人重组骨形态发生蛋白Ⅲ在大肠杆菌中的表达及活性测定

本文报道了利用基因工程技术在大肠杆菌中表达人重组骨形态发生蛋白Ⅲ。运用ＰＣＲ技术，从质粒ｐＳＰ６４／ｈＢＭＰ３中扩增出约０．３３ｋｂ的ｈＢＭＰ３ｃＤＮＡ片断，然后亚克隆到表达质粒ｐＭＳ３１６ｂ中，在大肠杆菌中成功地高效表达出人ＢＭＰ３融合蛋白，表达产物具有体内诱导导位体骨的趋势。     

人骨形成蛋白-3成熟肽cDNA的克隆、测序及表达

目的：扩增、克隆人骨形成蛋白－３（ｈＢＭＰ－３）成熟肽ｃＤＮＡ基因，利用大肠杆菌表达ｈＢＭＰ－３成熟肽．方法：ＰＣＲ方法扩增ｈＢＭＰ－３成熟肽ｃＤＮＡ基因，双脱氧终止法测序正确后，克隆入大肠杆菌表达载体ｐＤＨ，受控于ＰＲＰＬ启动子，重组质粒ｐＤＨＢ－３ｍ以大肠杆菌ＤＨ５α为宿主菌在４２℃进行温度诱导．结果：扩增出ｈＢＭＰ－３成熟肽ｃＤＮＡ基因，序列测定完全正确；含重组质粒ｐＤＨ－Ｂ３ｍ的工程菌诱导后在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上出现一条新生蛋白带，分子质量为１４．５ｋｕ，与预期ｈＢＭＰ－３成熟肽分子量大小一致，约占菌体总蛋白的２８％．结论：成功扩增、克隆ｈＢＭＰ－３成熟肽ｃＤＮＡ基因，并可在大肠杆菌中得到高效表达     

人骨形态发生蛋白-2的基因重组及其在大肠杆菌中的表达

目的用基因工程技术在大肠杆菌中表达人骨形态发生蛋白２（ｈＢＭＰ２）。方法将包含ｈＢＭＰ２部分前肽和成熟肽的３′端７３０ｂｐｃＤＮＡ片段,插入原核表达载体ｐｋｐＬ３ａ的多克隆位点,构建成ｐＫｐＬ３ａ／ｈＢＭＰ２重组表达载体,转化大肠杆菌ｐｏｐ２１３６,挑选阳性克隆,经诱导表达后用ＳＤＳＰＡＧＥ鉴定。结果该克隆表达的ｈＢＭＰ２为ＭＷ２７０００,表达量占菌体总蛋白１０％,部分纯化后植入大鼠股部肌肉,组织学观察到肌肉内大量间充质细胞增生及骨与软骨形成。结论说明重组ｈＢＭＰ２具有诱导异位骨与软骨形成的生物学功能。     

人骨形成蛋白2碳端肽在大肠杆菌中的高表达及活性测定

利用基因工程技术生产人骨形成蛋白（ｈＢＭＰ），为其诱骨机理及临床应用研究提供前提条件。作将ｈＢＭＰ２ ｃＤＮＡ３’端７３２ｂｐ片段，克隆入大肠杆菌表达载体ｐＧＥＸ－２Ｔ，经ＩＰＴＧ诱导后，表达产物存在于包涵体中，将其纯化复性后，进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和ＦＰＬＣ分析，并作小鼠体内异位诱骨活性检测。表达的ｈＢＭＰ２与ＧＳＴ的融合蛋白Ｍｒ＝５１ｋｕ，占菌体总蛋白的３０％，纯化、复性后，ＦＰＬＣ分析示尖而     

用融合蛋白在大肠杆菌中高表达百日咳杆菌毒素蛋白S＿3亚基基因

用多聚酶链反应（ＰＣＲ）和基因重组技术通过百日咳毒素Ｓ＿３亚基基因和高表达质粒ｐＭＡＬ－Ｃ构建了麦芽糖结合蛋白（ＭＢＰ）和（Ｓ＿３）亚基蛋白的融合基因，并在大肠杆菌中高效表达了（ＭＢＰ－Ｓ＿３）融合蛋白。该融合蛋白产率占细胞总蛋白含量的２５％，并且能用蛋白酶因子Ｘａ将融会蛋白切开，得到ＭＢＰ（４２ＫＤ）和Ｓ＿３亚基蛋白（２１．８７ＫＤ）．该方法表达式效率高。纯化过程简单，为基因工程技术生产该毒素提供了新的途径。     

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白—2基因克隆及其在大肠杆菌中 …

目的：克隆恶性疟原虫裂殖子表面蛋白２全基因,并在大肠杆菌中进行表达。方法：采用ＰＣＲ扩增恶性疟原虫ＦＣＣ－１／ＨＮ株ＭＳＰ２基因,克隆插入ｐＵＣ１９,并重组人表达质粒载体中,转化大肠杆菌,诱导重组质粒ｐＢＫ－ＣＭＶ／ｍｓｐ２表达ＭＳＰ２蛋白抗原,对表达产物进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ,ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｗｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定。结果：ＰＣＲ扩增出８２４ｂｐＤＮＡ片段,经酶切鉴定和部分序列测定证实为Ｍ     

血小板生成素突变体融合蛋白表达及纯化研究

目的：用大肠杆菌融合蛋白表达载体ｐＭＡＬ－ｃ２构建人血小板生成素突变体融合蛋白表达质粒ｐＭＡＬ－ＴＯＰＭ，方法：采用基因重组和表达，ＳＤＳ－聚丙烯酰胺胶电泳和蛋白纯化技术。结果：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明，ＩＰＴＧ诱导５ｈ后大肠杆菌ＪＭ１０９表达到最高水平，约占大肠杆菌菌体总体蛋白的３６．６％，除了大肠杆菌ＲＲ１不表达以外，大肠杆菌ＤＨ５αＨ１０１均有较高水平的表达，表达产物血小板生成素突变体融合蛋     

重组人骨形态发生蛋白-2/7融合基因的构建及其在大肠杆菌中的表达和初步活性测定

构建重组人骨形态发生蛋白－２／７融合体, 研究其在大肠杆菌中的表达及生物学活性。利用ＤＮＡ 重组技术,将编码人骨形态发生蛋白－２ （ＢＭＰ－２） 成熟肽的０．３６ ｋｂ 基因片段与编码人骨形态发生蛋白－７ （ＢＭＰ－７） 成熟肽的０．４４ｋｂ 基因片段连接,得到重组人骨形态发生蛋白－２／７ 融合基因; 经测序鉴定后,将其克隆到表达载体ｐＢＶ２２２中,转化大肠杆菌ＤＨ５α, 温度诱导表达。表达蛋白经初步纯化后测定其对培养小鼠成骨样细胞增殖、分化及碱性磷酸酶活性的影响。克隆质粒转化的工程菌,经４２℃诱导４～６ ｈ 后,高效表达重组人骨形态发生蛋白－２／７, 在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上出现一新的蛋白带, 分子量约２９ ｋｕ,约占菌体总蛋白的２０％ ,表达蛋白以包涵体的形式存在,经初步纯化、裂解、复性后的ＢＭＰ－２／７ 蛋白具有促进成骨样细胞分化、增殖及增加碱性磷酸酶活性的作用。ＢＭＰ－２／７ 融合基因的构建和表达,可能提供一种全新的具有诱导成骨作用的蛋白     

抑癌基因p16原核表达载体的构建及其表达的研究

为获取具有生物学活性的ｐ１６蛋白，采用定向克隆方法将双酶切克隆质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ－ｐ１６得到的ｐ１６ｃＤＮＡ片段连接到双酶切的原核表达载体ｐＢＶ２２０上，转化大肠杆菌ＴＧ１得到含重组表达质粒ｐＢＶ２２０－ｐ１６的工程菌，温度诱导表达后，经ＳＤＳ—ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测证实含有ｐ１６蛋白。结果表明，ｐ１６原核表达载体构建成功并表达出ｐ１６非融合蛋白。     

人钙调素基因Ⅲ表达载体的构建及在大肠杆菌中的高效表达

目的：用基因工程技术在大肠杆菌中高效表达人ＣａＭ蛋白。方法：用ＰＣＲ方法获得人钙调素基因Ⅲ（ｈＣａＭⅢｃＤＮＡ），将其插入表达载体ｐＢＶ２００，构建重组表达质粒ｈＣａＭⅢ／ｐＢＶ２００，用酶切、ＤＮＡ测序、ＰＣＲ扩增鉴定阳性克隆。用ＣａＣｌ２法转化大肠杆菌ＤＨ５α使其表达ＣａＭ蛋白。结果：阳性重组子在大肠杆菌ＤＨ５α中经温度诱导可高效表达ＣａＭ蛋白，经１５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，可观察到一分子量与理论值相符（约１７０００）的诱导表达条带，其表达量占菌体蛋白总量的２０％。进一步分析表达产物的性质表明，ＣａＭ主要以可溶性形式表达。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果证实，１７０００的表达条带可与标准鼠抗ＣａＭＭｃＡｂ起特异反应。结论：重组人ＣａＭ在大肠杆菌中的成功表达，为进一步研究ＣａＭ的生物学功能及研制抗ＣａＭ单克隆抗体奠定了基础     

昆虫杆状病毒表达系统中人骨形成蛋白3的表达及鉴定

探索人骨形成蛋白在昆虫杆状病毒系统中的表达规律。方法将ｈＢＭＰ３全长ｃＤＮＡ克隆入转移载体ＢａｃＰＫ８中,酶切鉴定后,将此载体与病毒ＤＮＡ经脂质体包裹转染昆虫细胞,重组病毒经蓝白选后,提取其ＤＮＡ进行ＰＣＲ反应,鉴定目的基因。收集重组病毒感染５ｄ的细胞进行免疫荧光及电子显微镜观察。结果克隆了目的基因的重组载体经内切酶消化后,琼脂糖电泳示有相应大小的目的基因片段切下,ＰＣＲ电泳结果见有目的基因片段的     

人骨形态发生蛋白12前体蛋白cDNA的克隆及序列分析

目的克隆人骨形态发生蛋白12前体蛋白的基因。方法根据Genbank人骨形态发生蛋白12的基因序列合成两条引物,从人胎盘组织中提取总RNA,用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增出长920 bp编码人骨形态发生蛋白12(BMP12)前体蛋白的基因序列。将所得的基因片段插入载体pTARGETTM质粒中并转化大肠杆菌JM109,提取重组质粒进行鉴定并测序。结果RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳显示一长约920 bp的条带,阳性克隆质粒经PCR扩增出约920 bp的片段,全自动DNA测序结果表明和Genbank中的序列完全相符。结论通过RT-PCR可从人胎盘组织中成功地克隆出人BMP12前体蛋白基因,基因序列完全正确。     

人骨形态发生蛋白12前体蛋白cDNA的克隆及序列分析

目的 克隆人骨形态发生蛋白12前体蛋白的基因。方法 根据Genbank人骨形态发生蛋白12的基因序列合成两条引物，从人胎盘组织中提取总RNA，用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增出长920bp编码人骨形态发生蛋白12(BMP12)前体蛋白的基因序列。将所得的基因片段插人载体pTARCET^TM质粒中并转化大肠杆菌JM109，提取重组质粒进行鉴定并测序。结果 RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳显示一长约920bp的条带．阳性克隆质粒经PCR扩增出约920bp的片段，全自动DNA测序结果表明和Genbank中的序列完全相符。结论 通过RT-PCR可从人胎盘组织中成功地克隆出人pMP12前体蛋白基因，基因序列完全正确。     

Osteogenic potential of the human bone morphogenetic protein 2 gene activated nanobone putty

Background Nanobone putty is an injectable and bioresorbable bone substitute. The neutral-pH putty resembles hard bone tissue, does not contain polymers or plasticizers, and is self-setting and nearly isothermic, properties which are helpful for the adhesion, proliferation, and function of bone cells. The aim of this study was to investigate the osteogenic potential of human bone morphogenetic protein 2 （hBMP2） gene activated nanobone putty in inducing ectopic bone formation, and the effects of the hBMP2 gene activated nanobone putty on repairing bone defects.
Methods Twenty four Kunming mice were randomly divided into two groups. The nanobone putty ＋ hBMP2 plasmid was injected into the right thigh muscle pouches of the mice （experiment side）. The nanobone putty ＋ blank plasmid or nanobone putty was injected into the left thigh muscle pouches of the group 1 （control side 1） or group 2 （control side 2）, respectively. The effects of ectopic bone formation were evaluated by radiography, histology, and molecular biology analysis at 2 and 4 weeks after operation. Bilateral 15 mm radial defects were made in forty-eight rabbits. These rabbits were randomly divided into three groups： Group A, nanobone putty ＋ hBMP2 plasmid; Group B, putty ＋ blank plasmid; Group C, nanobone putty only. Six rabbits with left radial defects served as blank controls. The effect of bone repairing was evaluated by radiography, histology, molecular biology, and biomechanical analysis at 4, 8, and 12 weeks after operation.
Results The tissue from the experimental side of the mice expressed hBMP2. Obvious cartilage and island-distributed immature bone formation in implants of the experiment side were observed at 2 weeks after operation, and massive mature bone observed at 4 weeks. No bone formation was observed in the control side of the mice. The ALP activity in the experiment side of the mice was higher than that in the control side. The tissue of Group A rabbits expressed hBMP2 protein and higher ALP level. The ne     

人骨形态形成蛋白的纯化及其诱导成骨的研究

本实验采用差示沉积、超滤及羟基磷灰石柱层析法,提取和纯化了人骨基质内骨形态形成蛋白,得到纯化的人骨形态形成蛋白,分子量为17000U(约17000道尔顿).以C_3H小鼠147只为实验动物,纯化的骨形态形成蛋白的诱导成骨率为100％。     

Construction of recombinant adeno-associated virus vector co-expressing hVEGF_(165) and hBMP_7 gene

Objective: To construct recombinant adeno-associated virus co-expressing human vascular epithelial growth factor 165(hVEGF165) and bone morphogenetic protein 7(hBMP7),measure the virus titer and verify the recombination. Methods:The AAV helper-free system was used as basis to generate recombinant AAV. The IRES sequence of plasmid pIRES was cut down and subcloned into ITR/MCS containing vector pAAV-MCS to construct recombinant plasmid pAAV-MCSa-IRES-MCSb. The hVEGF165 and hBMP7 gene was amplified by PCR and inserted into upstream MCSa and downstream MCSb respectively. Then,recombinant plasmid pAAV-hVEGF165-IRES-hBMP7,pAAV-RC and pHelper were co-transfected into AAV-293 cells to complete rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP7 packaging. The GFP labeled rAAV-IRES-GFP was simultaneously packaged by using the parallel plasmid pAAV-IRES-hrGFP. The efficiency of AAV packaging was monitored under fluorescent microscope and recombinant viral particles were harvested from infected AAV-293 cells. The virus titer was measured by infecting AAV-HT1080 cells,and the recombinant AAV-hVEGF165-IRES-hBMP7 was verified by PCR of the exogenous interest genes. Results:Recombinant pAAV-hVEGF165-IRES-hBMP7 was verified by double digestion. GFP expression in AAV-293 could be observed under fluorescent microscope 72 h after transfection and the system provided a high packing ratio of 95%. The recombinant adeno-associated virus has a high titer of 5.5×1011vp/ml,and AAV-HT 1080 was infected at a ratio of 90%. The recombinant virus was confirmed by PCR of exogenous hBMP7 and hVEGF165 gene. Conclusion:Recombinant rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP7 was successfully constructed with a high virus titer,which may offer foundation for in vitro and in vivo experiments of hVEGF165 and hBMP7 co-expression and provide a new method for gene therapy of bone regeneration.     

hBMP-7基因转染对骨髓间充质干细胞增殖和碱性磷酸酶合成的影响

目的探讨逆转录病毒介导的人骨形态发生蛋白7(humanbonemorphogeneticprotein7,hBMP-7)基因转染对兔骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcell,BMSc)增殖和向成骨细胞分化的影响。方法构建hBMP-7逆转录病毒载体,使用含目的基因的病毒液感染BMSc,免疫组织化学方法检测hBMP-7蛋白的表达,MTT法检测细胞增殖能力,使用流式细胞仪检测细胞周期,NPP法检测碱性磷酸酶合成情况。结果经BMP-7基因转染的兔BMSc有hBMP-7的阳性表达,增殖能力无明显改变(P>0.05),但其合成碱性磷酸酶的能力得到显著提高,与空载体病毒液转染、未经转染的BMSc相比差异有显著性(P<0.01)。结论经BMP-7基因转染的BMSc能够表达外源BMP-7,hBMP-7基因转染能够促进体外培养的BMSc向成骨细胞转化,可用于以BMSc为种子细胞的组织工程化骨组织的构建。     

重组人骨形成蛋白2在皮肤成纤维细胞中的表达

目的 构建人骨形成蛋白2(BMP2)的真核表达载体以探讨成纤维细胞表达BMP2的情况。方法 构建携带人BMP2基因的真核表达载体pRK5-hBMP2，并将其转染CHO细胞、NIH3T3细胞和正常人皮肤成纤维细胞后，采用RT-PCR方法检测人BMP2在mRNA水平上的表达。结果 RT-PCR显示转染后的CHO细胞、NIH3T3细胞和正常人皮肤成纤维细胞可以有效地转录BMP2 mRNA。结论 含有人BMP2 cDNA的重组质粒pRK5-hBMP2转染正常人皮肤成纤维细胞后可以有效地表达BMP2。     

腺病毒和慢病毒载体感染骨髓间质干细胞的比较

目的比较腺病毒和慢病毒载体感染骨髓间质干细胞（rMSCs）的荧光病毒基因表达的稳定性及持续时间。方法将含有绿色荧光蛋白（GFP）基因的慢病毒载体质粒同辅助质粒一起共感染293T细胞,重组包装;将慢病毒和腺病毒载体分别感染rMSCs,培养5周,分别在1、3、5周通过流式细胞仪检测GFP的表达情况。从GenBank中调出人骨形态发生蛋白2（hBMP2）基因序列,设计带有NheⅠ、AgeⅠ双酶切位点引物。从人肝脏组织中抽提总RNA,再逆转录成cDNA,扩增出hBMP2基因的全长序列。测序验证后克隆到慢病毒载体pHIV-CS-CDF-CG-PRE上,通过PCR扩增、酶切、测序等方法鉴定重组慢病毒载体。将该重组慢病毒载体质粒同辅助质粒一起共感染293T细胞,通过重组而包装成能表达hBMP2基因的有活性的慢病毒。结果两种病毒载体感染后1周,绿色荧光蛋白表达分别是90％和71％,到5周时,慢病毒载体的绿色荧光蛋白表达明显高于腺病毒载体,分别是79％和0．05％。扩增出1．2kb左右的hBMP2全长基因与GeneBank中的hBMP2阅读框架序列完全一致;成功克隆和构建了含hBMP2基因的慢病毒载体pHIV-hBMP2;对慢病毒载体进行了成功包装和分析。结论含hBMP2基因的慢病毒载体可成功构建。慢病毒载体对大鼠骨髓间质干细胞的转染效率明显优于腺病毒载体。     

Construction of Adeno-associated Virus System for Human Bone Morphogenetic Protein 7 Gene

To construct the recombinant adeno-associated virus （rAAV） vector with human bone morphogenetic protein 7 （BMP7） and observe the BMP7 mRNA expression in vitro, BMP7 CDS sequence was cloned into expression plasmid pAAV-MCS of AAV Helper Free System. The recombinant plasmid was identified with enzyme digestion and sequencing. The recombinant plasmid, pAAV-RC, pHelper were co-transfected into AAV-293 cells according to the calcium phosphate-based protocol. The viral stock was collected by 4 rounds of freeze/thaw. After purified and concentrated, the recombinant virus titer was determined by dot-blot assay. HEK293 cells were transfected with the recombinant virus at different MOI, and the expression of BMP7 mRNA was detected by RT-PCR. The results showed rAAV-BMP7 was constructed and packaged successfully. The physical particle titer was 2.5×10^11 vector genomes/mL. There was different expression level of BMP7 mRNA after transfecton. These data suggested that recombinant AAV mediated a stable expression of hBMP7 mRNA in 293 cells. The AAV production method may pave the way of an effective strategy for the jaw bone defection around dental implants.