何首乌有效成分二苯乙烯甙对神经细胞保护作用的机制

目的:观察2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖甙对两种拟痴呆细胞模型的作用,探讨何首乌主要有效成分二苯乙烯甙神经保护作用的机制,为阐明何首乌及以其为主要成分的中药复方的功效机制提供实验依据。方法:不同浓度二苯乙烯甙(5～400μmol/L)分别与SK-N-SH人神经母细胞瘤细胞共孵育6,24h,加入工具药β-amyloid25-35(终浓度25μmol/L)孵育24h或500μmol/L过氧化氢孵育2h。MTT法测定细胞存活率,细胞膜损伤测定乳酸脱氢酶漏出率(LDH%)。结果:①50～400μmol/L二苯乙烯甙与细胞预孵育6h可明显拮抗β-amyloid25-35引起的细胞存活率下降,随剂量增加,保护作用上升,至200μmol/L保护作用最强。200,400μmol/L二苯乙烯甙能拮抗β-amyloid25-35引起的细胞乳酸脱氢酶漏出率增高。5～200μmol/L二苯乙烯甙与细胞预孵育24h,可使β-amyloid25-35引起的细胞存活率下降恢复正常。200μmol/L二苯乙烯甙使β-amyloid25-35引起的细胞LDH%增多恢复正常。②5μmol/L二苯乙烯甙与细胞预孵育6h,即可明显拮抗过氧化氢引起的细胞存活率下降及LDH%增多犤LDH%:(62.47±2.43)%;MTT(A):0.1093±0.0074犦,至200μmol/L保护作用最强犤LDH%:(46.10±2.10)%;MTT(A):0.2487±0.0283犦。二苯乙烯甙与细胞预孵育24h,5～400μmol/L二苯     

二苯乙烯苷对谷氨酸致原代培养大鼠海马神经元损伤的保护作用

目的观察二苯乙烯苷对谷氨酸 (Glu)致原代培养大鼠海马神经元损伤的保护作用。方法原代培养大鼠海马神经元细胞与不同浓度的二苯乙烯苷 (5— 10 0 μmol/L)共同孵育 2 4h ,加入工具药Glu(终浓度为 5 0 0 μmol/L)孵育。四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定细胞存活率 ;乳酸脱氢酶 (LDH )漏出率法测定细胞膜损伤 ;使用荧光指示试剂Fluo 3 /AM负载后 ,在激光共聚焦显微镜下观察不同细胞内Ca2 的荧光强度。结果不同浓度的二苯乙烯苷与细胞孵育 2 4h后可明显拮抗Glu介导的神经毒性作用 ,细胞存活率明显增加 ,LDH漏出减少 ,细胞死亡率降低 ,并呈明显剂量依赖关系 ;细胞内的Ca2 荧光强度降低。结论二苯乙烯苷拮抗Glu诱导的神经毒作用的机制可能为选择性抑制大剂量Glu引起的Ca2 浓度异常升高。     

白细胞介素-1对β淀粉样蛋白胞毒及基因表达的调节作用

目的：研究B淀粉样蛋白(β-amyloid protein，Aβ)的神经元毒性作用及白细胞介素1(interleukin-1β，IL-1β)对神经细胞β淀粉样蛋白前体(β-amyloid precursor protein，APP)基因表达以及对Aβ细胞毒性的调节作用。方法：以PC12细胞作为体外神经细胞模型，应用四唑盐(MTY)法检测Aβ，IL-1β对细胞活性的影响，应用RT-PCR法半定量分析IL-1β对APP基因表达的影响。结果：Aβ具有直接的神经细胞毒作用，与浓度以及聚集状态相关，以20μmol／L孵育3h毒性最大(q=5．62，P&;lt;0．01)，而孵育7d者几乎没有毒性。IL-1β(浓度为20μg／L)与Aβ25-35(浓度为20μmol／L孵育3h)共同作用于细胞时，Aβ25—35的细胞毒作用被扩大，细胞活性从36.7％降到了13．2％(q=3．8，P&;lt;0．05)；当IL-1β(浓度为20μg／L)与Aβ25-35(20μmol／L孵育7d)共同作用时，细胞活性迅速下降，从93％降到了7．7％(q=4．83，P&;lt;0．01)。IL-1β可以刺激PC12细胞APP751、770mRNA表达增加，与对照组相比，20μg／L组APP mRNA表达增加约为2倍(q=4．76，P&;lt;0．01)，此后增加不明显；APP mRNA的表达在IL-1β(20μg／L)刺激6h达高峰，约为对照组的2倍(q=4．92，P&;lt;0.01)。结论：Aβ具有直接细胞毒作用，与浓度以及聚集状态相关。IL-1β可以扩大Aβ的细胞毒性作用。IL-1β可以刺激PC12细胞APP mRNA表达增加，具有剂量及时间依赖性。     

蛋白酶体抑制剂对多巴胺能神经元的可能保护作用

目的：分析蛋白酶体抑制剂lactacystin（乳胞素）与多巴胺能神经元变性死亡的关系，为帕金森病的治疗探索新的思路。方法：实验于2005-03／11在国家人类基因组北方研究中心完成。实验细胞人神经母细胞瘤细胞系SH—SY5Y由北京神经科学研究所提供。用50μmol／L6-羟基多巴胺处理的多巴胺能神经细胞系SH—SY5Y作为帕金森病的细胞模型，于对数生长期时接种到培养皿、6孔板、96孔板中，24h后分不同组给药处理：对照组，50μmol／L6-羟基多巴胺组；50μmol／L6-羟基多巴胺加0．1μmol／L lactacystin组、50μmol／L6-羟基多巴胺加0．25μmol／L lactacystin组、50μmol／L6-羟基多巴胺加0．5μmol／L lactacystin组。镜下细胞计数，计算细胞存活率=活细胞数／对照组活细胞数&;#215;100％。磺酰罗丹明B法测定细胞括力，在酶联免疫检测仪测定吸光度值，检测波长为540nm。吸光度值=实验组细胞孔吸光度值-空白孔细胞吸光度值。取8复孔读数均值。细胞活性=实验孔吸光度值／平行对照孔吸光度值&;#215;100％结果：①50μmol／L6-羟基多巴胺组对细胞有明显毒性，细胞存活率与对照组相比只有（51,31&;#177;3．52）％，加用0．1，0．25，0．5μmol／L lactacystin后，细胞存活率分别提高到（72.16&;#177;97）％，（82.36&;#177;3．78）％，（91.44&;#177;3．06）％，各组之间差异有统计学意义（P〈0．05）。而单用0．5μmol／L的lactacystln对细胞存活率无明显影响。②50μmol／L6-羟基多巴胺组对细胞有明显毒性可表现为细胞数量的减少，6-羟基多巴胺组细胞存活率只是对照组的（47．33&;#177;3．25）％，加用0．1，0．25，0．5μmol／L的lactacystin后，细胞存活率分别提高到（69．67&;#177;2．13）％，（80．38&;#177;1．12）％，（90．59&;#177;2．01）％，各组之间差异有统计学意义（P〈0．05）。而单用0.5μmol／L的lactacystin对细胞存活率无明显影响。③正常培养的神经元细胞密度大，轮廓清晰，突起明显，胞体折光性好,6-羟基多巴胺处理的神经元，多数细胞死亡，残存细胞突起缩短或消失，胞体皱缩，轮廓不清，胞体折光性差，6-羟基多巴胺加lactacystin处理的细胞细胞密度和形态介于前二者之间。结论：蛋白酶体抑制剂对多巴胺能神经元有保护作用，可能是通过阻断细胞凋亡，但确切机制有待于进一步的研究     

依达拉奉对淀粉样β蛋白25～35致PC12细胞氧化损伤的神经保护作用

目的：观察特异性清除羟自由基的神经保护剂依达拉奉对淀粉样β蛋白25-35诱导的PC12细胞氧化损伤的保护作用。方法：实验于2005-03／07在吉林大学中日联谊医院神经内科进行。将培养的PC12细胞分为3组：①正常对照组：加入含体积分数0．25的胎牛血清的DMEM维持液培养。②依达拉奉预处理组：加入依达拉奉20μmol／L预处理12h，然后加入淀粉样β蛋白25～35 30μmol／L继续孵育24h。③淀粉样B蛋白25～35干预组：淀粉样β蛋白25～35 30μmol／L孵育24h。采用MTT法测定细胞生存率；采用ELISA法测定羰基蛋白和晚期糖基化终产物的含量；硫代巴比妥酸法测定丙二醛的浓度。结果：①3组细胞生存率比较：正常对照组为（100．0&;#177;5.7）％，依达拉奉预处理组显著高于淀粉样β蛋白25～35干预组[（86．4&;#177;17．7炀，（42．5&;#177;9．4）％，P〈0．001]。②3组细胞内羰基蛋白含量比较：正常对照组为（0．35&;#177;0．09）μmol／g，依达拉奉预处理组显著低于淀粉样β蛋白25～35干预组[（0．41&;#177;0．12），（0．81&;#177;0．17）μmol／g，P〈0.01]。③3组晚期糖基化终产物水平比较：正常对照组为（12．21&;#177;3．26）mg／L，依达拉奉预处理组显著低于淀粉样β蛋白25-35干预组[（14.65&;#177;4．25），（26．57&;#177;5，18）mg／L，P〈0．01]。④丙二醛浓度：正常对照组为（4．11&;#177;0．98）μmol／L，依达拉奉预处理组显著低于淀粉样β蛋白25～35干预组[（4．92&;#177;1．30），（7.58&;#177;1．01）μmol／L，P〈0.01]。结论：依达拉奉能够减少淀粉样β蛋白25～35对PC12细胞内蛋白质氧化产物、晚期糖基化终产物及脂氧化终末产物的生成，具有神经保护作用。     

淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞凋亡与奥氮平的保护作用

背景：在阿尔茨海默病中起着重要作用的淀粉样β蛋白能够诱导细胞凋亡。目的：探讨奥氮平对淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞凋亡的机制及其保护作用。单位：解放军总医院南楼神经科。设计：随机设计。材料：实验于2002-05／2003-03在加拿大萨斯卡彻温大学医学院神经精神研究所完成。方法：P12细胞在RPMI1640培养液中培养。在96孔板每孔中接种100μL细胞悬液，在胶原被覆的25cm^2培养瓶中接种5mL细胞悬液，培养24h后，分别加50μmol／L、100μmol／L奥氮平培养24h，再加不同浓度的淀粉样β蛋白25～35（0．01μmol／L．2μmol／L、20μmol／L）培养24h。将收获好的96孔板以淀粉样β蛋白25～35诱导PC12细胞凋亡，采用MTT比色分析测定细胞存活率。收获25cm^2培养瓶中的PC12细胞，应用Western blot检测奥氮平对PC12细胞Bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的影响。主要观察指标：细胞存活率的测定，PC12细胞中Bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达水平。结果：①细胞存活率比较：淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞的细胞活性从75％降低到35％；50μmol／L、100μmol／L奥氮平预处理组PC12细胞的活性明显提高。②奥氮平对淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞凋亡中Bax表达的影响：0．01μmol／L，2μmol／L,20μmol／L淀粉样β蛋白25～35处理的PC12细胞Bax的表达增加，50μmol／L奥氮平预处理使淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞Bax的表达减低。③奥氮平对Aβ25～35诱导的PC12细胞凋亡中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的影响：0．001μmol／L、0．01μmol／L淀粉样β蛋白处理的PC12无变化，50μmol／L奥氮平预处理对PC12细胞表达亦无影响；2μmol／L、20μmol／L淀粉样β蛋白25～35处理的PC12细胞表达增高，50μmol／L奥氮平预处理能抑制其表达升高。结论：①淀粉样β蛋白25～35能够诱发与细胞凋亡密切相关的Bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3在培养的PC12细胞中高表达。②奥氮平具有降低其表达，提高PC12细胞存活的保护作用。     

复智散对神经细胞胞体面积和轴突长度变化的影响

背景：自制中药复智散经已往的实验证实可延缓大鼠的自然老化过程，提示该药可能具有对抗衰老作用。目的：观察复智散培养神经细胞最佳有效浓度对神经母细胞瘤株SH-SY5Y细胞形态学改变的影响设计：重复测量设计。材料：实验于2002-06／2003-04在前都医科大学宣武医院北京脑老化重点实验室完成。自制中药复智散（菖蒲、远至等6味中药组成）由哈尔滨医科大学第一临床医学院神经科王德生教授和上海东方医院神经科徐晓云教授共同组方，淀粉样β蛋白25—35片段，SH-SY5Y神经母细胞瘤株。方法：用不同浓度的复智散孵育神经母细胞瘤株SH-SY5Y细胞，利用噻唑蓝比色法测定细胞存活率，制定量一效关系曲线，寻找最佳药物浓度；6孔板培养细胞分为正常对照组、淀粉样β蛋白25—3525μmol／L组、淀粉样β蛋白25～3525μmol／L ＋复智散45&;#215;10^-3g／L组和复智散45&;#215;10^-3g／L组，孵育24h，观察细胞形态学改变，测定神经细胞的胞体面积和轴突长度主要观察指标：①各组SH-SY5Y细胞噻唑蓝代谢率的变化。②各组神经细胞胞体面积及轴突长度。结果：①复智散可增进SH-SY5Y细胞的存活，最佳有效浓度为45&;#215;10^-3g／L。②SH-SY5Y细胞胞体面积和轴突长度：淀粉样β蛋白25-3525μmol／L组明显低于正常对照组[（505．5&;#177;122．36），（599．8&;#177;141．25）μm^2；（26．0&;#177;13．97），（363&;#177;15．58）μm，（t=3．903,3．447,P=0．000）]。复智散45&;#215;10^-3g／L组与淀粉样β蛋白25—3525μmol／L＋复智散45&;#215;10^-3 g／L组均明显高于淀粉样β蛋白25—3525μmol／L组[（918．3&;#177;178．34），（896．6&;#177;257．14），（505．5&;#177;122．36）μm^2；（968&;#177;43．31），（88．3&;#177;30．23），（26．0&;#177;13．97）μm．t=10．922，14．172，P=0．000）1。结论：在淀粉样β蛋白25—35损伤条件下复智散依旧有促进培养神经细胞存活的作用，表现在增进细胞胞体面积的增长和轴突的延伸方面。     

一氧化氮对心肌细胞缺氧复氧时脂质过氧化损伤的保护作用

目的：研究一氧化氮对培养鼠心肌细胞缺氧复氧所致脂质过氧化损伤的保护作用，探讨心肌缺血修复机制。方法：采用细胞缺氧复氧损伤模型，培养细胞随机分为4组：A组正常对照组(培养3h)；B组单纯缺氧／复氧(A／R缺氧2h复氧1h)；C组缺氧预处理组(缺氧20min后复氧20min，然后缺氧复氧)；D组一氧化氮预处理组[加入S-亚硝基-已酰青酶胺(s-nitroso-n-acety1-penicil—lamine，SNAP)使其终浓度为1mmol／L，预处理40min后A／R。与复氧后测定培养液中肌酸激酶(creatine kinase，CK)、乳酸脱氢酶(1actic dehydrogenase，LDH)活性变化及细胞内丙二醛含量和细胞存活率。结果：与正常组比，单纯缺氧／复氧组CK[(941．35&;#177;152．53)nkat／L]、LDH[(7416．48&;#177;984．20)nkat／L]、丙二醛[(1．35&;#177;0．26)μmol／g]，水平显著升高(P&;lt;0．01)，细胞存活率(54．68&;#177;6．00)％显著降低(P&;lt;0．01)。1mmol／L SNAP预处理组[细胞存活率为(74．55&;#177;4．11)．CK为(582．45&;#177;140．86)nkat／L，LDH为(5766．15&;#177;941．69)nkat／L，丙二醛为(0．89&;#177;0．16)μmol／g]和缺氧预处理组[细胞存活率为(74．69&;#177;6．14)．CK为(547．94&;#177;125．52)nkat／L，LDH为(5882．34&;#177;844．67)nkat/L，丙二醛为(0．85&;#177;0．12)μmol／g]上述变化明显减轻(P&;lt;0．01)。结论：一氧化氮可抑制脂质过氧化反应，减轻自由基对心肌细胞的损伤，对细胞缺氧复氧损伤具有与缺血预处理相似的保护作用。     

同型半胱氨酸致脑微血管内皮细胞损伤及丙丁酚拮抗作用的浓度依赖性

目的：观察同型半胱氨酸对大鼠脑微血管内皮细胞的损伤及抗氧化药物丙丁酚的拮抗作用，并观察这种拮抗作用是否有浓度依赖性。 方法：实验于2004-04／10在广西壮族自治区人民医院实验中心完成。取Wistar大鼠2只，用酶溶液消化大鼠脑皮质组织制成细胞悬液再进行培养传代。①经过鉴定的大鼠脑微血管内皮细胞分为损伤组和正常对照组，正常对照组加入无血清1640培养液；损伤组分别加入用无血清的培养液配制的浓度为0．1，0．5，1．0，1．5，2．0mmol／L的同型半胱氨酸，两个组孵育2，4，6，8，10h后计算血管内皮细胞损伤的指标乳酸脱氢酶释放率。②另将细胞分为3组，正常对照组换用无血清1640培养液孵育8h；损伤组加入1．0mmol几同型半胱氨酸孵育8h：干预组分别加入终浓度为10，20，30，40，50μmol／L的丙丁酚各孵育30min后再加入1．0mmol／L同型半胱氨酸孵育8h，然后计算乳酸脱氢酶释放率。⑧将细胞分为3组：正常对照组RPMI-1640培养基常规培养；损伤组：RPMI-1640培养基＋同型半胱氨酸1．0mmol／L进行培养；干预组：RPMI．1640培养基＋丙丁酚50μmol／L30min后再加入同型半胱氨酸1．0mmol／L进行培养。一共观察7d，并画出细胞生长曲线。 结果：①同型半胱氨酸在浓度1．0mmol／L孵育时间8h时乳酸脱氢酶释放率最高，显著高于对照组[（49．06&;#177;1．07）％，（19．6&;#177;2．04）％，P〈0．011。②丙丁酚在10，20，30，40，50μmol／L时乳酸脱氢酶释放率为（45．57&;#177;1.31）%，（41．17&;#177;1．25）％，（37．9&;#177;0．69）％，（32．57&;#177;9．47）％，（26.26&;#177;2.34）%，与损伤组相比差异显著[（49．03&;#177;1．12）％，P〈0．05]，且丙丁酚浓度越高，乳酸脱氢酶释放率越低。③细胞存活数：损伤组低于干预组和对照组（P〈0．01），后两组间无差异（P〉0．05）。 结论：同型半胱氨酸对大鼠脑微血管内皮细胞有毒性损伤作用，丙丁酚10～50μmol／L呈剂量依赖性拮抗作用同型半胱氨酸所致大鼠脑微血管内皮细胞损伤。     

人参皂苷Rg1．对淀粉样β蛋白诱导大鼠海马神经元损伤的保护

目的：观察人参皂苷Rg1对淀粉样β蛋白25-35诱导的海马神经元细胞损伤是否具有保护作用，并分析其作用机制。 方法：实验于2004-03／2005-03在广州中医药大学临床药理研究所DME中心完成。①取新生24h清洁级SD大鼠，无菌环境下取出海马组织进行贴壁培养并以B27无血清培养基添加剂抑制非神经元细胞的生长。②海马神经元形态及细胞活力观察：细胞培养7d至分化成熟状态，然后被随机分为3组：人参皂苷Rg1预处理组（分为1，2,4，8，16μmol／L5个浓度组）。首先每加入各浓度的Rg1（中国药品生物制品检定所提供，批号：0703—200221）预作用24h后，再加入40μmoL／L淀粉样β蛋白25～35共孵育24h；模型组：每孔加入40μmol／L淀粉样β蛋白25-35作用24h；空白组：正常细胞培养用液；每组均为8孔。运用倒置显微镜进行海马神经元形态学观察，四甲基偶氮唑盐比色法法检澍细胞活力。即吸光度（A值），该值越高说明细胞活力越强。⑨检测核因子κB活性：调整细胞悬液密度为2&;#215;10^8L^-1，接种于6孔板（内置已用多聚赖氨酸包被的盖玻片），1mL／孔。随机分为5组（3孔／组）：正常组，模型组，2，4，8μmol／L人参皂甙Rg1预处理组。细胞培养7d后，2，4，8μmol／L人参皂甙Rg1预处理组加终浓度为2，4，8μmol／L的人参皂甙Rg1预作用24h后，与模型组一起加40μmol／L淀粉样β蛋白，作用24h。激光共聚焦显微镜检测核因子κB在细胞内的激活程度，以图像分析仪计算核区荧光与胞浆区荧光比值，比值越高说明核因子κB活性越高。④计量结果差异比较采用单因素方差分析。 结果：①神经元细胞形态：相差显微镜下可见人参皂甙Rg1预处理组细胞损伤相对较模型组轻，但较正常组严重。②海马神经元细胞活力：正常组和2，4μmol／L人参皂甙Rg1预处理组明显高于模型组（P〈0．05），以4μmol／L人参皂甙Rg1预处理组最高；1，8，16μmol／L人参皂甙Rg1预处理组虽然也高于模型组，但差异不明显（P〉0．05）。⑧神经元细胞核因子κB活性：正常组和2，4，8μmol／L人参皂甙Rg1预处理组明显高于模型组（P〈0．01），以4μmol/L人参皂甙Rg1预处理组最高；4,8μmol／L人参皂甙Rg1预处理组明显高于正常组（P〈0.01）。 结论：人参皂甙Rg1对淀粉样β蛋白25-35诱导的大鼠海马神经元损伤具有保护作用，尤以4μmol／L人参皂甙Rg1作用效果最明显。核因子κB信号通路可能是人参皂甙Rg1对抗淀粉样β蛋白25～35细胞毒性作用的重要途径之一。     

牛磺酸对经单细胞凝胶电泳技术检测人视网膜色素上皮氧化损伤的保护特征

目的：观察过氧化氢对人视网膜色素上皮细胞的氧化作用，以及牛磺酸对人视网膜色素上皮细胞的抗氧化作用。 方法：实验于2005—01／09在哈尔滨医科大学公共卫生学院中心实验室完成。①人眼视网膜色素上皮细胞来源：实验眼来自20—35岁男性意外死亡后12h内捐给黑龙江省眼库作为角膜移植的供体眼5眼，家属签署知情同意书。取8-10代人眼视网膜色素上皮细胞用于实验. ②过氧化氢损伤实验：将培养的细胞按随机数字表法分为5组：过氧化氢各浓度组分别加入终浓度为10，25，50，100μmol／L的过氧化氢，阴性对照组只加入等量的磷酸盐缓冲液。③牛磺酸实验：将培养的细胞按随机数字表法分为5组：阴性对照组用不含血清的DMEM-F12培养液培养，牛磺酸各浓度组分别用含有终浓度为300和600μmol／L的牛磺酸培养液进行培养。将上述每个浓度组的细胞悬液分成2份，向其中1份加入终浓度为25μmol几的过氧化氢，另一份加入等量的磷酸盐缓冲液。④指标检测：15min后，用单细胞凝胶电泳法检测人视网膜色素上皮细胞的DNA损伤的程度，以拖尾率（彗星细胞数／总细胞数）和拖尾细胞DNA迁移距离[400倍显微镜下测量25个拖尾细胞的DNA迁移长度，整个核DNA直径和迁移DNA（即彗星尾）长度，其差值为DNA迁移距离]的变化表示。⑤统计学分析：用四格表x^2检验（确切概论法）比较组间彗星细胞拖尾率；用t检验进行组间DNA迁移距离比较。 结果：①过氧化氢损伤实验结果：阴性对照组DNA荧光图像为红色圆球形，过氧化氢各组出现彗星样，随着过氧化氢浓度（10，25，50，100μmol／L）的增加，人视网膜色素上皮细胞拖尾率和DNA迁移距离均明显高于或长于阴性对照组[拖尾率：4．6％，26．0％，43．3％，86．6％，96．0％；DNA迁移距离：（4．13&;#177;0．52），（10．54&;#177;2．03），（20．59&;#177;4．42），（39．56&;#177;10．28），（51．54&;#177;15．93）μm，P〈0．01]。②牛磺酸实验结果：300和600μmol／L牛磺酸组视网膜色素上皮细胞拖尾率和拖尾细胞DNA迁移距离与阴性对照组相近（P〉0．05）。300和600μmol／L牛磺酸＋25μmol／L的过氧化氢组均明显低于或短于25μmol／L过氧化氢组[拖尾率：22．6％，20．0％，43．3％；DNA迁移距离：（17．46&;#177;7．13），（13．56&;#177;2．52），（20．59&;#177;4．42）μm，P〈0．05]，且牛磺酸浓度越高，差异越大。 结论：10μmol／L过氧化氢就能对人视网膜色素上皮细胞直接造成DNA断裂损伤，该作用呈剂量依赖性。适量的牛磺酸（300和600μmol／L）对人视网膜色素上皮细胞DNA的氧化断裂损伤起保护作用，该作用也呈剂量依赖性     

阿魏酸钠对淀粉样β蛋白致神经细胞损伤的保护作用

目的：通过检测阿魏酸钠对联合培养的神经细胞和巨噬细胞中神经细胞的乳酸脱氢酶漏出量和微管相关蛋白-2的影响，观察阿魏酸钠对淀粉样B蛋白激活巨噬细胞引起神经细胞损伤的保护作用。 方法：实验于2004-05／12在锦州医学院药理实验室和解剖实验室完成。选择8～10周龄的小鼠进行巨噬细胞培养，出生两三天的大乳鼠进行神经细胞培养。单独培养的神经细胞和巨噬细胞：将加入10μmol／L淀粉样β蛋白和未加入淀粉样β蛋白的巨噬细胞上清液分别移入单独培养的神经细胞中，通过Hoechst33258染色检测神经细胞的凋亡百分比。联合培养的神经细胞和巨噬细胞：联合培养24h后，加入10μmol／L的淀粉样β蛋白，阿魏酸钠组同时加入不同浓度（10μmol／L，100μmol／L，500μmol／L）阿魏酸钠共孵育。48h后．采用免疫组织化学方法和乳酸脱氢酶检测试剂盒检测微管相关蛋白-2表达水平和乳酸脱氢酶漏出量。 结果：将淀粉样β蛋白激活的巨噬细胞上清液移入到单独培养的神经细胞48h后，可使凋亡神经细胞的百分比明显增加，从正常11.3％增加到74．0％．（P〈0．01）。在巨噬细胞和神经细胞联合培养中，淀粉样β蛋白组与空白对照组相比，乳酸脱氢酶漏出量明显增加，由375nkat／L增加到2859nkat／L，微管相关蛋白-2表达阳性的神经元数目相应减少，与淀粉样B蛋白组相比，阿魏酸钠（10μmol／L，100μmol／L，500μmol／L，1mmol／L）能显著地降低乳酸脱氢酶漏出量，使微管相关蛋白-2表达阳性的神经细胞数目明显增加，呈剂量依赖性（P〈0．05）。 结论：①淀粉样β蛋白是通过激活巨噬细胞，使其释放毒性物质，从而引起神经细胞的损伤。②阿魏酸钠对淀粉样β蛋白引起的神经细胞损伤具有保护作用.     

构建游离脂肪酸诱导胰岛细胞凋亡模型验证球形脂联素的拮抗作用

目的：构建游离脂肪酸(棕榈酸)诱导胰岛细胞凋亡模型，并观察球形脂联素对胰岛细胞凋亡的拮抗作用。方法：实验于2004—15／2005—30在中山大学附属第二医院林百欣医学研究中心完成。构建游离脂肪酸诱导胰岛细胞凋亡模型及分组：采用小鼠胰岛素瘤细胞株βNIT-1，取对数生长期的细胞，按1&;#215;10^5个／孔的密度接种于6孔板，细胞生长至80％融合时将随机细胞分为3组，每组3孔，分别为对照组，棕榈酸组，棕榈酸+球形脂联素组。3组培养基均含5g／L的牛血清白蛋白、体积分数为0．03胎牛血清及体积分数为0．01的无水乙醇；棕榈酸组又加含有终浓度为500μmol／L棕榈酸；棕榈酸+球形脂联素组又加终浓度为500μmol／L棕榈酸和0．5mg／L脂联素。处理48h后终止实验。采用Hochest33342和脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法检测棕榈酸诱导胰岛细胞凋亡率和凋亡指数及脂联素处理后脂性凋亡的改善情况。结果：①经Hochest33342染色检测3组小鼠胰岛素瘤细胞株βNIT-1细胞凋亡指数明显不同(F=300．270，P&;lt;0．05)。棕榈酸组明显高于对照组[(12．40&;#177;1．57)％，(2．05&;#177;0．59)％]，说明500μmol／L棕榈酸可成功构建胰岛细胞凋亡模型，经脂联素处理后凋亡指数明显降低[(12．40&;#177;1．57)％，(3．87&;#177;0．93)％]，说明球形脂联素组对胰岛细胞凋亡有拮抗作用。②经脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法检测小鼠胰岛素瘤细胞株βNIT-1细胞凋亡指数3组明显不同(F=191．221，P&;lt;0．05)，棕榈酸组明显高于对照组[(26．33&;#177;5．6)％．(2．32&;#177;0．78)％]，说明500μmol／L棕榈酸可成功构建胰岛细胞凋亡模型，经脂联素处理后凋亡指数明显降低[(2．32&;#177;0．78)％，(4．90&;#177;0．82)％，P&;lt;0．05]说明球形脂联素组对胰岛细胞凋亡有拮抗作用。结论：①Hoescht染色法及脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法结果均表明在体积分数为0．03胎牛血清、5g／L的牛血清白蛋白的Dulbecco改良的Eagle培养液条件下加入终浓度为500μmol／L棕榈酸处理细胞48h可成功构建胰岛细胞凋亡的细胞模型。②球形脂联素可拮抗胰岛细胞的脂性凋亡，从而发挥了其调节糖脂代谢的作用。     

脑损伤保护作用的基础研究：神经元兴奋性氨基酸损伤保护模型的建立

目的：建立体外培养神经细胞N-甲基-D-天冬氨酸(N．methyl-D-aspartate，NMDA)损伤及地佐环平(MK-801)保护作用模型。方法：采用原代培养的大鼠皮质神经细胞模型，给予NMDA直接损伤，加入MK-801，在不同时间窗测定不同剂量时神经细胞损伤的形态学，及生化改变。结果：NMDA 100μmol／L组细胞死亡率和乳酸脱氢酶(LDH)漏出率分别为(54．30&;#177;3．79)％，(67．13&;#177;5．90)％，NMDA的损伤作用具有明显的浓度时间依赖性，至NMDA 1000μmol／L组细胞死亡率和LDH漏出率分别为(97．74&;#177;7．28)％，(94．10&;#177;6．31)％，MK-801具有明显的保护作用。结论：NMDA和其拮抗剂MK-801具有明显的剂量和时间依赖损伤和保护作用，LDH测定是检测其变化的良好指标，此实验可以作为神经元兴奋性氨基酸毒性损伤保护因素的检验模型。     

短肽N328—332对人神经母细胞瘤株SY5Y生长的影响

目的：分析淀粉样β蛋白前体蛋白N端328—332对人神经母细胞瘤株SY5Y生长的影响，在体外寻找具有神经营养作用、促进神经细胞生长的最适浓度，为进一步细胞损伤的保护及药物体内研究提供理论依据。方法：细胞分组：根据实验目的不同，分组处理如下：第一步分为对照组、短肽N328—3322．5，5，10，20，40，80，160μmol／L组。第二步分为对照组、短肽N328—33240μmol／L组。以MTT代谢率测定细胞存活率以筛选肽对神经细胞生长促进的最佳有效浓度。以MTT代谢率测定细胞存活率、细胞计数观察细胞增长情况、乳酸脱氢酶漏出率观察细胞死亡率和WesternBlotting检测P-CREB、Bcl-2表达水平为观察指标，分析短肽N328—332对人神经母细胞瘤株SY5Y生长的影响。结果：①从10μmoL／L起，短肽N328—332即对SY5Y细胞生长有促进作用，其最小有效浓度为20μmol／L，40μmol／L促进作用最强，80μmol／L开始作用减弱，故选用40μmol／L浓度作为以下试验浓度。（9短肽N328—33240μmol／L加药组代表细胞存话率的A值高于对照组，组问比较差异有显著性意义（0．9741&;#177;0．0047，0．6001&;#177;0．0019，P〈0．01。⑧短肽N328—33240μmmoL／L加药组乳酸脱氢酶漏出率明显低于对照组，组间比较差异有显著性意义（84．9135&;#177;31．5759，199．6252&;#177;40．7273，P〈0．01。④从接种第4天始，短肽N328—332组SY5Y细胞数增加，与对照组相比，差异有显著性意义（P〈0．05）。⑤短肽N328—33240μmol／L组P-CREB、Bcl-2蛋白表达高于对照组（37424．08&;#177;83．59，34957．24&;#177;78．03，19110．24&;#177;45．80，2761．36&;#177;58．61，P〈0．05）。结论：短肽N328—332对SY5Y细胞具有神经营养作用，40μmol／L浓度，效果优于其他浓度。     

Wnt/β-catenin信号通路激活剂对过氧化氢诱导的星形胶质细胞凋亡的影响

目的探讨Wnt/β-catenin信号通路激活剂对过氧化氢诱导的星形胶质细胞凋亡的影响。方法分离培养大鼠星形胶质细胞,分为5组,依次为:对照组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组,其中对照组用正常的细胞培养液培养,模型组用含有400μmol/L的过氧化氢孵育20 h,低剂量组、中剂量组、高剂量组先用10μM、20μM、40μM的Wnt/β-catenin信号通路激活剂LiCl处理20 h后再用400μmol/L的过氧化氢孵育20 h。用噻唑蓝(MTT)检测星形胶质细胞活力,流式细胞术检测星形胶质细胞凋亡,ELISA法检测细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)含量,硫代巴比妥酸法检测细胞中丙二醛(MDA)含量,Western blot检测细胞中活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)、β-连环蛋白(β-catenin)、c-myc蛋白表达。结果过氧化氢处理后细胞活力降低,细胞凋亡率升高,细胞中MDA含量增加,细胞培养液中LDH含量也升高。低、中、高剂量的Li Cl预处理后经过氧化氢处理后的星形胶质细胞活力升高,细胞凋亡率降低,细胞中MDA水平降低,培养液上清中LDH水平也下降,细胞中凋亡相关蛋白Cleaved Caspses-3表达水平也明显降低,并且低剂量的LiCl对星形胶质细胞的影响作用最小,高剂量的LiCl对星形胶质细胞的影响作用最大。结论 Wnt/β-catenin信号通路激活剂能够通过减弱过氧化氢对星形胶质细胞的氧化损伤减少星形胶质细胞凋亡。     

淀粉样β蛋A对小胶质细胞活化作用的体外观察

目的：观察淀粉样β蛋白对小胶质细胞活性、形态学以及分泌炎性细胞因子的作用，为阿尔茨海默病的炎性反应机制及抗炎治疗提供体外依据。方法：实验于2003—03／2004—03在解放军总医院老年医学研究所进行。应用BV-2胞作为体外小胶质细胞模型，加入不同浓度淀粉样β蛋白25-35或1-42（5，10，20，40，60μmol／L）及20μmol／L不同孵育状态（37℃孵育3，6，12，24h、3，5和7d）的淀粉样β蛋白25～35或1-42分别培养2—24h。四唑盐法检测淀粉样β蛋白对细胞活性的影响，倒置相差显微镜下观察细胞形态学改变，并应用放射免疫法测定加入淀粉样β蛋白后BV-2胞上清白细胞介素1β及白细胞介素6水平。结果：①细胞活性：淀粉样β蛋白对BV-2胞的生存活性没有影响（P均〉0．05）。②细胞形态学改变：在较低浓度时（5—10μmol／L）淀粉样β蛋白1-42就可以使BV-2胞出现明显的形态学改变（多数细胞聚集成团，有的胞体变得肥大，胞核大而圆，核仁明显；有的胞体变为梭形，由胞体伸出一个或多个较长的枝状突起），与淀粉样β蛋白1-42孵育状态有关（37℃孵育5-7d时最为明显），而淀粉样β蛋白25—35无此作用。⑨白细胞介素1β平：淀粉样β蛋白1β水平：淀粉样β蛋白1-42与25～35均可以刺激BV-2胞分泌，二者作用类似。20μmol／L淀粉样β蛋白作用6h后其水平升高，至12h达到高峰，约为对照组的3倍，此后逐渐下降（P〈0．01）。当不同浓度淀粉样β蛋白作用12h时，淀粉样β蛋白为20μmol／L时在上清中可以检测到白细胞介素1β显增加，此后随着浓度的增加其分泌也逐渐增加，至60μmol／L时为对照组的5倍（P〈0．01）。④白细胞介素6水平：各淀粉样β蛋白处理组细胞上清液均不能检测到其水平有明显变化。结论：淀粉样β蛋白对BV-2胞的生存活性没有影响，淀粉样β蛋白可以激活BV-2胞发生形态学改变并释放炎性细胞因子，但二者的作用途径不同，形态学改变与淀粉样β蛋白片段及聚集状态均有关；而分泌白细胞介素1β淀粉样β蛋白片段及聚集状态均无关，并且这种刺激作用具有时间以及浓度依赖性。     

氯胺酮对N-甲基-D-天冬氨酸诱导大鼠脊髓背角星形胶质细胞损伤的作用

背景：氯胺酮是临床常用的静脉全麻药，静脉或硬脊膜外腔用药都有镇痛作用，它是N-甲基-D-天冬氨酸受体非竞争性拮抗剂，可拮抗兴奋性氨基酸的毒性作用。 目的：观察氯胺酮对N-甲基-D-天冬氨酸受体过度激活诱导大鼠脊髓背角星形胶质细胞凋亡的影响，探讨其可能的作用机制。 设计：随机对照观察。 单位：郧阳医学院附属太和医院麻醉科。 材料：实验于2003-09／2005-01在郧阳医学院基础医学研究所细胞生物学实验室完成。由武汉大学动物实验中心提供新生两三天Wistar大鼠。 方法：取Wistar大鼠T11～L6脊髓背角星形胶质细胞原代纯化培养。胶质纤维酸性蛋白鉴定星形胶质细胞纯度达98％后用于实验。将培养细胞24孔板随机分为6组（每组9份）：①对照组加Hanks液50μL。（爹N-甲基-D-天冬氨酸组加药浓度为100μmol／L。（爹氯胺酮组加药浓度为1mmol／L。④100μmol／L N-甲基-D-天冬氨酸＋0．1mmol／L氯胺酮组。⑤100μmol／LN-甲基-D-天冬氨酸＋0．5mmol／L氯胺酮组。⑥100μmol／LN-甲基-D-天冬氨酸＋1mmol／L氯胺酮组。1mmol几氯胺酮为临床镇痛剂量。培养24h后检测超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量，免疫细胞化学观察Bcl-2蛋白和形态学变化，流式细胞仪检测星形胶质细胞凋亡率。 主要观察指标：①Bcl-2蛋白免疫组织化学苏木精-伊红复染细胞着色及形态学变化。②流式细胞仪检测星形胶质细胞凋亡率。③丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性变化。 结果：①Bcl-2平均吸光度值似）作为半定量测量Bcl-2蛋白表达水平：100μmol／LN-甲基-D-天冬氨酸组低于对照组，差异显著[分别为0．0544&;#177;．021，0．108&;#177;0．039，P〈0．01]，100μmol／LN-甲基-D-天冬氨酸＋1mmol／L氯胺酮组高于100μmol／LN-甲基-D-天冬氨酸组，差异显著[分别为0．148&;#177;0．045，0．054&;#177;0．021，P〈0．01]。②流式细胞仪检测星形胶质细胞凋亡率：100μmol／LN-甲基-D-天冬氨酸组高于对照组，差异显著[分别为（25．26&;#177;6．13）％，（5．66&;#177;2．24）％，P〈0．01]，100μmol／LN-甲基-D-天冬氨酸＋1mmol／L氯胺酮组低于100μmol／LN-甲基-D-天冬氨酸组，差异显著[分别为（24．41&;#177;4．82）％，（25．26&;#177;6．13）％，P〈0．01]。③丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性变化：100μmol／LN-甲基-D-天冬氨酸使星形胶质细胞内丙二醛含量显著升高，而超氧化物歧化酶活性明显降低；1mmol／L氯胺酮明显降低丙二醛含量，显著增强超氧化物歧化酶活性，该效应在临床镇痛剂量以内有明显量效关系，与N-甲基-D-天冬氨酸组相比差异显著（P〈0．01）。1mmol／L氯胺酮组与对照组相比、100μmol／LN-甲基-D-天冬氨酸＋0．1mmol/L几氯胺酮组与N-甲基-D。天冬氨酸组相比差异均无显著性。 结论：N-甲基-D-天冬氨酸受体过度激活可诱导大鼠脊髓背角星形胶质细胞大量凋亡，适量氯胺酮显著抑制细胞凋亡，其机制可能增强星形胶质细胞Bcl-2蛋白表达，同时抑制自由基的产生和增强超氧化物歧化酶活性。     

莫诺苷抑制过氧化氢诱导的SH-SY5Y神经细胞钙超载和细胞毒

目的 研究莫诺苷抑制过氧化氧诱导的SH-SY5Y神经细胞钙超载和细胞毒作用.方法 体外培养的人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞分别加入莫诺苷1μmol/L、10μmol/L、100 μmol/L预孵育24 h,加入H2 O2 300～500 μmol/L,作用18 h,检测细胞内游离钙离子浓度、乳酸脱氢酶(LDH)释放率.结果 与未加莫诺苷预孵育的细胞相比,莫诺苷10μmol/L、100μmol/L能抑制神经细胞内游离钙离子浓度增加,莫诺苷1μmol/L、10μmol/L、100 μmol/L能降低LDH的释放率.结论 莫诺苷能够抑制H2O2诱导的SH-SY5Y神经细胞钙超载和细胞毒,有神经保护作用.     

比较猪去氧胆酸与牛磺熊去氧胆抗神经细胞缺氧缺糖再给氧损伤的作用

目的：研究猪、熊胆粉的主要成分猪去氧胆酸及牛磺熊去氧胆对神经细胞缺氧缺糖再给氧损伤的保护作用。方法：实验于2000-07／2002-08在北京中医药大学中医内科学教育部重点实验室完成。培养人神经母细胞瘤细胞，以含连二亚硫酸钠的无糖Earle液模拟造成缺氧缺糖再给氧损伤，随机分为正常培养对照组，缺氧缺糖再给氧组，猪去氧胆酸3.125，1．563，0.781μmol／L浓度组，牛磺熊去氧胆3.125，1.563，0.781μmol／L浓度组。应用锥虫蓝染色测定细胞死亡率，应用比色法测定乳酸脱氢酶漏出率，四甲基偶氮唑蓝比色法测定细胞存活率，应用以Hoechst33342和碘化丙啶原位双染法荧光显微镜检测细胞坏死率和凋亡率。结果：①细胞死亡率：猪去氧胆酸、牛磺熊去氧胆3．125，1563．0．781μmol／L浓度组细胞死亡率均明显低于缺氧缺糖再给氧组[(34．1&;#177;7.1)％，(32.8&;#177;8．2)％，(29.4&;#177;9．8)％，(27.7&;#177;6.9)％，(26.8&;#177;9．4)％，(26.2&;#177;11.1)％，(71.2&;#177;9.2)％，P&;lt;0.001]。②乳酸脱氢酶漏出率：猪去氧胆酸、牛磺熊去氧胆3.125，1.563，0.781μmol／L浓度组乳酸脱氢酶漏出率均明显低于缺氧缺糖再给氧组[(46．6&;#177;5.6)％，(49.8&;#177;5.3)％，(47．0&;#177;4.0)％，(48.5&;#177;2.7)％，(44.1&;#177;4.3)％，(40．2&;#177;7.5)％，(66.4&;#177;7．6)％，P&;lt;0.001)。③细胞存活率：猪去氧胆酸、牛磺熊去氧胆3．125，1．563，0.781μmol／L浓度组细胞存活率均明显高于缺氧缺糖再给氧组[(44.5&;#177;3.2)％，(45.3&;#177;2．0)％，(41.5&;#177;1．6)％，(41．6&;#177;2.4)％，(37.6&;#177;2．8)％，(40．1&;#177;18)％，(25.6&;#177;3．7)％，P(0.01～0.051。④细胞坏死率：猪去氧胆酸、牛磺熊去氧胆3．125，1．563，0．781μmol／L浓度组细胞坏死率均明显低于缺氧缺糖再给氧组[(19.7&;#177;6.2)％，(23.9&;#177;7.0)％，(26.0&;#177;6.9)％，(21.8&;#177;5．6)％，(18.7&;#177;6.1)％，(25.4&;#177;5．8)％，(46.8&;#177;10.4)％，P&;lt;0.01]。⑤细胞凋亡率：猪去氧胆酸3．125，1．563μmol／L浓度组和牛磺熊去氧胆3．125，1.563，0.781μmol／L浓度组明显低于缺氧缺糖再给氧组[(7.4&;#177;2.7)％，(8.3&;#177;4.0)％，(6.9&;#177;3.8)％，(9.2&;#177;4.5)％，(8．7&;#177;3.6)％,(16．0&;#177;4.8)％，P&;lt;0．05]。结论：猪去氧胆酸、牛磺熊去氧胆酸均可明显地降低神经细胞缺氧缺糖再给氧损伤时的细胞坏死率、凋亡率，显著提高细胞存活率，显著减少乳酸脱氢酶的漏出，表明猪去氧胆酸、牛磺熊去氧胆酸均具有显著的抗神经细胞缺氧缺糖再给氧损伤的作用，并且猪去氧胆酸与牛磺熊去氧胆酸之间没有显著差异。