支气管肺发育不良新生鼠模型肺泡上皮细胞标志物的表达变化及意义

目的 研究高氧致支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)新生鼠模型中Ⅰ型肺泡上皮细胞(typeⅠalveolar epithelial cells,AECⅠ)和Ⅱ型肺泡上皮细胞(typeⅡalveolar epithelial cells,AECⅡ)特异性标志物表达变化及其意义.方法 80只新生Wistar大鼠,于生后12 h内随机分为模型组(吸入氧浓度为85%)和对照组(吸入空气),每组40只.于暴露第7、14、21天,分别进行肺组织HE染色观察病理学改变,免疫荧光双标染色观察AECⅠ标志物水通道蛋白5(aquaporin 5,AQP5)及AECⅡ标志物表面活性蛋白C(surfactant protein C,SP-C)表达及定位,Western blot方法检测AQP5和SP-C的蛋白表达水平,real-time PCR方法检测AQP5和SP-C的mRNA表达水平.结果 模型组大鼠肺组织表现出肺泡数目减少,体积增大,结构简单化,肺泡间隔增厚,次级分隔减少等肺泡化障碍表现.免疫荧光双标染色可见,模型组AQP5及SP-C表达明显增多,表达位置紊乱,且双染细胞/SP-C阳性细胞的比例明显增高(P<0.001).与对照组比较,模型组中AQP5及SP-C蛋白表达从高氧暴露7 d开始增加,增高的趋势持续至21 d.模型组中mRNA表达水平,AQP5从暴露7 d开始,SP-C从14 d开始较对照组明显升高(P<0.05),且两组间差异随高氧暴露时间延长更加明显(P<0.05).结论 暴露高氧中的新生鼠BPD模型肺组织中,AECⅠ标志物AQP5及AECⅡ标志物SP-C均表达上调,发生转分化的AECⅡ明显增多,表明在BPD肺损伤后的修复中存在AECⅡ过度转分化现象.     

高氧暴露对新生鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞转分化水平的调节作用

目的 研究体内及体外高氧暴露对Ⅱ型肺泡上皮细胞(typeⅡalveolar epithelial cells,AEC Ⅱ)转分化水平的影响,旨在阐明支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)肺上皮损伤的发生机制.方法 新生Wistar大鼠生后随机分为对照组(吸入空气)和模型组(吸入氧浓度为85％),于7d、14 d、21 d进行动物模型肺组织取材并分离AECⅡ.细胞标本检测Ⅰ型肺泡上皮细胞(type Ⅰalveolar epithelial cells,AEC Ⅰ)特异性标志物水通道蛋白5(aquaporin 5,AQP5)及AECⅡ标志物表面活性蛋白C(surfactant protein C,SP-C)表达.从正常新生鼠肺分离的AECⅡ在体外原代培养24h后随机分为常氧组(21％ O2)和高氧组(85％ O2),培养48 h后收集细胞,应用免疫荧光双标染色观察AQP5和SP-C表达及定位,Western blot方法检测AQP5和SP-C蛋白表达水平,荧光实时定量PCR方法检测AQP5和SP-CmRNA表达水平.结果 BPD模型组大鼠AECⅡ中AQP5蛋白表达从7d开始较对照组增多,SP-C蛋白表达从14 d开始较对照组减少.模型组中AQP5 mRNA从7d开始表达增多,SP-C mRNA从7d开始表达减少(P＜0.05),且随高氧暴露时间延长两组间差异更加显著.由正常新生鼠肺分离的AECⅡ进行体外原代培养后,免疫荧光双染可见高氧组较常氧组AQP5表达增多,SP-C表达减少,双染细胞明显增多.蛋白和mRNA定量检测结果均提示高氧组较常氧组AQP5表达增多,SP-C表达减少(P＜0.01).结论 无论体内还是体外高氧暴露下,AECⅡ特异性标志物SP-C表达下调,而AEC Ⅰ特异性标志物AQP-5表达上调,提示AECⅡ过度转分化参与高氧肺损伤后的修复过程.     

降钙素基因相关肽调控细胞外信号调节激酶减轻高体积分数氧对胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的损伤作用

目的 探讨降钙素基因相关肽(CGRP)对高体积分数氧(高氧)暴露下胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞( AECⅡ)氧化损伤的影响,及其作用是否由细胞外信号调节激酶(ERK)所介导.方法 原代分离培养孕21 d胎鼠AECⅡ,培养12 h待细胞贴壁后分为6组:空气组、空气CGRP组、空气CGRP拮抗剂组、高氧组、高氧CGRP组、高氧CGRP拮抗剂组.空气组和高氧组分别在氧体积分数为210 mL·L-1的空气或850 mL·L-1的氧气中培养18 h.CGRP组和CGRP拮抗剂组分别在空气或高氧暴露前加入CGRP或同时加入CGRP和其受体拮抗剂CGRPS-37,终浓度分别为10-8 mol·L-1和10-7 mol·L-1.用免疫比浊法测定培养液LDH、AKP和丙二醛(MDA)水平,流式细胞术测定细胞内活性氧(RoS)水平,荧光显微镜检测胞质表面活性蛋白C(SP-C)的表达情况,Western blot检测磷酸化ERK1,2(p-ERK1/2)的表达水平.结果 高氧组MDA、LDH、AKP、ROS及p-ERK1/2水平均明显高于空气组[(2.29±0.10) μmol ·L-1 vs (1.06 ±0.14)μmol·L-1,( 58.79±5.01)U·L-1 vs(25.92±3.68)U·L-1,(24.63±2.92)U·L-1 vs (10.34±1.78)U·L-1,47.74±3.35 vs 25.96±5.04,1.21±0.06 vs 0.45±0.05,Pa＜0.01],而细胞内SP-C表达则明显低于空气组(22.75±3.31 vs 43.50±4.42);与高氧组及高氧CGRP拮抗剂组比较,高氧CGRP组MDA、LDH、ROS及AKP水平显著降低,而p-ERK1/2及SP-C的表达水平则明显增高(Pa＜0.01).空气组、空气CGRP组、空气CGRP拮抗剂组组间MDA、LDH、ROS、AKP及SP-C表达水平比较差异均无统计学意义;空气CGRP组p-ERK1/2表达水平明显高于空气组及空气CGRP拮抗剂组(Pa＜0.01).结论 CGRP可减轻高氧对AECⅡ的氧化损伤,其作用机制可能是通过ERK的活化来介导.     

经鼻重组腺相关病毒T-bet基因转染对呼吸道合胞病毒感染小鼠呼吸道炎症的影响

目的 观察携带T-bet基因的重组腺相关病毒(rAAV-T-bet)转染对呼吸道合胞病毒(RSV)感染模型小鼠呼吸道炎症的影响.方法 健康6～8周龄Balb/c小鼠40只.按随机数字表法分为4组:正常对照组(A组)、RSV感染模型组(B组)、模型/对照病毒rAAV载体介导的增强型绿色荧光蛋白(rAAV-eGFP)干预组(C组)及模型/rAAV-T-bet干预组(D组),每组10只.将B组、C组和D组小鼠用滴度为1.26×1010 PFU·L-1的RSV液滴鼻,每只100 μL;A组用等量人喉癌上皮细胞(Hep-2细胞)培养上清液代替RSV液.于RSV接种第5天,再次麻醉小鼠,A组和B组经鼻滴入293细胞培养上清液;C组经鼻滴入293细胞包装的rAAV-eGFP对照病毒液,D组经鼻滴入293细胞包装的rAAV-T-bet.7 d后处死小鼠,检测各组小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞成分及IL-4和γ干扰素(IFN-γ)水平,并观察其肺组织病理学变化.结果 1.B组小鼠BALF中细胞总数和淋巴细胞计数百分比分别为(43.91±10.41)×109L-1、(65.15±1.88)%,A组分别为(14.52±3.57)×109L-1、(25.79±1.07)%,A组与B组比较差异均有统计学意义(Pa<0.05);D 组小鼠BALF中细胞总数和淋巴细胞计数百分比分别为(24.84±4.35)×109L-1、(29.48±11.97)%,与B组、C组比较差异均有统计学意义(Pa<0.05).2.B组小鼠BALF中IL-4和IFN-γ水平分别为(74.32±10.06) ng·L-1、(89.36±20.38) ng·L-1,A组分别为(6.01±1.02) ng·L-1、(177.32±18.16) ng·L-1,A组与B组比较差异均有统计学意义(Pa<0.05);D组分别为(49.14±7.59) ng·L-1、(145.28±43.52) ng·L-1,与B组、C组比较差异均有统计学意义(Pa<0.05).3.A组小鼠呼吸道无明显炎症改变;B组和C组小鼠小支气管、血管黏膜下和周围肺组织有明显炎性细胞浸润,血管壁明显水肿;D组小鼠呼吸道炎症明显减轻.结论 T-bet基因转染能改善RSV感染模型小鼠呼吸道内细胞因子IL-4和IFN-γ异常表达,同时对淋巴细胞在肺内聚集、肺组织炎症有一定抑制作用.     

Notch信号在胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞与成纤维细胞共培养体系中的表达

目的 建立肺泡Ⅱ型上皮细胞(AEC Ⅱ)与肺成纤维细胞(LF)共培养模型,检测胎鼠AECⅡ共培养和单独培养时Notch1、3受体表达的变化.方法 应用Millipore插入式培养皿和Costar六孔板构建AEC Ⅱ/LF共培养模型,将未接种LF的Millicell2PCF插入式细胞培养皿置于接种有AEC Ⅱ的培养板为AEC Ⅱ单独培养组.光镜、透射电镜观察共培养与单独培养条件下AECⅡ大体形态、超微结构;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测其AEC Ⅱ增殖活力;反转录PCR法检测其AECⅡ分泌表面活性蛋白C(SP-C)功能,并用荧光定量PCR法检测其AEC Ⅱ Notch1、3 mRNA的表达.结果 AECⅡ/LF共培养组较AEC Ⅱ单独培养组稳定保持了其立方形结构和细胞表型并克隆样生长,增殖活力强.电镜下可见单独培养48 h AEC Ⅱ呈现AEC I样改变,而共培养AEC Ⅱ维持其正常生理形态.与单独培养组比较,共培养组AECⅡ分泌SP-C明显增多(P＜0.05),Notch1 mRNA表达显著升高(P＜0.05),而Notch3 mRNA显著降低(P＜0.05).结论 AECⅡ同型细胞培养时转分化为AEC I,不同型细胞(AECⅡ/LF)共培养抑制其转分化,此转分化过程受Notch信号分子调控.     

川崎病患儿外周血单核细胞CD14+CD16+表达的意义

目的 探讨川崎病(KD)患儿外周血单核细胞CD14 CD16 表达的意义.方法 流式细胞仪检测16例1～11岁(男10例,女6例)健康体检儿童,KD患儿16例,10个月～10岁,男10例,女6例.治疗前(急性期)和治疗后外周血CD14 及CD14 CD16 单核细胞数,并计算CD14 CD16 单核细胞占CD14 单核细胞的百分数;KD患儿治疗前后和健康对照组的组间资料比较采用t检验.采用SPSS 11.5软件进行统计学分析.结果 KD患儿16例的单核细胞数、CD14 CD16 单核细胞百分数和绝对数在急性期分别为(1.03±0.58)×109L-1、(12.53±5.31)%、(1.20±0.79)×109L-1.健康对照组分别为(0.57±0.21)×109L-1、(3.86±1.84)%、(0.21±0.10)×108L-1,急性期和健康对照组比较有显著性差异(Pa<0.05);经治疗病情好转,15例治疗前为(1.03±0.60)×109L-1,(12.83±6.51)%,(1.22±0.82)×108L-1,治疗后下降为(0.49±0.21)×109L-1、(5.07±4.77)%、(0.24±0.20)×108L-1,与治疗前比较有显著性差异(Pa<0.01),但与健康对照组比较无显著性差异(Pa>0.05).1例短期内复发KD患儿CD14 CD16 单核细胞表达持续增高.结论 KD患儿急性期外周血CD14 CD16 单核细胞表达的增高与临床病情变化有关.     

新生大鼠肺泡Ⅰ型细胞的原代培养及鉴定

目的探讨新生大鼠肺泡Ⅰ型上皮细胞(AECⅠ)的分离、纯化及原代培养方法,为主要以AECⅠ损伤为特征的肺部疾病研究提供模型。方法采用弹性蛋白酶联合胶原酶Ⅰ的消化方法,分离肺组织细胞,然后用肺Ⅰ型上皮细胞顶膜蛋白α(T1-α)单克隆抗体及免疫磁珠进行阳性选择的方法纯化AECⅠ,最后进行原代培养;通过锥虫蓝染色检测细胞活力,倒置显微镜观察细胞生长及形态特征,细胞免疫荧光法检测细胞表面特异性抗原的表达。结果每只鼠可获得AECⅠ(1.4±0.4)×106个,纯度90.5%±3.4%,活力93.4%±3.0%。接种于玻璃培养皿48h后倒置显微镜下观察细胞开始粘附伸展,呈克隆样生长,在4～6天时汇合成薄的单层状。免疫荧光显微镜观察新鲜分离的AECⅠ特异标志物水通道蛋白-5(AQP5)阳性,呈现绿色荧光;AECⅡ标志物前表面活性蛋白C(proSP-C)阴性;培养后的AECⅠ免疫荧光染色呈AQP5阳性。结论利用弹性蛋白酶联合胶原酶Ⅰ消化,免疫磁珠进行阳性选择的方法可成功分离出高产量、高纯度的鼠AECⅠ,能满足体外进一步对AECⅠ生理功能的研究,也可为研究AECⅠ损伤修复机制提供细胞培养的模型。     

早产大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞与成纤维细胞共培养模型的建立

目的建立早产大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)与肺成纤维细胞(LF)共培养模型,为研究肺发育和肺损伤时AECⅡ和LF的相互作用提供实验基础。方法分离、纯化胎鼠AECⅡ和LF,通过插入式培养皿和培养板来构建AECⅡ-LF共培养模型。AECⅡ以5×105／mL的密度接种到6孔板中,LF以1×106／mL的密度接种到PCF插入式Millicell培养皿中,以6孔板中不放入套皿单独培养的AECⅡ为对照。用倒置显微镜观察AECⅡ形态和基本生长情况,台盼蓝染色了解细胞成活情况,免疫细胞化学染色法检测AECⅡ Ki67表达。结果早产大鼠AECⅡ和LF共培养模型成功构建。共培养2 d与单独培养2 d相比,AECⅡ的形态、活力和增殖无明显差异。共培养4 d,AECⅡ仍可保持其细胞形态,细胞数目、细胞活力;AECⅡ Ki67表达较单独培养4d 明显增加。结论体外构建的早产大鼠AECⅡ与LF共培养模型,部分模拟了体内微环境。AECⅡ和LF共培养体系有利于保持 AECⅡ的增殖和分化功能,可用于体外研究肺发育和肺损伤时AECⅡ和LF的相互作用。     

γ泌肽酶抑制剂对胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞Notch信号通路的影响

目的 探讨γ泌肽酶抑制剂在肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)与肺成纤维细胞(LF)共培养胎鼠模型中对Notch信号分子表达的影响.方法 应用Millipore插入式培养皿和Costar 6孔板构建AEC Ⅱ/LF共培养胎鼠模型.应用免疫组织化学法分别检测其细胞表面标志物表面活性蛋白C(SP-C)鉴定AEC Ⅱ、LF.锥虫蓝拒染实验检测AECⅡ、LF活力后将γ泌肽酶抑制剂加入最低必需培养基(MEM)(终质量浓度为0.2 g/L)作为实验组,未加入者为对照组.应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白质印迹法(Western blot)在基因和蛋白水平检测二组在培养24、48、72、96 h AECⅡNotch受体、转录调节因子DNA结合蛋白(CBF-1)及转录因子分裂增强子(HES-1)表达.采用SPSS 11.5软件进行组间t检验和组内单因素方差分析.结果 原代培养AECⅡ纯度(94.7 ±1.9)%,细胞活力为(96.2 ±2.5)%;LF纯度(97.2±1.4)%,细胞活力为(98.5 ±2.6)%.实验组CBF-1 mRNA及CBF-1蛋白在24、48、72、96 h与对照组比较均无显著变化(Pa＞0.05),实验组Notchl mRNA在24、48、96 h,Notch3 mRNA在48、72、96 h较对照组均显著降低(Pa＜0.05),HES-1 mRNA及蛋白在各时间点均显著降低(Pa＜0.05,0.01).结论 γ泌肽酶抑制剂可部分阻断胎鼠AEC Ⅱ发育中的Notch信号通路传导,其机制可能通过非CBF-1依赖途径.     

Matrigel胶对高氧损伤早产鼠肺泡Ⅱ型细胞黏着斑激酶表达变化及其对肺泡Ⅱ型细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨人工重组基底膜Matrigel胶对高氧暴露下早产鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(Alveolar Epithelial CellⅡ,AECⅡ)黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)表达变化及其对AECⅡ增殖、凋亡的影响.方法 原代培养早产鼠AECⅡ,建立高氧细胞模型,采用免疫印迹分析Matrigel胶对AECⅡFAK蛋白、磷酸化FAK( FAK- Tyr397)蛋白、FAK mRNA表达的影响,以了解Matrigel胶对FAK活性的调节作用;并进一步用细胞核增殖抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)免疫细胞化学法和原位缺口末端标记(TUNEL)法分别检测FAK抑制和激活状态下AECⅡ增殖和凋亡状况.结果 接种于Matrigel胶后,AECⅡFAK蛋白、FAK-Tyr397蛋白及FAK mRNA表达水平均明显增加;与空气对照组比较,高氧暴露12h时,AECⅡPCNA表达强度明显下降(0.1498±0.009 vs 0.0953±0.006,P＜0.05),TUNEL标记细胞明显增多(1.232 ±0.6 Vs 13.40±3.2,P＜0.01);接种于Matrigel胶后AECⅡ凋亡指数差异无统计学意义,而PCNA表达强度明显增强(0.1498±0.009 Vs 0.1921±0.008,P＜0.01).与高氧组比较,高氧+Matrigel组AECⅡPCNA表达明显增高(0.0953±0.006 Vs0.1125±0.012,P＜0.05),凋亡指数明显下降(13.40±3.2 Vs 7.641±1.6,P＜0.05).结论 高浓度氧抑制AECⅡ增殖、诱导其凋亡,并抑制AECⅡFAK的表达;Matrigel胶具有抑制AECⅡ凋亡、促进AECⅡ增殖作用,对高氧暴露下AECⅡ具有保护作用,且与其促进FAK表达和活化有关.     

高体积分数氧致慢性肺疾病新生鼠肺泡II型上皮细胞超微结构的改变

目的 探讨高体积分数氧(高氧)损伤状态下,新生鼠肺组织通透性及肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)超微结构的动态变化.方法 新生大鼠320只,依据吸氧体积分数(FiO2)分组:实验组1(FiO2 800 mL·L-1)、实验组2(FiO2 600 mL·L-1)、实验组3(FiO2 400 mL·L-1)、空气对照组(FiO2 210 mL·L-1).每组分别于实验1 d、3 d、5 d、7 d、14 d取 8只鼠,计算其肺湿/干质量比值(W/D);另取8只新生鼠行支气管肺泡灌洗,检测其支气管肺泡灌洗液(BALF)中蛋白水平的动态变化; 透射电镜及硝酸镧示踪技术观察其AECⅡ超微结构及细胞膜通透性改变.结果 各实验组5 d、7 d、14 d肺W/D比值明显高于空气对照组,差异均有统计学意义(Pa<0.05),高氧3 d后实验组1与实验组2、实验组3的BALF中蛋白水平与空气对照组比较均显著增高(Pa<0.05);各实验组 7 d 内随暴露时间延长呈上升趋势;BALF 中蛋白水平在实验组3、实验组2、实验组1也呈逐渐增高趋势,且与空气对照组比较均显著增高(Pa<0.05).实验组AECⅡ的超微结构在出生后不同时间可以出现明显改变,且对硝酸镧颗粒通透性明显增加.结论 高氧肺损伤早期存在肺泡上皮通透性增加导致的肺水肿改变;新生鼠随着高氧暴露浓度的增高和时间的延长,肺损伤加重.     

高浓度氧暴露对早产鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸表达的影响

目的探讨高浓度氧(高氧)暴露对早产鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)-脱氢酶亚基4(ND4)表达的影响。方法原代培养早产Sprague-Dawley(SD)大鼠AECⅡ,待其在含50mL/L二氧化碳(CO2)培养箱中生长至接近融合状态时随机分为高氧组和空气组。高氧组持续暴露于常压高浓度氧中,氧体积分数>900mL/L,CO2体积分数为50mL/L;空气组仍置于含50mL/L CO2培养箱中。二组分别于高氧或空气暴露6、12、24h提取细胞RNA,采取半定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定ND4 mRNA的表达;采用免疫细胞化学染色法检测细胞爬片ND4蛋白的表达。结果与空气组比较,免疫细胞化学结果显示高氧暴露6、12h ND4的表达无显著性差异(Pa>0.05),高氧暴露24h ND4的表达显著减弱(P<0.05);RT-PCR检测显示高氧暴露6h ND4 mRNA表达无显著性差异(P>0.05),高氧暴露12、24h ND4 mRNA表达显著减弱(Pa<0.05)。结论高氧暴露下调早产SD大鼠AECⅡ ND4 mRNA和蛋白水平的表达,这种改变可能参与高氧肺损伤的发病过程。     

己烯雌酚和胰岛素样因子3对睾丸引带细胞中富含亮氨酸的G蛋白耦联受体8mRNA和蛋白表达水平的影响

目的 探讨不同水平的己烯雌酚(DES)和胰岛素样因子3(INSL3)对体外培养的睾丸引带细胞中富含亮氨酸的G蛋白耦联受体8(LGR8) mRNA和蛋白表达的影响.方法 将3日龄的雄性昆明小鼠的睾丸引带组织解剖取出,并进行细胞培养.传代后,随机分为正常对照组及实验组(不同浓度DES组:A～E组,不同浓度INSL3组:Ⅰ～Ⅳ组)共11组.其中,实验组加入的DES浓度分别是3.7×10-2 mmol·L-1、3.7×10-3 mmol·L-1、3.7×10-4 mmol·L-1、3.7×10-5 mmol·L-1和二甲基亚砜溶剂对照组;INSL3的浓度分别为3.3×10-3 μmol·L-1、3.3×10-4 μmol·L-1、3.3×10-5 μmol·L-1及3.3×10-6 μmol·L-1.加药持续作用48 h后,应用反转录PCR和流式细胞术分析睾丸引带细胞中LGR8 mRNA及其蛋白的表达情况.结果 A组和Ⅳ组LGR8的mRNA及蛋白水平显著高于正常对照组(P<0.01);与正常对照组相比,B、C、D组LGR8 mRNA及其蛋白表达均显著下降(Pa<0.05),而E组及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组LGR8 mRNA和其蛋白的表达差异均无统计学意义(Pa>0.05).结论 高剂量的DES和极低剂量的INSL3均能上调睾丸引带细胞中LGR8 mRNA及其蛋白表达水平,推测DES和INSL3可能通过LGR8作用途径来影响睾丸引带的发育.     

抗氧化酶Prdx6保护肺泡Ⅱ型上皮细胞抵抗过氧化氢诱导细胞凋亡的作用

目的探讨抗氧化酶Prdx6保护肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)抵抗过氧化氢(H2O2)诱导的细胞凋亡的作用。方法 AECⅡ分离纯化于野生小鼠(WT组)和Prdx6转基因过表达小鼠(Prdx6 TG组),并暴露在不同浓度(50～500μmol.L-1)H2O2下24 h。Nile Red染色用于鉴定AECⅡ;免疫印迹法探测Prdx6蛋白表达;应用钙黄绿素乙酰甲酯和乙啶二聚物染色法研究细胞生存率;应用膜联蛋白A(AV)和碘化丙啶(PI)染色法研究细胞凋亡情况。结果 Prdx6 TG组AECⅡPrdx6蛋白表达量是WT组的7倍,同时,H2O2可剂量相关性地诱导AECⅡPrdx6蛋白表达;AECⅡ生存率和H2O2呈剂量负相关,Prdx6 TG组细胞生存率显著高于WT组(P<0.05);AV和PI荧光染色显示细胞凋亡的程度H2O2治疗浓度呈正相关,同时,Prdx6 TG组细胞凋亡阳性率明显低于WT组(P<0.05)。结论抗氧化酶Prdx6可以保护AECⅡ抵抗H2O2诱导的细胞凋亡,是其作为抗氧化酶的主要功能之一。     

重组人生长激素治疗对危重症患儿免疫功能的影响

目的 研究外源性重组人生长激素(rhGH)联合低热量肠内营养支持治疗对危重症患儿免疫功能的影响.方法 选取2009年1月-2010年1月住本院PICU 60例危重症患儿(危重症组),随机分为对照治疗组(30例)和rhGH治疗组(30例).2组患儿均予肠内营养(60～80 kcal·kg-1)及综合治疗,rhGH治疗组于入院第2天晚1000起给予rhGH(0.1 IU·kg-1·d-1)腹部皮下注射,连续7 d.检测治疗前和治疗后2组患儿细胞免疫(CD3、CD4、CD8、CD4/CD8、CD19、NK细胞)和体液免疫(IgA、IgG、IgM).另选择同期健康体检婴幼儿20例作为健康对照组,检测细胞免疫和体液免疫作对照.结果 1.治疗前,危重症组CD3、CD8、NK细胞水平[(56.04±12.23)%、(21.99±7.25)%、(4.42±2.67)%]显著低于健康对照组[(71.57±7.27)%、(28.71±6.02)%、(12.16±6.32)%]低(Pa<0.01);治疗后,rhGH治疗组CD4、CD4/CD8、NK细胞[(50.17±7.71)%、(2.57±0.98)%、(7.72±2.89)%]较对照治疗组[(37.30±10.94)%、(1.47±0.79)%、(3.97±2.85)%]明显增高,差异有统计学意义(Pa<0.05).2.治疗前,危重组CD19水平[(37.68±12.47)%]显著高于健康对照组[(13.16±5.17)%](P<0.01);治疗后,rhGH治疗组CD19水平[(20.98±4.59)%]较对照治疗组[(29.77±13.58)%]明显下降(P<0.05).3.危重症组IgG、IgA、IgM水平[(4.39±1.36) g·L-1、(0.24±0.18) g·L-1、(0.57±0.20) g·L-1]较健康对照组[(6.28±2.14) g·L-1、(0.37±0.15) g·L-1、(0.78±0.23) g·L-1]显著下降,差异有统计学意义(Pa<0.05);rhGH治疗组IgG、IgA水平[(7.26±1.98) g·L-1、(0.45±0.22) g·L-1]较对照治疗组[(5.18±1.34)g·L-1、(0.29±0.15)g·L-1]明显增高,差异有统计学意义(Pa<0.05).结论 危重症患儿细胞免疫和体液免疫功能受到抑制;外源性rhGH联合低热量肠内营养支持治疗能明显改善危重症患儿免疫功能紊乱.     

小潮气量通气联合肺复张策略在治疗急性肺损伤患儿中的肺保护作用

目的应用小潮气量通气联合肺复张策略(RM)治疗小儿急性肺损伤(ALI),动态观察血浆肺表面活性物质相关蛋白-A(SP-A)及IL-6水平变化,并探讨其临床意义。方法前瞻性观察ALI患儿30例。分为2组,各15例,一组给予常规机械通气方式(CON组),潮气量为10～15 mL.kg-1;另一组予以小潮气量联合RM通气方式(RM组),潮气量为6～8 mL.kg-1,RM采用持续呼吸道正压通气(CPAP)方式,维持压力为2.94 kPa,每次维持30 s,每天平均进行3次,连续5 d,其他治疗均相同。分别于入组第1天,第3天,第5天留取血样,ELISA法测定其血浆SP-A及IL-6水平,比较2组结果的差异。结果入组时2组患儿IL-6水平相近,至入组第3天及第5天时,RM组IL-6水平分别降为(304.3±58.6)×10-9g.L-1和(223.0±60.6)×10-9g.L-1,同时间点CON组虽然也分别降至(374.9±105.7)×10-9g.L-1和(316.2±107.3)×10-9g.L-1,但RM组IL-6水平均显著低于CON组(Pa<0.05)。入组时2组患儿SP-A水平无差异性,入组第3天,RM组SP-A水平降至(256.0±59.4)×10-9g.L-1,而CON组为(293.5±48.6)×10-9g.L-1,二者略有不同,但差异无统计学意义;至入组第5天RM组患儿达(194.2±54.4)×10-9g.L-1,显著低于相应CON组[(252.1±71.5)×10-9g.L-1](P<0.05)。结论应用RM联合小潮气量通气治疗小儿ALI,可使血浆SP-A及IL-6水平显著下降,减轻呼吸机相关性肺损伤的程度,具有肺保护作用。     

布地奈德、卡介苗干预对支气管哮喘小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞损伤的影响

目的 观察布地奈德(BUD)、卡介苗(BCG)干预对支气管哮喘小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(ATⅡ)损伤的影响.方法 昆明小鼠40只随机分为哮喘模型组、BUD干预组、BCG干预组和正常对照组.以卵白蛋白致敏和激发复制小鼠哮喘模型,并行BUD、BCG干预.HE染色观察其呼吸道周围嗜酸性粒细胞(EOS)浸润.ELISA法检测其血清、支气管肺泡灌洗液(BALF)中Krebs von den lungen-6(KL-6)表达及BALF中IL-4、IFN-γ表达.免疫组织化学染色(SABC法)观察其肺表面活性蛋白(SP-A、SP-B)的表达.透射电镜观察其ATⅡ形态.结果 哮喘模型组、BUD干预组、BCG干预组、正常对照组EOS分别为(806±91)个·mm-2、(173±25)个·mm-2、(189±19)个·mm-2及(3±1)个·mm-2;血清KL-6水平分别为(1.514±0.027) ng·L-1、(1.101±0.020) ng·L-1、(1.008±0.019) ng·L-1及(0.753±0.033) ng·L-1;BALF中KL-6水平分别为(0.842±0.020) ng·L-1、(0.268±0.024) ng·L-1、(0.243±0.026) ng·L-1及(0.090±0.015) ng·L-1;BALF IL-4水平分别为(22.61±2.35) ng·L-1、(13.34±2.41) ng·L-1、(15.56±3.08) ng·L-1及(0.62±0.15) ng·L-1;BALF IFN-γ水平分别为(40.56±3.58) ng·L-1、(60.37±6.41) ng·L-1、(57.87±6.28) ng·L-1及(75.64±6.09) ng·L-1;SP-A IOD值分别为45.89±10.08、181.34±29.41、200.12±32.08及389.62±45.05;SP-B IOD值分别为10.34±2.42、88.76±12.66、87.13±14.58及187.89±27.15.上述指标除BUD干预组与BCG干预组之间差异无统计学意义外,余各组间差异均有统计学意义(Pa<0.01).电镜下可见哮喘模型组小鼠ATⅡ板层小体和线粒体减少,有明显排空和空泡化改变,部分细胞变性、坏死.干预后上述改变均有明显改善.哮喘模型组、BUD干预组及BCG干预组BALF中KL-6水平与EOS呈明显正相关,与BALF中IL-4/IFN-γ亦呈明显正相关.SP-A与BALF IL-4/IFN-γ呈明显负相关.结论 支气管哮喘使小鼠ATⅡ明显受损,KL-6表达增加,SP-A、SP-B表达下降.BUD、BCG干预可减轻哮喘ATⅡ的损伤.     

Notch受体在早产鼠高氧肺损伤中的动态表达

目的检测Notch受体、AQP5、SP-C在高氧暴露下早产SD大鼠肺的表达,探讨Notch在高氧肺损伤中的作用机制。方法SD早产鼠80只随机分为对照组和高氧组,于1、71、42、1 d行肺组织病理学检查;免疫组织化学法检测Notch1、Notch3;RT-PCR检测Notch1、Notch3、AQP5S、P-C mRNA;Western blot检测AQP5、SP-C。结果病理学检查显示,高氧组肺发育滞后,Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)分化抑制。免疫组织化学法检测结果显示,高氧组各时间点(除7 d)肺组织Notch1表达低于对照组(P<0.05,0.01),Notch3上调(P<0.01)。Notch1、Notch3 mRNA改变类似蛋白水平。高氧组AQP5,SP-C mRNA及蛋白较对照组显著下降。结论85%高氧导致早产鼠肺Notch受体表达异常。Notch信号可能通过调控转分化参与高氧肺损伤。     

静脉营养对早产儿免疫功能的影响

目的 观察早产儿60例静脉营养对血清三酰甘油(TG)水平及体液、细胞免疫功能的影响.方法 早产儿随机分为A、B、C 3组,分别在出生第2天开始静脉滴注氨基酸和脂肪乳剂.A组:单用氨基酸;B组:氨基酸加中/长链脂肪乳;C组:氨基酸加长链脂肪乳.各组氨基酸和脂肪乳剂均从1.0 g/(kg·d)开始,每日递增0.5 g/kg,直至3.0 g/(kg·d),共用7 d.分别于出生第1天治疗前、第9天治疗后采集静脉血,监测TG,免疫球蛋白IgA、IgM、IgG,补体C3、C4和T淋巴细胞亚群CD3、CD4、CD4/CD8及NK细胞值.结果 治疗后3组患儿TG均有不同程度增高(Pa<0.05),B组、C组均高于A组(Pa<0.05).与治疗前比较,3组IgG水平均显著下降(Pa<0.01),IgM水平均显著升高(Pa<0.05),治疗后除A组C3、C4、CD3、CD4/CD8和B组CD3有所增高(Pa<0.05)及C组NK细胞有所下降外(P<0.05),余各指标均无显著性差异(Pa>0.05).与A、B组比较,C组NK细胞明显下降(Pa<0.05).3组治疗前后IgA、IgM、IgG、C3、C4、CD3、CD4/CD8的变化均无统计学意义.结论 早产儿出生第2天开始输注脂肪乳剂,7 d后均可引起TG明显增高,但在安全范围内;氨基酸及中/长链脂肪乳剂对体液免疫、细胞免疫均无明显影响,长链脂肪乳剂输注7 d后可引起NK细胞下降.     

生长激素促分泌素受体-1a基因在3T3-L1脂肪细胞诱导分化过程中的表达

目的 观察生长激素促分泌素受体-1a(GHSR-1a)基因在3T3一K1肪细胞诱导分化过程中不同时段表达水平的变化,探讨GHSR-1a基因在脂肪细胞分化中的作用.方法 体外培养3T3-L1前脂肪细胞,在诱导其向成熟脂肪细胞分化的不同时段(第0-8天).通过形态学观察、油红0染色测定脂肪细胞分化程度及脂滴积聚情况,化学比色法测定脂肪细胞三酰甘油(TG)总量,半定量反转录一聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测脂肪细胞中GHSR-1a基因mRNA的表达水平.采用SPSS 12.0软件进行组间t检验.结果 3T3-L1前脂肪细胞在诱导分化前呈梭形的成纤维细胞形态,胞浆内无脂滴;诱导分化后细胞逐渐由梭形变为圆形,胞体变大变圆,胞浆内出现明显的脂滴.3T3-L1前脂肪细胞诱导分化第4天细胞内TG水平已明显升高,第8天TG水平升高更加明显,与前脂肪细胞相比均有显著统计学意义(Pa<0.01).同时GHSR-1a基因mRNA低表达于3T3-L1前脂肪细胞和分化第1天的脂肪细胞,随着3T3-L1脂肪细胞逐渐分化成熟,分化第4天和第8天GHSR-1a基因mRNA的表达逐渐增加,GHSR-1a基因的表达水平除在诱导分化第0-1天和第1-4天内差异无统计学意义(P＞0.05)外,其余各时间点表达水平比较均有统计学意义(Pa<0.05).结论 3T3-L1脂肪细胞分化过程中GHSR-1a基因表达逐渐上调,其表达变化与脂肪细胞分化、脂质积聚过程一致,可能参与了脂肪细胞分化过程.