变化,探讨水通道蛋白1、3、4、5表达与急性肺损伤的关系.方法:40只健康雄性的C57BL/6小鼠随机分为LPS 4 h组、LPS 6 h组、LPS 8 h组、LPS 10 h组(以LPS诱导ALI模型)和对照组,每组8只.采用实时定量PCR测定小鼠AQP-1、AQP-3、AQP-4和AQP-5 mRNA表达,免疫组化和Western印迹法观察AQP-1、AQP-3、AQP-4和AQP-5蛋白表达,同时进行肺湿/千重比值测定以及肺组织病理染色.结果:LPS 4 h、6 h、8 h、10 h组肺湿/干重比值(4.39±0.19、4.58±0.17、4.87±0.21、5.28±0.16)明显高于对照组(3.99±0.25,P＜0.05).LPS灌注后4 h AQP-1蛋白量减少至对照组的(74.1±5.2)%,AQP-5降至对照组的(70.3±7.1)%;LPS灌注后8 h AQP-1蛋白量减少至对照组的(45.2±4.4)%,AQP-5降至对照组的(38.6±8.9)%.AQP-3和AQP-4的表达没有明显变化.结论:AQP-1和AQP-5可能参与ALI液体的异常转运,可能与肺水肿的发病机制有关.AQP-3和AQP-4可能不参与ALI肺水肿的形成过程.     

水通道蛋白-1、3在脓毒症大鼠肺组织表达的研究

目的研究脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的急性肺损伤(Acute lung injury,ALI)大鼠肺组织中水通道蛋白(aquaporins,AQPs)AQP1、3表达的变化,探讨水通道蛋白1、3表达与急性肺损伤的关系。方法 40只SD大鼠随机分为LPS 2h组、LPS 6h组、LPS 12h组(LPS5mg/kg,用生理盐水稀释至2ml)和对照组(生理盐水2ml),每组10只(给药途径均通过鼠尾静脉)。分别在用药后2h、6h、12h用RT-PCR法检测肺组织AQPsmRNA表达。结果 LPS2h组AQP-1蛋白量表达开始下降,LPS6h组AQP-1蛋白量表达最低,LPS12h组接近正常水平。AQP-3的表达无明显变化。结论 AQP-1参与ALI液体的异常转运,可能与肺水肿的发病机制有关。AQP-3可能不参与ALI肺水肿的形成过程。     

分离纯化大鼠肺泡Ⅱ型细胞中水通道蛋白-4的表达

目的观察经分离纯化的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞水通道蛋白-4(AQP4)的表达。方法对大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞进行分离、纯化，绎过特殊染色及电镜鉴定，用免疫细胞化学及免疫电镜方法检测水通道蛋白-4存该单细胞上的表达。结果大鼠肺泡Ⅱ型细胞免疫细胞化学水通道蛋白1—4呈强阳性，免疫电镜结果细胞膜上可见高电子密度阳性反应。结论水通道蛋白-4存存于分离的大鼠肺泡Ⅱ型细胞膜上，对呼吸系统水转运可能起到重要作用。     

油酸诱导的急性肺损伤模型肺泡液体清除能力的实验研究

目的 探讨油酸诱导的急性肺损伤模型肺泡内液体的清除能力.方法 清洁级雄性大鼠51只随机分为正常组、急性肺损伤组和特布他林治疗组.油酸静脉注射复制急性肺损伤模型.动脉血气、肺组织病理学检测评估肺损伤程度,电镜下观察急性分离的肺泡Ⅱ型上皮细胞的变化,重力法测定血管外肺水量(EVLWI).结果 急性肺损伤组大鼠肺损伤评分为(6.37±1.26)分、血管外肺水量为(4.02±0.69)mL/g,显著高于正常组[(1.39±0.5)分和(2.73±0.50)mL/g],均P<0.05;特布他林治疗后大鼠肺损伤评分为(5.23±1.14)分,血管外肺水量为(3.50±0.45)mL/g,较急性肺损伤组显著下降(均P<0.05).电镜下观察急性肺损伤组肺泡Ⅱ型上皮细胞形状不规则,染色质边集,线粒体肿胀,板层小体排空及空泡化等;经特布他林治疗后,电镜观察大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞线粒体肿胀程度及板层小体排空程度较急性肺损伤组轻.结论 油酸致急性肺损伤大鼠肺泡液体清除能力下降,特布他林可以减轻肺组织及肺泡Ⅱ型上皮细胞的损伤,提高肺水清除能力.     

硫化氢调节急性肺损伤大鼠肺泡上皮细胞凋亡

Background Acute lung injury (ALI) is a common syndrome associated with high morbidity and mortality in emergency. Cell apoptosis plays a key role in the pathogenesis of ALI. Hydrogen sulfide (H2S) plays a protective role during acute lung injury. We designed this study to examine the role of H2S in the lung alveolar epithelial cell apoptosis in rats with acute lung injury. Methods Sixty-nine male Sprague Dawley rats were used. ALI was induced by intra-tail vein injection of oleic acid (OA). NaHS solution was injected intraperitonally 30 min before OA injection as NaHS pretreatment group. Single sodium hydrosulfide pretreatment group and control group were designed. Index of quantitative assessment (IQA) and the percentage of polymorphonuclear leucocyte (PMN) cells in the bronchoalveolar lavage fluid (BALF) were calculated. H2S level in lung tissue was measured by sensitive sulphur electrode. Apoptosis was evaluated by terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) staining and Fas protein was measured by immunohistochemical staining. Results The level of endogenous H2S in lung tissue decreased in the development of ALI induced by OA injection. Apoptosis and Fas protein in alveolar epithelial cells increased in ALI of rats but NaHS lessened apoptosis and Fas protein expression in alveolar epithelial cells of rats with ALI. Conclusion Endogenous H2S protects rats from oleic acid-induced acute lung injury probably by inhibiting cell apoptosis.     

水通道蛋白-1在急性肺损伤中的表达及意义

[目的]探讨水通道蛋白1(AQP-1)在脂多糖(LPS)所致的急性肺损伤(ALI)中的作用。[方法]根据是否腹腔注射脂多糖(LPS)将实验动物分为脂多糖组(LPS组)及生理盐水对照组(Con组),对比两组动物组织病理学改变、动脉血气、肺湿/干重比及AQP-1表达的差异。[结果]光镜下见LPS组肺组织水肿,大量炎性细胞浸润;LPS组PO2(55.07±17.02)mmHg明显低于Con组(97.35±9.37)mmHg,差异有显著性意义,P<0.05;LPS组肺湿/干重比(4.93±0.16)明显高于Con组(4.11±0.69),差异有显著性意义,P<0.05;免疫组化染色显示:LPS组的AQP-1蛋白表达减弱,荧光实时定量PCR证实LPS组的AQP-1 mRNA表达较对照组明显下降(P<0.01)。[结论]AQP-1参与了急性肺损伤的形成。     

Aquaporin and Na+ transport of alveolar type II cells in rats with oleic acid-induced acute respiratory distress syndrome]

OBJECTIVE: To evaluate the capacity of active water and sodium transport of alveolar type II (AT II cells in rats with acute respiratory distress syndrome (ARDS). METHODS: AT II cells were isolated and purified from rats with ARDS, and the distribution of aquaporin-1 (AQP-1) on the cells was observed by immunocytochemistry, immunoelectron microscopy and Western blotting. The sodium currents were detected by patch-clamp technique in whole-cell recording mode. RESULTS: Immunocytochemistry showed staining for AQP-1 in rat AT II cells, and immunoelectron microscope demonstrated the presence of AQP-1, which was decreased as shown by Western blotting in comparison with the control group. The whole-cell currents were also decreased, but remained sensitive to terbutalin treatment. CONCLUSIONS: The capacity of active water and sodium transport is damaged, but not totally lost in AT II cells of ARDS rats. Terbutalin can increase the currents even if in pathological conditions. AQP-1 and sodium transport of AT II cells play an important role in pulmonary liquid clearance.     

肺上皮屏障在油酸致肺损伤后肺水肿发生中的作用

目的观察大鼠油酸型肺损伤时肺泡上皮通透性和肺泡上皮液体清除能力的变化,旨在阐明肺泡上皮屏障功能在渗透性肺水肿发生中的作用。方法W istar大鼠35只,随机分为正常对照组和油酸致伤组。经股静脉注入油酸0.25 m l/kg复制急性肺损伤模型,分别于伤后3、6、12、24 h测定肺泡上皮通透性(AEP)、肺泡内液体清除率(ALCR)、总肺水量(TLW)和肺血管外肺水量(EVLW)。结果静注油酸后,大鼠AEP进行性增高,ALCR呈现逐渐下降趋势;同时TLW及EVLW逐渐增加。上述指标均于24 h时相点改变最为显著。伤后24 h,AEP较对照组增高68.7%,TLW和EVLW分别增加44.6%和92.0%,ALCR降低49.4%。结论油酸致伤后,肺泡上皮屏障功能障碍与肺泡水肿形成密切相关,详细机制有待于进一步研究。     

雌孕激素对ALI大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞ENaC表达的影响

目的：研究雌孕激素对急性肺损伤(ALI)大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞钠通道（ENaC）表达的影响,探讨雌孕激素促进肺泡内液体清除的机制。方法：雌性未成年SD大鼠40只,随机分为正常对照组、ALI模型组、雌孕激素联合治疗A组和雌孕激素联合治疗B组,正常对照组颈静脉注入生理盐水(8 mL?kg-1),后3组经颈静脉注入油酸(0.1 mL?kg-1)建立ALI模型,其中雌孕激素联合A、B组分别在油酸注入前12和36 h皮下注射不同比例的雌孕激素混合液0.1 mL(A组 1∶1 000,B组 1∶200)。建模后6 h处死大鼠,测定肺湿重/干重比值,计算肺系数,观察肺组织病理改变,测定肺组织匀浆中α-ENaC、β-ENaC和γ-ENaC mRNA及蛋白的表达水平。结果：①与正常对照组比较,ALI模型组肺湿重/干重比值及肺系数增加,差异有统计学意义（P<0.01）;与ALI模型组比较,雌孕激素联合治疗组肺湿重/干重比值及肺系数下降,以A组明显,差异有统计学意义（P<0.05）。② ALI模型组大鼠出现明显肺水肿、出血及炎性细胞浸润;与模型组比较,联合治疗组大鼠肺水肿、出血及炎性细胞浸润较轻,A组稍明显。③与正常对照组比较,ALI组α-ENaC和γ-ENaC mRNA及蛋白表达水平明显降低,差异有统计学意义（P<0.01）;与ALI模型组比较,联合治疗组α-ENaC和γ-ENaC mRNA及蛋白表达水平有增加,以A组增加明显,差异有统计学意义（P<0.05）。结论：雌孕激素可以通过增加ALI大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞α-ENaC和γ-ENaC mRNA及蛋白的表达水平,促进肺泡内液体的清除。     

从分子生物学角度探究ALI/ARDS的发病机制

急性肺损伤(ALI)/急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的发病与如下机制相关,水通道蛋白在肺内液体的吸收及转运方面具有重要的作用,AQP-1、AQP-5可能参与了ALI液体的异常转运。在细胞因子中,肿瘤坏死因子α被认为是重要的ALI时早期释放的细胞因子,白细胞介素6和白细胞介素10具有抗炎作用,白细胞介素8水平升高与ALI的发病率和病死率密切相关,可溶型fractalkine分子被认为在ALI的炎性反应中发挥着重要作用。肺脏中性粒细胞参与了ALI的发生、发展,中性粒细胞弹性蛋白酶通过破坏或分解肺表面活性物质增加肺泡表面张力,促进血液的渗漏,导致ALI/ARDS。