血链球菌丙酮酸氧化酶基因表达克隆的构建与鉴定

目的　构建血链球菌丙酮酸氧化酶基因 Sopox的表达质粒 ,为研究丙酮酸氧化酶基因 Sopox表达的调节奠定基础。方法　将从血链球菌 ATCC10 5 5 7克隆的丙酮酸氧化酶基因 Sopox重组到 p BV2 2 0 ,表达载体 ,并转化入大肠杆菌 E.coli JM10 5 ,观察 Sopox基因在大肠杆菌中的表达。结果　通过酶切后电泳鉴定 ,Sopox基因重组入 p BV2 2 0并转化入 E.coli JM10 5 ;经 42℃诱导后 ,SDS- PAGE显示 p BV2 2 0 / Sopox/ JM10 5表达分子量约为6 5 kd的蛋白 ,与根据 Sopox基因 DNA序列预测的蛋白分子量一致 ;p BV2 2 0 / Sopox/ JM10 5的蛋白表达在 42℃诱导 4小时后达高峰。结论　丙酮酸氧化酶基因 Sopox已被成功地克隆到 p BV2 2 0 ,并在 E.coli JM10 5中表达     

弓形虫P30基因非融合蛋白表达的研究

目的：构建弓形虫主要表面抗原P30基因的原核表达载体并在E.coli中进行表达。方法：采用定向克隆的方法。将PCR扩增得到的P30片段，插入原核表达质粒pBV220上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，于氨苄LB培养平板上筛选阳性克隆，经过酶切及PCR扩增鉴定重组子，将含阳性重组子pBV220-P30的工程菌经温度诱导表达，SDS-PAGE电泳及免疫印迹分析。结果：成功构建了pBV220-P30重组质粒；SDS-PAGE电泳及Western-blot显示表达P30非融合蛋白的分子量为29kD，且能被弓形虫高免鼠血清识别。结论：从弓形虫基因组DNA中获取P30基因。并成功构建了pBV220-P30重组质粒，诱导表达了P30非融合蛋白，对弓形虫病基因疫苗研制奠定了基础。     

弓形虫P30基因非融合蛋白表达的研究

目的构建弓形虫主要表面抗原P30基因的原核表达载体并在E.coli中进行表达.方法采用定向克隆的方法,将PCR扩增得到的P30片段,插入原核表达质粒pBV220上,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,于氨苄LB培养平板上筛选阳性克隆,经过酶切及PCR扩增鉴定重组子.将含阳性重组子pBV220-P30的工程菌经温度诱导表达,SDS-PAGE电泳及免疫印迹分析.结果成功构建了pBV2200-P300重组质粒;SDS-PAGE电泳及Western-blot显示表达P30非融合蛋白的分子量为29kD,且能被弓形虫高免鼠血清识别.结论从弓形虫基因组DNA中获取P30基因,并成功构建了pBV220-P30重组质粒,诱导表达了P30非融合蛋白.对弓形虫病基因疫苗研制奠定了基础.     

人脑源性神经营养因子成熟肽基因克隆及表达

目的构建表达人脑源性神经营养因子hBDNF的基因工程菌。方法人工合成1对含EcoRI和BamHI限制性酶切位点的特异引物，以人血白细胞基因组DNA为模板。应用PCR技术扩增hBDNF成熟肽基因。用A-T克隆法与pUCm-T载体连接后，再定向插入原核表达载体pBV220，将重组体pBV220．hBDNF转化大肠杆菌DH5a，经42℃热诱导表达。结果经限制性酶切和DNA测序证明重组入载体中的DNA片段确为hBDNF，并成功表达出hBDNF蛋白。结论该研究成功地克隆出hBDNF基因编码序列并在大肠杆菌中获得稳定表达，表达效率达25％，为今后生物学活性的研究和神经系统疾病的基因治疗奠定了基础。     

产肠毒素大肠杆菌定居因子I基因克隆与表达

目的:在大肠杆菌DH5α中表达产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenio escherichia coli,ETEC)定居因子CFA/I,检测重组表达的ETEC CFA/I.方法:以质粒pBV220为基础,构建pBV220-CFA/I重组载体,表达产物用SDS-PAGE鉴定,免疫原性实验验证.结果:成功构建了pBV220-CFA/I重组载体,表达产物的分子量与天然蛋白相同,动物免疫试验表明重组菌具有免疫原性.结论:CFA/I基因的成功克隆为今后的ETEC CFA/I候选疫苗研制奠定了基础.     

p21waf1基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

目的:构建人p21^waf1基因的原核表达载体并在大肠杆菌JM109中高效表达。方法:从人肝细胞中分离总RNA,经逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）得到p21^waf1全基因。用原核细胞表达载体构建了pBV220/p21^waf1重组质粒,经DNA测序确认后,将其转化到大肠杆菌JM109进行表达、初步纯化。 结果:SDS-PAGE凝胶电泳分离显示在分子量21 000处有一诱导蛋白带,薄层扫描显示表达产物在诱导5 h时可达细菌总蛋白的38%,Western blotting证明表达产物与抗人P21^waf1单克隆抗体有特异性免疫反应。 结论:成功构建出p21^waf1表达载体,诱导产生蛋白经检测证实为P21^waf1蛋白。     

产肠毒素大肠杆菌定居因子Ⅰ基因克隆与表达

目的：在大肠杆菌DH5α中表达产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenio eseheriehia coli,ETEC）定居因子CFA／Ⅰ,检测重组表达的ETECCFA／Ⅰ。方法：以质粒pBV220为基础,构建pBV220-CFA／1重组载体,表达产物用SDS—PAGE鉴定,免疫原性实验验证。结果：成功构建了pBV220-CFA/Ⅰ重组载体,表达产物的分子量与天然蛋白相同,动物免疫试验表明重组菌具有免疫原性。结论：CFA／Ⅰ基因的成功克隆为今后的ETECCFA／Ⅰ候选疫苗研制奠定了基础。     

重组人肝细胞生长因子重链在大肠杆菌中的表达研究

目的 观察经过转录前加工、修饰后克隆至表达载体pBV220中的人肝细胞生长因子α链cDNA在肠杆菌的表达情况,优化表达条件,以建立hHGFα原核高效表达体系,并进一步研究hHGF-α蛋白的生物学功能。方法与结果 将重组表达质粒pBV220-hHGF-α转化大肠杆菌DH5a、Plyss,通过升温诱导法,即将温度由30℃升高到42℃,诱导外源基因表达。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测hHGF-α蛋白表达,电泳图谱显示一特异的分子量与单体hHGF-α链吻合的蛋白带。SDS-PAGE光密度扫描对外源基因表达产物进行初步产量,表达产物分别占细菌可溶性蛋白总量的25%、30%。进一步行West-ern-blot对表达产物进行定性,外源基因表达蛋白与特异的hHGF-α抗体呈阳性反应。结论 成功地建立了hHGF-α链原核高效表达工程菌系。     

丙型肝炎病毒多表位抗原的融合表达及抗原性分析

目的 表达HCV核心蛋白Core、非结构区NS3、NS4和NS5区的部分优势表面抗原的融合基因,为丙型肝炎病毒的检测提供合适抗原.方法 通过KT-PCK从HCV全长基因组中分别克隆Core、NS3、NS4和NS5区的部分优势表面抗原的基因片段,运用重叠延伸PCR技术将它们拼接成融合基因,将融合基因再克隆到表达裁体pBVIL-2中.转化大肠杆菌JM109,阳性克隆经42℃热诱导融合蛋白的表达,表达产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定.重组蛋白经阳离子交换和分子筛纯化.结果 42℃诱导可高表达分子量约为43 kD的融合抗原,重组蛋白主要以包涵体形式存在.经过纯化目的 蛋白纯度达90%以上的,表达量约为886μg/mL.ELISA结果表明纯化蛋白具有良好的抗原性.结论 HCV复合多表位抗原融合蛋白可作为HCV诊断抗原提供了靶抗原.     

重组蛋氨酸裂解酶原核体系的表达及纯化

目的 建立L-蛋氨酸γ-裂解酶的原核表达、纯化体系.方法 合成Metase基因并构建重组质粒pBSK-Metase.通过分子克隆技术,构建重组表达质粒pBV220-Metase和pGEX-4T-1-Metase,并将重组子转化到感受态大肠杆菌Dh5α中.pGEX-4T-1-Metase经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导;pBV220-Metase经42℃温度诱导;并对诱导条件进行优化,获得大量表达;建立蛋氨酸裂解酶纯化体系.结果 构建出Metase基因的两种高效原核表达体系pBV220-Metase和pGEX-4T-1-Metase,并优化各自的最佳诱导表达条件;建立重组蛋氨酸裂解酶的纯化体系.结论 成功建立重组蛋氨酸裂解酶的原核表达、纯化体系;获得高效原核表达重组子pGEX-4T-1-Metase,且获得纯度高达95%的蛋氨酸酶.     

hKGF 2在不同原核载体中的构建、表达和纯化分析

目的 比较人角质细胞生长因子2（hKGF2）在不同原核表达载体和宿主菌中的表达及相应蛋白纯化及生物学活性。方法 RT-PCR法从培养的人胚胎肺成纤维细胞提取成熟hKGF2 cDNA,克隆测序后，分别与pBV220和pET-30a(+)表达载体连接，转化不同宿主菌进行诱导表达，聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）及Western blot进行蛋白鉴定。针对不同原核表达载体分别用阳离子交换层析和镍亲和层析（Ni-NTA）纯化目的蛋白，电泳分析蛋白纯化结果，并分别检测其生物学活性。结果 目的基因片段克隆入pBV220载体后在E.coli JM109中表达量最高，约占菌体总蛋白的15%；克隆入pET-30a(+)载体在E.coli BL21（DE3）中表达量约占菌体总蛋白的25%；均为可溶性表达，不同方法纯化后蛋白纯度达95%以上，均能有效促进人胚胎肾上皮细胞增殖。结论 hKGF2基因在不同的宿主菌中蛋白表达不同，以融合蛋白表达纯化效果更好。     

NK4蛋白在大肠埃希菌中的表达、纯化、复性及活性测定

目的 在大肠埃希菌(E. coli)中高表达NK4蛋白,经鉴定、纯化、复性后测定其生物学活性.方法 采用重组DNA技术对已有质粒pGEX-4T-1-NK4和pBV220-HGFα进行改造,构建质粒pBV220-NK4,并使其转化E. coli BL21(DE3),温控诱导表达目的 蛋白NK4.蛋白鉴定采用SDS-PAG...     

人肥胖基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 克隆中国人的肥胖基因，并在大肠杆菌中高效表达人瘦素蛋白。方法 用RT-PCR从培养的中国人脂肪细胞提取的总RNA中扩增出肥胖基因，与TA载体连接后进行核酸序列测定．并将该基因定向克隆至高效表达质粒pBV220，在大肠杆菌中表达。结果 克隆出中国人肥胖基因，其cDNA序列与献报道的一致，构建了重组质粒pBV220-OB，并成功地实现了人肥胖基因在大肠杆菌中的表达。结论 人肥胖基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达，为进一步研究该基因在肥胖症及其相关疾病中的作用，以及在脂肪代谢与脂肪细胞分化中的调控机制奠定基础。     

hBDNF原核表达载体的构建及其表达

目的:利用基因重组技术构建人脑源性神经营养因子(human brain-derived neurotrophic factor,hBDNF)的原核表达载体pBV220/mhBDNF,诱导表达融合基因,鉴定BDNF的生物学活性。方法:制备重组质粒pGEM-T/hBDNF及hBDNF的成熟肽基因片段,经限制性内切酶联合酶切,将hBDNF亚克隆到原核表达载体pBV220,诱导表达克隆基因,培养鸡胚背根神经节,检测表达蛋白的活性。结果:重组原核表达质粒pBV220/mhBDNF构建正确,表达框架未发生改变。成功诱导表达了融合基因并成功地分泌表达hBDNF蛋白。表达蛋白组可见大量神经突起自神经节组织块外周缘向四周呈放射状长出,损伤组未见明显神经突起长出。结论:成功构建了原核表达载体pBV220/mhBDNF,重组质粒可分泌表达hBDNF蛋白,而且hBDNF蛋白有良好的生物活性。本实验为进一步开展hBDNF基因治疗感音神经性耳聋提供了可能。     

人肥胖基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 克隆中国人的肥胖基因,并在大肠杆菌中高效表达人瘦素蛋白。方法 用RT-PCR从培养的中国人脂肪细胞提取的总RNA中扩增出肥胖基因,与TA载体连接后进行核酸序列测定,并将该基因定向克隆至高效表达质粒pBV220,在大肠杆菌中表达。结果 克隆出中国人肥胖基因,其cDNA序列与文献报道的一致,构建了重组质粒pBV220-OB,并成功地实现了人肥胖基因在大肠杆菌中的表达。结论 人肥胖基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达,为进一步研究该基因在肥胖症及其相关疾病中的作用,以及在脂肪代谢与脂肪细胞分化中的调控机制奠定基础。     

四环素抗性表型筛选外源基因高效表达克隆

目的 :应用四环素抗性表型从外源基因的cDNA文库中筛选高效表达克隆。方法 :将四环素抗性基因(TetR)克隆到载体pBV2 2 0 中构建筛选载体pBV2 2 3 ;根据氨基酸密码子的简并性 ,在保持原有氨基酸序列不变的情况下 ,人工合成外源基因的cDNA 5′端简并引物库 ,以hGM CSF基因为例进行筛选。把hGM CSFcDNA简并文库克隆到pBV2 2 3 中的TetR 上游位置 ,构建pBV2 2 3 /hGM CSF克隆文库 ,导入大肠杆菌DH5α中 ,构建转基因的细菌文库 ,在不同质量浓度 (2 0mg/L ,40mg/L ,5 0mg/L ,6 0mg/L)的四环素培养基中培养。结果 :从高浓度四环素培养基中获得高效表达的pBV2 2 3 /hGM CSF克隆 ,测序结果显示该克隆的hGM CSFcDNA 5′端序列与天然序列比较有 7个碱基发生突变 ,且符合实验设计的要求。通过基因重组 ,构建成最终的高效表达克隆pBV2 2 0 /hGM CSF ,其表达hGM CSF的量占细菌总量的 18% ,较原表达水平提高 80 %。结论 :可通过四环素抗性筛选系统筛选外源基因的高效表达克隆。     

hBDNF原核表达载体的构建及其表达

目的：利用基因重组技术构建人脑源性神经营养因子（human brain-derived neurotrophic factor, hBDNF）的原核表达载体pBV220／mhBDNF,诱导表达融合基因,鉴定BDNF的生物学活性。方法：制备重组质粒pGEM-T／hBDNF及hBDNF的成熟肽基因片段,经限制性内切酶联合酶切,将hBDNF亚克隆到原核表达载体pBV220,诱导表达克隆基因,培养鸡胚背根神经节,检测表达蛋白的活性。结果：重组原核表达质粒pBV220／mhBDNF构建正确,表达框架未发生改变。成功诱导表达了融合基因并成功地分泌表达hBDNF蛋白。表达蛋白组可见大量神经突起自神经节组织块外周缘向四周呈放射状长出,损伤组未见明显神经突起长出。结论：成功构建了原核表达载体pBV220／mhBDNF,重组质粒可分泌表达hBDNF蛋白,而且hBDNF蛋白有良好的生物活性。本实验为进一步开展hBDNF基因治疗感音神经性耳聋提供了可能。