连翘苷人工抗原的合成及免疫原性鉴定

基于高特异性,高灵敏度的小分子单克隆抗体的免疫分析方法的建立,对中药小分子化合物的的研究具有重要的意义,其中,小分子人工抗原的合成是中药小分子抗体制备的关键步骤。采用高碘酸钠氧化法分别合成连翘苷免疫抗原（FRn-BSA）和包被抗原（FRn-OVA）,通过紫外光谱和薄层色谱法检测到连翘苷成功与BSA/OVA偶联,小鼠经FRn-BSA免疫后,体内可产生抗连翘苷抗体,效价在1：8 000左右,线性范围为1~100 mg·L^-1。成功合成的连翘苷人工抗原,可为下一步的单克隆抗体制备以及相应免疫方法的建立奠定基础。     

白芍、赤芍及芍药苷、芍药内酯苷对综合放血法致血虚小鼠补血作用的比较研究

目的: 研究白芍、赤芍及其有效成分芍药苷、芍药内酯苷对血虚小鼠的补血作用. 方法: 采用综合放血法复制小鼠血虚模型,灌胃给予白芍水提物、赤芍水提物,检测小鼠外周血象,根据实验结果和白芍、赤芍水提物中芍药苷、芍药内酯苷的含量,进一步采用同一实验方法进行芍药苷、芍药内酯苷补血作用比较研究. 结果: 造模第7天,2 g·kg^-1白芍和2 g·kg^-1赤芍对红细胞和血红蛋白升高作用明显(P<0.01);造模第14天,2 g·kg^-1白芍对红细胞和血红蛋白升高明显(P<0.01),2 g·kg^-1赤芍作用不明显,同剂量组相比,红细胞数和血红蛋白含量差异不显著;造模第7天,120 mg·kg^-1芍药苷、120 mg·kg^-1芍药内酯苷对小鼠红细胞和血红蛋白升高作用明显(P<0.01),60 mg·kg^-1芍药内酯苷、30 mg·kg^-1芍药内酯苷对红细胞和血红蛋白有提升作用(P<0.05);造模第14天,120 mg·kg^-1芍药苷、芍药内酯苷对红细胞、血红蛋白有较好的提升作用,与同剂量组的芍药苷相比,120,30 mg·kg^-1芍药内酯苷的红细胞数升高明显,差异显著(P<0.05);30 mg·kg^-1芍药内酯苷组的血红蛋白含量明显升高,差异显著(P<0.05). 结论: 白芍的补血作用略优于赤芍;芍药内酯苷具有补血作用且补血作用优于芍药苷;白芍有较强的补血作用可能与白芍中含有的芍药内酯苷有关.     

芍药内酯苷和芍药苷对环磷酰胺致血虚小鼠的补血作用及对GM-CSF,IL-3,TNF-α影响的比较研究

目的: 比较研究芍药内酯苷、芍药苷对环磷酰胺致血虚小鼠的补血作用及机制. 方法: 采用环磷酰胺法复制小鼠血虚模型,灌胃芍药内酯苷、芍药苷单体提取物,检测小鼠外周血象、胸腺与脾脏指数及分离血清检验粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-3(IL-3)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α),比较二者的补血作用及机制. 结果: 芍药内酯苷30 mg·kg^-1与芍药苷30 mg·kg^-1均能升高白细胞数(P<0.01);芍药内酯苷30 mg·kg^-1与芍药苷30 mg·kg^-1均能升高红细胞数(P<0.01,P<0.001).芍药内酯苷30 mg·kg^-1的胸腺指数明显升高(P<0.01),芍药苷30 mg·kg^-1的胸腺指数则无升高作用,二者相比,芍药内酯苷优于芍药苷(P<0.05);芍药内酯苷15 mg·kg^-1的胸腺指数明显升高(P<0.01),芍药苷15 mg·kg^-1的胸腺指数无升高作用,二者之间相比,无统计学差异.芍药内酯苷30 mg·kg^-1(P<0.01)、芍药内酯苷15 mg·kg^-1(P<0.05)、芍药苷30 mg·kg^-1(P<0.01)与芍药苷15 mg·kg^-1(P<0.05)均能升高GM-CSF的含量.芍药内酯苷30 mg·kg^-1与芍药苷30 mg·kg^-1均能升高IL-3(P<0.001).芍药内酯苷30 mg·kg^-1与芍药苷30 mg·kg^-1均能降低TNF-α(P<0.01),二者相比,有明显统计学差异(P<0.01),芍药内酯苷优于芍药苷. 结论: 芍药内酯苷和芍药苷能够通过机体的免疫调节作用对抗环磷酰胺导致的血虚状态,且芍药内酯苷对造血负向调控因子的作用更强,与芍药苷协同发挥作用,是白芍养血柔肝功效的重要成分.     

芍药苷、芍药内酯苷对放射线辐照法致血虚小鼠的补血作用

目的:研究赤芍、白芍有效成分芍药苷、芍药内酯苷对放射线辐照法致小鼠血虚模型的补血作用。方法:采用放射线辐照法制作小鼠血虚模型,灌胃给予白芍水提物、赤芍水提物,检测小鼠外周血象,根据实验结果和赤芍、白芍中芍药苷、芍药内酯苷的含量,进一步采用同一实验方法进行芍药苷、芍药内酯苷补血作用比较研究。结果:造模第7天,赤芍2 g·kg-1、白芍2 g·kg-1的白细胞与模型组相比有显著提高(P<0.05)。芍药苷120 mg·kg-1、芍药内酯苷120 mg·kg-1的白细胞数在造模第7天升高明显(P<0.05);造模第10天,芍药苷120 mg·kg-1的白细胞较模型组升高明显(P<0.05);同剂量组芍药苷、芍药内酯苷比较无统计学差异。结论:赤芍与白芍、芍药苷与芍药内酯苷均可升高放射线辐照法致血虚小鼠的白细胞数量,具有补血作用;芍药内酯苷与芍药苷对该模型升高白细胞的作用类似,是白芍补血作用的有效成分之一,芍药苷是赤芍与白芍升高白细胞补血作用的共同有效成分。     

芍药苷对LPS脑损伤模型小鼠氧化应激和能量代谢的影响

该文主要研究芍药苷(paeoniflorin,Pae)对脂多糖(LPS)诱导的小鼠急性脑损伤的保护作用。实验中将雄性Bal b/c小鼠随机分为正常组、模型组、芍药苷低及高剂量组4组。腹腔注射生理盐水或Pae(10,30 mg·kg^-1)每日1次,连续6 d。第7天除正常对照组,其他组给药1 h后腹腔注射LPS(5 mg·kg^-1),建立急性内毒素炎症模型,6 h后制备脑匀浆进行相关指标测定。比色法检测脑组织匀浆中的丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、总抗氧化能力(T-AOC)、过氧化氢(H₂O₂)、琥珀酸脱氢酶(SDH)、Na⁺-K⁺-ATP酶以及Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶活力;Western blot法检测脑组织中HO-1,Nrf2蛋白表达水平。研究发现芍药苷可降低LPS脑损伤模型小鼠脂质过氧化物MDA水平,提高脑组织中SOD和GSH-Px活性,提高T-AOC,降低H₂O₂水平;提高SDH、Na⁺-K⁺-ATP酶以及Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶活力。与对照组相比,LPS模型组小鼠脑组织核内Nrf2蛋白水平轻度上调,诱导HO-1蛋白表达增加,芍药苷可明显激活Nrf2的核转位,并且显著上调HO-1蛋白水平。结果提示芍药苷减轻LPS诱导的小鼠急性炎症脑损伤,可能与其抗氧化作用以及改善能量代谢有关。     

高效液相色谱-质谱联用法研究芍药苷的大鼠小肠吸收

 目的研究芍药苷的大鼠小肠吸收,探讨芍药苷的吸收机制及其影响因素。方法使用高效液相色谱-质谱联用技术,采用肠外翻模型,测定不同质量浓度芍药苷溶液在大鼠空肠和回肠的吸收,同时观察加入聚山梨醇酯-80和P-糖蛋白抑制剂维拉帕米对芍药苷吸收的影响。结果在20～120mg·L^-1内,芍药苷吸收未饱和,呈线性吸收,在低质量浓度下空肠与回肠吸收速率无明显差异,中、高质量浓度时回肠吸收速率要高于空肠,2g·L^-1的聚山梨醇-80对空肠吸收有促进作用,维拉帕米对芍药苷吸收有显著促进作用。结论芍药苷在小肠外翻模型中吸收遵循一级动力学,芍药苷在不同肠段的吸收有差异,芍药苷是P-糖蛋白的底物,聚山梨醇-80有利于提高芍药苷的吸收。     

RP-HPLC同时测定赤芍3种化学成分

 目的建立了用RP-HPLC对赤芍中芍药苷、芍药内酯苷以及苯甲酸同时定量的方法，并对不同产地赤芍进行考察。方法高效液相色谱法，色谱柱HypersilC₁₈(200 mm×4.6 mm)，流动相：乙腈-水(12∶88)，磷酸调pH=3.0，流速为0.8 mL·min^-1，检测波长为230nm，柱温为室温。用内标法同时测定了赤芍中芍药苷、芍药内酯苷及苯甲酸的含量。结果芍药苷、芍药内酯苷及苯甲酸浓度与峰面积呈良好的线性关系。平均回收率芍药苷为98.6%，RSD为3.0%；芍药内酯苷为98.6%，RSD 为3.1%；苯甲酸为96.3%，RSD为3.2%。结论 本方法测定了17个不同产地、不同批号赤芍样品中3种化学成分的含量，该方法分离度好，快速，简便，重现性好。     

芍药苷和芍药内酯苷的抗抑郁作用与NO/cGMP信号转导通路的相关性

目的:比较赤芍、白芍及其有效成分芍药苷、芍药内酯苷对小鼠的抗抑郁作用及其与NO/c GMP信号转导通路的相关性。方法:选取小鼠悬尾实验模型,给予赤芍水提物、白芍水提物,记录小鼠悬尾不动时间。采用相同实验方法给予小鼠芍药苷和芍药内酯苷,并检测小鼠大脑皮质及海马组织中NO/c GMP通路相关指标。结果:与模型组比较,2 g/kg赤芍和2 g/kg、1 g/kg白芍组小鼠悬尾不动时间减少,差异有统计学意义(P0.05)。与2 g/kg赤芍同剂量组比较,白芍的小鼠悬尾不动时间减少,差异有统计学意义(P0.05)。与模型组比较,20 mg/kg芍药苷组、20 mg/kg芍药内酯苷组的小鼠悬尾不动时间及NO、c GMP含量明显减少,差异有统计学意义(P0.05);且与10 mg/kg芍药苷同剂量组比较,芍药内酯苷组的小鼠悬尾不动时间及NO含量明显减少,差异有统计学意义(P0.05)。与模型组比较,20 mg/kg芍药苷组及20mg/kg芍药内酯苷组的小鼠n NOS、GluR1mRNA表达明显减少,差异有统计学意义(P0.05)。结论:白芍具有抗抑郁作用,芍药苷和芍药内酯苷是白芍抗抑郁作用的物质基础;与白芍比较,赤芍的抗抑郁作用较弱,与其主要含有抗抑郁作用较弱的芍药苷,而不含抗抑郁作用较强的芍药内酯苷有关。     

分子印迹技术分离桂枝茯苓胶囊中芍药苷类活性组分成分

目的：芍药苷类化学成分是桂枝茯苓胶囊中主要活性成分,研究从桂枝茯苓胶囊中定向分离芍药苷及其结构类似物的方法。方法：应用溶胶-凝胶法制备芍药苷分子印迹聚合物,并考察其吸附性能,同时利用该分子印迹聚合物从桂枝茯苓胶囊甲醇溶液中直接分离得到芍药苷活性组分。结果：合成芍药苷分子印迹聚合物（MIP）最大表观结合位点数Qmax=52.28 mg·g^-1,4 g桂枝茯苓胶囊甲醇溶液通过一步分离,共制得芍药苷及其结构类似物197 mg,芍药苷纯度89.3%。结论：芍药苷分子印迹聚合物能够从桂枝茯苓胶囊中定向分离得到芍药苷类成分。     

不同产地和部位赤芍中芍药苷的含量测定

目的：积累野生和栽培芍药中芍药苷含量在不同产地和部位间的变异数据,为制定切实可行的质量控制标准提供依据。方法：采用HPLC法,Zorbax Rx-C₁₈柱(4.6 mm×250 mm),粒径5 μm,流动相乙腈-水(17∶83),流速1.0 ml.min^-1,检测波长230 nm,灵敏度0.1 AUFS。结果：芍药根茎中芍药苷含量近于或略高于根,枯根中含量也不低,说明单一指标尚不足以控制其质量;野生品赤芍中芍药苷含量普遍高于栽培品,大致以3%为分界线,故提出赤芍中芍药苷含量不低于3.5%的建议;在所采用的HPLC条件下,野生品图谱只有芍药苷一个主峰,而所有栽培品在芍药苷峰之前还有一个主峰,可作为赤芍和白芍的定性鉴别指标。结论：样品直接取自原产地,其代表性、典型性和覆盖面都是前所未见的,故建议国家标准、地方标准、企业标准采用本建议。     

芦丁完全抗原的合成鉴定及免疫原性分析

目的:合成中药活性成分芦丁的完全抗原并进行鉴定及免疫原性研究,同时建立快速检测芦丁的酶联免疫吸附(ELISA)分析方法.方法:采用高碘酸钠法制备芦丁完全抗原,用紫外扫描和SDS-PAGE的方法对其进行鉴定,以此抗原免疫健康雄性新西兰大白兔,制备抗血清.结果:紫外分析表明合成的完全抗原偶联比为13∶1,SDS-PAGE显示完全抗原与牛血清蛋白或卵清蛋白相比后移了.免疫新西兰大白兔得到特异针对芦丁的抗血清,芦丁抗体的效价为1∶4 000.经方法学考察,灵敏度IC50为5.37 mg ·L-1,最低检测限为1 mg·L-1,平均添加回收率为102％,批内和批间RSD均小于10％,抗体与其他类似物的交叉反应率小于1％.结论:成功的合成了具有较好的免疫原性的芦丁完全抗原,并成功的建立了快速检测芦丁的酶联免疫吸附(ELISA)方法.     

多途径综合分析比较芍药苷及芍药提取物的吸收差异

目的:多途径比较单体芍药苷与提取物中芍药苷在大鼠肠道的吸收差异。方法:采用大鼠肠灌流模型同时收集肠灌流液、胆汁及血浆样品,结合肠道酶共孵育试验及表观油水分配系数的测定,多途径综合分析比较单体芍药苷与提取物中芍药苷在大鼠肠道的吸收差异。结果:相同浓度下,不同肠段芍药提取物中芍药苷在大鼠肠道的有效渗透系数Peff*均高于单体芍药苷,尤其是在空肠及回肠肠段(P<0.05),但单体芍药苷及提取物中芍药苷在4个肠段的Peff*均较小(Peff*<0.5),单体芍药苷的Peff*在0.209～0.290,提取物中芍药苷的Peff*在0.252～0.333;提取物及单体的胆汁样品、血浆样品及肠道酶共孵育样品中均未检测到芍药苷及其代谢产物。结论:和单体芍药苷相比提取物中芍药苷在大鼠肠道的吸收有明显提高,表明提取物中可能存在其他促吸收成分,但由于芍药苷总体吸收较差,这种影响在短时间(1～3 h)内并未能提高吸收入血及胆汁中芍药苷的含量。     

苯巴比妥单克隆抗体的研制及竞争ELISA血药浓度监测方法的建立

 目的研制苯巴比妥单克隆抗体(PBmAb),建立PB血药浓度竞争ELISA监测方法。方法将PB改造成对氨基苯巴比妥(pAPB),用重氮化法合成免疫原BSA-pAPB并免疫Balb/c小鼠;细胞融合技术筛选PB mAb杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备PB mAb;应用PB mAb研制PB血药浓度监测竞争ELISA试剂盒(PB-Kit),并测定其性能。结果BSA-pAPB偶联成功;筛选出4株杂交瘤细胞,应用其中最好的4E6株制备的PB mAb间接ELISA效价为1∶6.4×10⁵,亲和常数(K_a)为2.08×10¹⁰L·moL^-1,50%抑制浓度(IC₅₀)为9.84μg·L^-1,与巴比妥的交叉反应率(CR)为7.9%,与其他化合物无CR;PB-Kit的检测范围为1.0～128μg·L^-1,灵敏度为0.89μg·L^-1,检测限为1μg·L^-1,血清样添加回收率为94.7%,批内和批间变异系数均<10%;PB-Kit与差示分光光度法(DS)的符合率为100%。结论成功研制出高价、敏感、特异的PB mAb,建立了PB血药浓度竞争ELISA监测方法。     

在体皮肤微透析分析制川乌-白芍配伍对芍药苷局部药代动力学的影响

目的:考察制川乌对白芍中芍药苷经皮转运的影响,从经皮转运角度研究制川乌-白芍配伍协同增效作用机制。方法:以昆明种清洁级小鼠为实验对象,分别经皮给予白芍凝胶、制川乌-白芍凝胶和白芍-氮酮凝胶,采用皮肤微透析取样技术,建立HPLC测定透析液中芍药苷的浓度,流动相乙腈-0.1%磷酸水溶液(14∶86),检测波长230 nm;利用DAS 2.0软件计算局部药动学参数,采用扫描电镜考察药物对小鼠皮肤角质层的影响。结果:白芍凝胶组的药时曲线下面积(AUC_(0-t)),平均滞留时间(MRT_(0-t)),半衰期(t_(1/2)),达峰时间(T_(max))和药峰浓度(C_(max))分别为(3.28±1.01)mg·L~(-1)·h,(3.95±0.32)h,(0.92±0.44)h,(2.00±0)h和(0.72±0.24)mg·L~(-1);白芍-制川乌凝胶组MRT_(0-t),AUC_(0-t),t_(1/2),T_(max)和C_(max)分别为(3.35±0.08)h,(10.64±1.24)mg·L~(-1)·h,(1.32±0.67)h,(1.00±0)h和(3.06±0.38)mg·L~(-1),白芍-氮酮凝胶组AUC_(0-t),MRT_(0-t),t_(1/2),T_(max),C_(max)分别为(59.82±13.51)mg·L~(-1)·h,(3.67±0.08)h,(0.89±0.16)h,(2.67±0.29)h和(13.24±4.14)mg·L~(-1)。与白芍凝胶组比较,制川乌-白芍凝胶组AUC_(0-t)和C_(max)均显著增大,T_(max)明显缩短。扫描电镜观察结果表明制川乌作用皮肤后,角质层细胞间隙明显增加,且与氮酮对皮肤的作用类似。结论:制川乌-白芍配伍能显著提高芍药苷的透皮吸收,达到配伍"增效"的目的,这可能与制川乌降低角质层的屏障作用有关。     

芍药苷对利血平诱导抑郁模型的影响

目的:研究芍药苷对利血平诱导小鼠抑郁模型的行为以及脑组织中单胺递质含量的影响。方法:动物随机分为6组,即对照组、模型组、盐酸氯米帕明40 mg·kg-1组、芍药苷(50,100,200 mg·kg-1)组,均按10 mL·kg-1灌胃给药。每日1次,连续给药7 d,利用利血平诱导小鼠抑郁模型,观察芍药苷的抗抑郁作用。采用HPLC检测小鼠脑组织中单胺递质含量变化。结果:芍药苷(100,200 mg·kg-1)连续灌胃给药7 d可显著提高小鼠抑郁模型体温(P<0.05,P<0.01),芍药苷(200 mg·kg-1)可改善眼睑下垂(P<0.01)及运动不能(P<0.05);并可明显升高脑组织中去甲肾上腺素(NE)(P<0.01和P<0.001)和5-羟色胺(5-HT)(P<0.05,P<0.001)含量。结论:芍药苷具有一定的抗抑郁作用,其机制可能与调节单胺递质含量有关。     

中国大虎头蜂蜂毒毒性及其F(ab)2抗体的制备研究

 目的测定中国大虎头蜂蜂毒毒性,制备能有效中和中国大虎头蜂蜂毒的F(ab)₂抗体。方法小鼠腹腔注射测定胡蜂毒LD₅₀,以胡蜂毒免疫日本大耳白兔获得免疫血浆,经盐析、酶解、加热等步骤获得F(ab)₂抗体,并以免疫扩散、ELISA和小鼠体外中和法分别测定超免血浆、纯化的IgG及制备的F(ab)₂抗体对中国大虎头蜂及多种蛇毒的抗体效价。结果小鼠腹腔注射中国大虎头蜂蜂毒的LD₅₀为0.697mg·kg^-1,制备的F(ab)₂抗体SDS-PAGE电泳纯度为94.3%;ELISA检测结果表明纯化的IgG质量浓度为1×10^-9mg·mL^-1时对胡蜂毒素为阳性;免疫扩散结果表明制备的F(ab)₂抗体与中国大虎头蜂毒素（1∶1）时出现明显沉淀线,该抗体与胡蜂毒质量比（3.5∶1）时可保护小鼠100%存活。结论首次利用胡蜂毒免疫动物制备高纯度F(ab)₂抗体,该抗体可有效中和抗中国大虎头蜂毒蜂毒,并对银环蛇毒具有交叉中和作用。     

肠道菌群对冠心Ⅱ号方中芍药苷降解作用的研究

 目的建立高效液相色谱法,观察芍药苷在大鼠粪便中的降解特征及其影响因素。方法培养液中的芍药苷经适当处理后以乙腈/水为流动相(1.0 mL·min^-1)通过C₁₈反相柱进行分离,在紫外波长230 nm下检测。制备芍药苷样品的水溶液(PPE)、赤芍水煎液(PR)、丹参加赤芍的水煎液(SMPR)以及冠心II号(GXⅡ)的水煎液,分别与大鼠新鲜粪便在无氧条件下培养,不同时间采样测定。药物浓度的变化应用NONMEM软件以不同的动力学模型进行解析。结果所建高效液相色谱法可以满足本研究中芍药苷测定的要求,在浓度范围0.787 5～39.38 mg·L^-1区间内符合线性,日内、日间的变异均小于5%。芍药苷不同组方与大鼠粪便共同培养后约在1 h之后出现降解,降解启动时间,降解速率,以及降解的方式随着芍药苷组方的不同而有所不同。结论多数情况下肠道菌群对芍药苷的降解符合一级动力学过程,但是冠心Ⅱ号组中芍药苷的降解更接近于零级动力学过程。