阴道毛滴虫两个Sir2同源基因的克隆和功能

目的探讨寄生性原虫阴道毛滴虫细胞生长和衰老的相关基因。方法从阴道毛滴虫的cDNA表达文库中分离出两个与酵母沉寂信息调节因子（Sir2）有较高同源性的cDNA克隆,分别命名为TvSir2和TvSir2-like,它们的编码框分别长915bp和1116bp。结果序列分析显示这两个cDNA克隆与酵母Sir2同源性很高,其氨基酸序列中含有Sir2p及其同源蛋白三个特征性保守结构域。分别从这两株cDNA克隆中扩增出表达片段植入表达载体pET-41a,转化宿主菌E.coli BL21并用IPTG（isopropylthio-β-D-galactoside）诱导表达到大量融合蛋白。用亲和层析法纯化的融合蛋白分别免疫豚鼠,获得的抗血清用Western-blot法识别到滴虫虫体全蛋白中大小为34000Mr和42000 Mr的条带。免疫荧光法检测TvSir2和TvSir2-like蛋白位于细胞核外的内质网和高尔基复合体区域。结论TvSir2和TvSir2-like克隆是酵酶Sir2的同源基因,为TvSir2和TvSir2-like在模式生物阴道毛滴虫的功能研究奠定了基础。     

阴道毛滴虫衰老生物学标志分子β-半乳糖苷酶基因克隆和蛋白表达

目的:克隆并分析阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis,Tv)衰老生物学标志分子β-半乳糖苷酶(β-gal)同源基因,表达β-GAL重组蛋白。方法:从Tv cDNA表达文库中分离获得Tv β-gal同源基因的cDNA克隆,测序和序列分析。将cDNA部分片段亚克隆到原核表达载体(pQE-80L),转化宿主菌E.coli SG13009,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析鉴定。结果:在Tv cDNA文库中获得1株2445 bp的cDNA克隆。序列分析表明,该序列开放读码框有2415 bp,推测肽链具有804个氨基酸,等电点为5.4;该肽链与多种来源的β-GAL同源蛋白均具有较高同源性。用PCR扩增了该cDNA序列中的2277 bp片段,构建了pQE-80L/Tv β-gal,所表达重组蛋白产物的相对分子质量为82 ku。结论:推测该克隆是Tv β-gal的同源基因,Tv β-gal基因可以在E.coli中得到表达,为进一步研究其细胞内定位和蛋白功能奠定了基础。     

阴道毛滴虫沉寂信息调节因子Sir2同源基因克隆和蛋白表达

目的克隆并分析阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis)沉寂信息调节因子Sir2基因,构建原核表达重组载体,表达重组蛋白,并制备抗体进行相关功能的研究。方法从阴道毛滴虫cDNA表达文库中分离获得阴道毛滴虫Sir2同源基因的cDNA克隆、测序,并采用相关在线程序及软件进行序列分析。将cDNA部分片段亚克隆到原核表达载体pET-41a,转化宿主菌E.coliBL21,IPTG(isopropylthio-β-D-galactoside)诱导表达,亲和层析法纯化表达产物并对表达产物进行SDS-PAGE鉴定之后,用纯化重组蛋白免疫豚鼠获得抗血清,对重组蛋白和滴虫总蛋白进行蛋白质印迹鉴定。结果在阴道毛滴虫cDNA文库中获得一株1034bp的cDNA克隆,序列分析表明,该序列开放阅读框有912bp,推测肽链具有304个氨基酸,等电点(PI)5.5。该肽链与酵母SIR2p蛋白及其同源物一致性高达30%～47%,并具有SIR2p及其同源蛋白的三个高度保守的特征性结构域。进化树结果显示,TvSIR2p接近线虫的SIR2蛋白,与同时克隆到的基因组TvSir2比较序列一致,证明该TvSir2基因组DNA不含内含子。PCR扩增出890bp片段,植入表达载体pET-41a;经酶切鉴定后取阳性克隆用IPTG诱导表达,产生融合蛋白产物经SDS-PAGE鉴定相对分子质量为62000,与预期分子质量相符。用该融合蛋白免疫豚鼠得到的抗体,经Westernblotting检测其与相应融合蛋白发生特异性反应,同时在33000处也能识别滴虫虫体全蛋白。结论推测该克隆是阴道毛滴虫Sir2的同源基因,该基因没有内含子,它可能参与阴道毛滴虫的组蛋白去乙酰化作用及调节衰老和寿命。阴道毛滴虫Sir2基因可以在大肠杆菌中得到表达,并获得了相应的抗血清,为进一步研究其功能奠定了基础。     

流感病毒A HA(H3N2)基因真核表达载体的构建及序列分析

目的：获得血凝素基因（HA）基因，将其克隆到真核表达载体，为研究流感DNA疫苗奠定基础。方法：从当年流感病人体内分离病毒（A／Guangdong/448/2001)，鉴定型别（H3N2）后，提取RNA，用特异引物进行RT－PCR,扩增HA，并将其克隆到pMD18-T Vector，进行序列测定和分析；然后将HA基因亚克隆到真核表达载体（pCI-neo)，进行鉴定。结果：获得一个核苷酸长度为1698bp的基因，编码565个氨基酸；与A／Beijing/32/92(Genbank/NCBI:U26830)基因序列有98％同源，有15个碱基和／或10个氨基酸出现变异，且在212缺失一个氨基酸V；酶切和序列测定表明HA基因正确插入pCI-neo载体（HA－pCIN)。结论：成功构建了HA基因真核表达载体，可以进一步研究其免疫功能。     

广东流行的三株登革1型病毒包膜蛋白基因的序列测定与分析

目的通过对广东省不同地区、不同流行期间分离的三株登革1型病毒(DVI)的结构蛋白E基因进行序列测定及分析．了解各流行株之间的遗传差异，追踪其可能的传染来源：方法应用RT-PCR技术扩增病毒的结构蛋白E基因，克隆到PMD18-T载体．转化JM109宿主菌，挑取阳性克隆进行鉴定及序列测定，应用计算机软件与国内外参考及流行株进行同源性分析．并绘制基因系统发生树：结果3株DVI病毒E基因序列长度均为l485bp，编码495个氨基酸，核苷酸序列同源性在91％～98％之间、推测的氨基酸序列同源性在94％～99％之间：GD23／95与A88核苷酸(氨基酸)同源性为95％(98％)，与其他株的同源性相对较低，2株属同一基因型；GD14／97和GD05／99与Cambodia共享序列非常接近．3株同属另一基因型。结论广东省1997、1999和1995年流行的登革热可能来自境外不同的疫源地。     

恶性疟原虫子孢子表面蛋白2基因的克隆与序列分析

目的：克隆恶性疟原虫海南株(FCC1／HN)子孢子表面蛋白2(PfSSP2)基因，并进行序列分析。方法：根据PfSSP2基因已知序列设计合成一对引物，用PCR技术从FCC1／HN株基因组DNA中扩增出PfSSP2基因，并克隆入pMD-18T测序载体。用双脱氧链末端终止法测序，用DNAstar软件辅助分析基因结构及进行同源性比较。结果：PCR扩增得到特异的FCC1／HN株PfSSP2基因序列，酶切及PCR鉴定获得了正确的pT-PfSSP2重组质粒。测序表明，所克隆的PfSSP2基因大小为1680bp，编码559个氨基酸残基。序列分析表明，我国恶性疟原虫FCC1／HN株与国外的3D7、DD2、FCR3、HB3A、K1、Thai814、Thai838、Thai842、Thai947及7G8株PfSSP2的氨基酸序列在33个位点存在氨基酸替代，1处氨基酸序列增加；各株间PfSSP2的氨基酸序列同源性都在95.7％以上。结论：克隆了恶性疟原虫FCC1／HN株PfSSP2基因。序列测定及同源性分析表明，恶性疟原虫不同分离株间有高度的同源性。     

1997～2000年我国华东地区HIV-1分离株抗原决定簇氨基酸及其编码核苷酸序列的变化

①目的 对1997-2000年来自华东地区52例HIV-1分离株env基因C2-V3区序列及其V3环顶端主要中和抗原决定簇（PND）氨基酸序列的变化规律进行分析。②方法 以来自同时期上述地区的HIV-1感染者PBMC基因组为模板，采用套式PCR扩增HIV-1env基因C2-V3区片段，产物经克隆，测序。DNA测序结果经DNA Star软件分析HIV-1分离株的基因分型，比较HIV-1膜蛋白V3环顶端PND相关用八肽氨基酸及其编码核苷酸序列的变化特征及出现频率并测其共享序列。③结果 1997-2000年华东地区HIV-1分离株的基因分型有7个，分别属于HIV-1M亚群的A-G亚型。分离株间的基因离散率为1.2%-5.8%。同时发现了env基因双V3区变异的HIV-1自然突变朱（Genbank AF220245)。分析52株PND相关八肽基因序列，其中以第2、3、7位氨基酸及其编码核苷酸的变化最为显著，分别为11.5%，9.6%，9.6%，且3组共享序列相关的八肽亲水性有明显差异。④结论 1997-2000年华东地区HIV-1流行呈现多个型别共同，混合流行的特征，膜蛋白PND的八肽基因序列呈现多样性变化，新的HIV-1膜蛋白双V3区变异株的发现可能与病毒重组，免疫逃避及致病机制有关。     

家蝇幼虫抗菌肽Defensins基因的克隆与序列分析

目的：克隆家蝇幼虫的抗菌肽defensins基因并对其进行序列分析。方法：提取家蝇幼虫总RNA，根据家蝇成虫defensins基因cDNA序列设计一对引物，RT-PCR扩增目的基因片段，T-A克隆后测序，应用相关生物信息学软件对该序列进行分析。结果：RT—PCR扩增出一条约310bp的目的片段，序列分析表明，其与家蝇成虫防御素基因同源性高达97％，核酸序列变异主要发生在信号肽区域。结论：成功克隆及分析了家蝇幼虫防御素基因全长编码区cDNA序列，为其下一步的重组表达和生物活性研究奠定了基础。     

抗凋亡基因bcl-2 cDNA表达型质粒的构建及序列分析

克隆抗凋亡基因bcl-2，并构建其表达型质粒；进行序列分析，为基因转染作准备。方法：应用PCR定向克隆技术，克隆SD大鼠鼠脑bcl-2全编码CDNA序列；应用双脱氧末端终止法进行重组质粒中bcl-2的cDNA序列分析；利用基因重组技术，将bcl-2全编码cDNA序列，导人pCMVT-Tag-1表达型质粒。结果：成功地克隆sD大鼠bcl-2全编码cDNA序列，并将其成功地导人pCMV-Tag-1表达型质粒；经序列分析，发现bcl-2全编码序列与Gene-Bank中的相应序列相比，有3个碱基出现差别，分别为171位a→g，233位a→c，530位g→a，均为同义突变。结论：为抗凋亡基因bcl-2对胰岛细胞的转染研究提供了实验基础。     

克隆的丙型肝炎病毒NS2基因中发现数个N端终止突变序列

探讨丙型肝炎病毒（HCV）准种在NS2区的基因结构特征。利用逆转录－巢式PCR从一份HCV慢性携带者的阳性血清及一份急性丙肝患者的血清中获得HCV NS2全长cDNA，将其克隆于T载体，各随机挑取5个阳性克隆进行序列测定。结果显示在克隆到的HCV NS2全长基因中，慢性携带者该区序列有一个于HCV多聚蛋白第835位氨基酸的位置出现终止信号，丙肝患者该区序列有三个于第835位氨基酸的位置出现终止信号，一个小于第887位氨基酸的位置出现终止信号。在克隆到的HCV NS2基因中存在多个N端终止突变序列，提示NS2 N端跨膜区可能与包膜蛋白区有着密切的联系。     

suc2基因的克隆及在酵母基因组中的定位突变

目的 克隆酿酒酵母的蔗糖转换酶基因（ｓｕｃ２）,并定位突变酵母基因组中的ｓｕｃ２基因以获得无蔗糖转换酶表达的酵母品系。方法 用ＰＣＲ法从酵母Ｙ１９０基因组中扩增出ｓｕｃ２的成熟肽基因片段,克隆后测序。将色氨酸合成酶（ＴＲＰ）基因片段插入ｓｕｃ２基因中,构建成用于同源重组的ｓｕｃ２基因定位突变载体。导入酵母Ｙ１９０,用营养缺陷筛选出ｓｕｃ２基因突变的克隆。用ＰＣＲ扩增并克隆突变后的ｓｕｃ２基因,用序     

人胎脑中hSNF5结合蛋白的筛选、克隆及分析

目的寻找在神经细胞中与染色质重塑复合物中hSNF5亚单位相结合的靶蛋白并探索其功能,为阐明hSNF5在细胞中参与染色质重塑复合物对靶基因调控的机制提供线索.方法以hSNF5为诱饵,采用酵母双杂交系统筛选人胎脑MATCHMAKER cDNA文库.测定核苷酸序列,计算机软件分析核苷酸的同源性及功能结构域.结果获得9个阳性克隆.DNA序列分析及同源性比较表明,1个克隆的序列与推导蛋白FLJ20643羧基端的mRNA同源性高达97%,4个克隆与GenBank中可编码蛋白的序列有较高的同源性,其他4个克隆编码的氨基酸顺序与GenBank中的已知序列无同源性.结论在人胎脑cDNA文库中克隆到hSNF5的结合蛋白,这些蛋白质可能通过hSNF5募集染色质重塑复合物以调节其靶基因的转录活性,及其参与的细胞功能.     

日本血吸虫精氨酸编码基因CDNA的分离和序列分析

【目的】分离和鉴定日本血吸虫(Schistosomajaponicum,S.j)新基因。【方法】应用免疫学方法筛选S.jcDNA文库获得阳性克隆;通过PCR直接序列测定技术,表达序列标签（EST）同源性检索对阳性克隆插入片段进行鉴定;采用亚克隆技术及生物信息学等技术,对获得的日本血吸虫精氨酸酶编码基因序列进行结构与功能的分析。【结果】获得了一个含1061bp外源插入片段的阳性克隆,其cDNA序列含有一个840bp的阅读框,编码279个氨基酸,属精氨酸酶家族,与国际蛋白质库中的酵母、蛙、人和大鼠精氨酸酶序列的同源性分别为44%,50%,51%,53%和54%。【结论】获得了编码日本血吸虫精氨酸酶编码基因全长cDNA,为日本血吸虫精氨酸酶基因功能的研究奠定了基础。     

分化抑制因子1相互作用蛋白AGGF1的筛选

目的 利用酵母双杂交方法,筛选成人肺组织文库中与分化抑制因子1(Id1)相互作用的蛋白.方法 PCR方法扩增Id1的编码序列并定向克隆入诱饵质粒pHybLex/Zeo,构建重组诱饵质粒pHybLex/Zeo-Id1,酶切鉴定后转化人酵母株EGY48/pSH18-34,检测重组诱饵质粒有无非特异激活报告基因Leu2、LacZ作用;扩增并提取成人肺组织文库质粒,将文库质粒及重组诱饵质粒转化入酵母细胞,依次筛选Leu2 ,Leu2 LacZ 克隆;设置阴性及阳性对照,重复筛选Leu2 LacZ 克隆并排除假阳性克隆,获取真阳性文库质粒,进行测序和同源性比对.结果 酶切证实,重组诱饵质粒构建成功.重组诱饵质粒转化入酵母细胞后.经检测无非特异激活报告基因作用.扩增并筛选成人肺组织文库.获得198个Leu2 及19个Leu2 LacZ 克隆.经排除假阳性克隆,最终获得1个Leu2 LacZ 真阳性克隆,经测序和同源性比较证实该克隆与蛋白AGGF1高度同源(556/559,99.5%),Westem blotting证实其在酵母细胞中有表达.结论 利用酵母双杂交方法,通过筛选成人肺组织文库,发现Id1与AGGF1存在相互作用.     

肺癌相关抗原的血清学筛选与鉴定

目的:筛选和鉴定肺癌肿瘤相关抗原,为肺癌早期诊断提供血清学标志物,并为研制肺癌疫苗提供候选抗原.方法:5份异体肺癌患者血清采用重组cDNA表达文库的血清学分析(SEREX)技术对肺癌cDNA表达文库筛选;对阳性克隆插入片段进行测序、生物信息学分析.结果:①筛选出70个阳性克隆,插入片段大小为300～2 800 bp.②测序:70个阳性克隆代表63个不同的基因.③生物信息学分析:1个基因与肺癌的发生、发展关系密切;34个基因报道与细胞的分化、代谢及信号转导等有关系,与其他肿瘤的发生、发展有关;26个基因的生理功能未见文献报道;2个插入片段未发现有同源基因,推测可能为新发现的基因.结论:使用SEREX技术成功鉴定了一组肺癌相关的肿瘤抗原.     

高原鼠兔低氧诱导因子-2α基因的克隆

目的 克隆高原鼠兔(Ochotona curzoniae低氧诱导因子-2α(Hypoxia inducible factor-2,HIF-2α)基因的cDNA部分片段,以获得HIF-2α cDNA的全长序列和进行HIF-2α的表达研究.方法 从高原鼠兔肺组织中提取总RNA,采用RT-PCR技术扩增出HIF-2α基因的c...     

丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6的反式调节基因研究

目的：筛选、克隆新基因HCBP6转染肝癌细胞后的反式调节基因，探索HCBP6基因表达对肝细胞基因表达谱的影响。方法：应用酵母双杂交技术和生物信息学(bioinfonnatics)技术，筛选得到的人HCV核心蛋白结合蛋白6(HCBP6)的基因。构建HCBP6基因的真核表达载体pcDNA3．1(-)-HCBP6，应用抑制性消减杂交技术对重组表达质粒pcDNA3．1(-)-HCBP6转染的HepG2细胞和空载体转染的相同细胞差异表达的mRNA进行研究，将富集的二次PCR产物与T／A载体连接，并转化大肠杆菌进行文库扩增，随机挑取克隆聚合酶链反应(PCR)扩增后进行测序及同源性分析。结果：消减文库扩增后得到30个阳性克隆，菌落PCR分析显示，其中24个克隆含有200—1000bp插入片段。对插入片段测序，并通过生物信息学分析，结果共获得11种蛋白编码基因。结论：应用SSH技术成功筛选了HCBP6对肝癌细胞的反式调节基因，本实验结果对初步探索新基因的功能提供重要的信息，为进一步阐明HCV核心蛋白与HCBP6相互作用后的肝细胞生物大分子变化提供了理论依据。     

日本血吸虫尾蚴(中国大陆株)表达序列标签的获取及同源性分析

目的 了解日本血吸虫尾蚴ｃＤＮＡ文库中基因的基本情况,为新基因的筛选鉴定提供依据。方法 日本血吸虫尾 蜘ｃＤＡＮ文库中的噬菌体侵入大肠杆菌ＢＭ２５．８后环化成质粒。筛选出已转入质粒的菌株。提取质粒ＤＮＡ,用质粒上 的一段测序引物序列进行一次性测序,得到一个表达序列标签（ＥＳＴ）。通过ＢＬＡＳＴｘ及ＢＬＡＳＴｎ公共数据库经编辑分 析的ＥＳＴ序列进行同源性比较。经过分析编辑后的新ＥＳＴ序列,以编写好的程序和Ｅ－ｍａｉｌ方式递交,以获得ＧｅｎＢａｎｋ 登录号。通过对同源性比较结果的总结,对该文库的基本情况进行分析。结果与结论 在测出的５８个ＥＳＴ中有３个核 苷酸序列与日本血吸虫已知基因高度同源,有２个核苷酸序列与曼氏血吸虫较高度同源,有７个ＥＳＴ的蛋白质序列与 其他物种有较高同源性而核苷酸序列同源性很低,有２７个ＥＳＴ的蛋白质及核苷酸序列同源性都很低。     

酵母双杂交系统筛选Mps1相互作用蛋白

目的：对前期筛出的与Mps1可能有相互作用的两种蛋白用酵母双杂交回转,验证与Mps1有相互作用的蛋白,为染色体分离机制研究提供线索,并为蛋门质相互作用网络提供资料。方法：应用酵母双杂交技术,将前期以pDBLeu—Mps1为诱饵质粒筛选成人肝脏cDNA文库,得到的Leu＋LacZ＋阳性克隆进一步回转酵母进行验证,即将文库质粒与诱饵质粒一对一重新转入酵母体内对相互作用进行验证。并对验证后的阳性克隆的外源片段进行测序及同源性分析。结果：用同源性分析,从人胚胎cDNA文库筛选到的与Mps1有相互作用的两个蛋白在酵母双杂交回转实验中仅有一个为阳性,另一个相互作用为阴性。结论：应用酵母双杂交系统从人胚胎cDNA文库中筛选并初步验证了与Mps1有相互作用的蛋白,为Mps1蛋白的功能研究奠定了基础．