人Midkine启动子驱动的HSV-TK自杀基因体外抗肝癌作用

目的 观察以人Midkine(MK)启动子调控单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-TK)/丙氧鸟苷(GCV)自杀基因系统在体外对人肝癌细胞的杀伤效应.方法 以含有人MK启动子调控的HSV-TK基因的重组腺病毒分别感染体外培养的甲胎蛋白(AFP)阳性人肝癌细胞BEL-7402和AFP阴性人肝癌细胞SMMC-7721,RT-PCR法检测HSV-TK基因在上述两种细胞中的转录表达,观察GCV对人肝癌细胞的杀伤作用.结果 GCV在体外对重组腺病毒感染的BEL-7402及SMMC-7721均有明显的杀伤作用,又以前者为著.相同的病毒滴度,其杀伤作用随着GCV浓度的增高而增强.均具有旁观者效应.结论 在体外表现HSV-TK基因的AFP阳性及阴性人肝癌细胞均可被人MK启动子调控的自杀基因HSV-TK杀伤.     

TK基因联合GCV治疗胃癌的实验研究

目的通过转基因方法观察自杀基因TK联合GCV对小鼠胃癌的体内外杀伤作用方法应用分子克隆技术构建TK基因逆转录病毒表达载体,应用逆转录病毒方法转染小鼠胃癌MFC细胞,通过体外实验观察TK基因结合GCV对小鼠胃癌MFC细胞的杀伤性和旁观者效应;体内实验中首先在615小鼠建立胃癌模型,然后分组将病毒上清注入瘤体内,并结合应用前药GCV,观察对肿瘤的杀伤作用.通过病理切片观察组织病理变化.结果实验结果表明,TK基因在体外即显出明显的杀伤作用,20%的转基因细胞可以杀伤70%～80%的肿瘤细胞.体内实验表明TK基因结合前药GCV可显著杀伤肿瘤,与对照组相比有显著差异(P<0.01,Studentst检验).结论自杀基因TK联合前药GCV对小鼠胃癌产生显著杀伤作用,并产生明显的旁观者效应.     

HSV—TK／GCV系统对小鼠肝癌细胞旁杀伤效应的观察

目的 研究单纯疱疹病毒-胸苷激酶/9-(1,3-二羟-2-丙氧甲基)鸟嘌呤(HSV-TK/GCV)系统对小鼠肝癌细胞旁杀伤效应。方法 应用逆转录病毒载体介导HSV-TK基因修饰MM45T.Li细胞,命名为M45/TK,将M45/TK细胞或M45/TK细胞与未经基因修饰的M45细胞等比例混合接种Balb/c小鼠皮下,联合应用GCV,观察其致瘤性及其体内的旁杀伤效应。免疫组化分析肿瘤组织中免疫细胞的浸润情况。结果 M45/TK细胞在小鼠体内致瘤性显著下降(P<0.01),说明在体内GCV对M45/TK也很敏感,并且M45/TK细胞在小鼠体内具有明显旁杀伤效应,即肿瘤生长明显受到抑制(P<0.05)。M45/TK细胞联合GCV治疗组的肿瘤组织中有较多的CD4~ ,CD8~ 淋巴细胞浸润。结论 HSV-TK/GCV系统对小鼠肝癌细胞具有良好的旁杀伤细胞效应,并提示机体的免疫反应,可能参与增强自杀基因系统的旁杀伤效应。     

KDR启动子驱动双自杀基因靶向杀伤人胃癌细胞的作用

目的:探讨腺病毒介导KDR启动子驱动的双自杀基因体系对人胃癌细胞SCG7901的靶向杀伤作用.方法:应用重组腺病毒AdEasy-KDR-CDglyTK体外感染实验组SCG7901细胞株和对照组HepG2细胞株,并给予不同浓度的前药GCV(ganciclovir)和/或5-FC(5-fluorocytosine),观察该体系对SCG7901细胞杀伤效应及其旁观者效应.结果:携带双自杀基因和报告基因(GFP)的重组腺病毒载体,感染复数为100时,95%以上的受感染SCG7901和HepG2细胞中有GFP表达.已转染腺病毒的SCG7901和未转染SCG7901的细胞在细胞生长方面无显著性差异(t=0.224,P=0.823).已转染腺病毒的HepG2细胞和未转染HepG2的细胞在细胞生长方面也无显著性差异(t=0.120,P=0.904).在前药应用下,已转染腺病毒的SCG7901和HepG2细胞表现出对前药不同的敏感性,SCG7901细胞对前药具有较高的敏感性(F=109.43,P=0.000).融合基因的疗效优于单一自杀基因(F=162.22,P=0.000).将感染腺病毒细胞与未感染细胞以不同比例混和培养,观察到该体系明显的旁观者效应.结论:KDR基因启动子可以调控融合基因体系选择性地杀伤人胃癌SCG7901细胞,并存在旁观者效应.     

HSV-TK/GCV系统杀伤高、低转移卵巢癌细胞株旁观者效应的观察

目的探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷（HSV-TK/GCV）系统杀伤高、低转移卵巢癌细胞时的旁观者效应及其与间隙连接蛋白（Cx）43表达的关系。方法比较经HSV-TK/GCV作用的高、低转移性卵巢癌细胞株Ho-8910pm和Ho-8910旁观者效应;检测两种细胞Cx43的表达。结果HSV-TK/GCV系统对Ho- 8910细胞产生明显的旁观者效应,而对Ho-8910pm细胞旁观者效应较弱;Ho-8910细胞的Cx43表达为7.12（平均荧光强度）,而Ho-8910pm细胞的Cx43表达为1.34,两者相比,P〈0.05。结论HSV-TK/GCV系统杀伤低转移卵巢癌细胞时旁观者效应强,与Cx43的表达水平有关。     

TK基因联合mIL-2基因治疗胃癌的实验研究

目的通过转基因方法观察自杀基因TK对小鼠胃癌的杀伤作用,并联合mIL-2基因,观察免疫反应在增强TK杀伤性中的作用.方法应用逆转录病毒方法转导自杀基因TK,应用脂质体方法转导细胞因子基因mIL-2.通过体外实验观察TK基因对小鼠胃癌MFC细胞的杀伤性和旁观者效应;体内实验中首先在615小鼠建立胃癌模型,然后分组将病毒上清注入瘤体内,并结合应用前药和mIL-2基因,分别观察它们对肿瘤的杀伤作用.通过病理切片观察组织病理变化;应用免疫组化方法观察T淋巴细胞亚群在局部的聚集情况.结果 TK基因在体外即显出明显的杀伤作用,20%的转基因细胞可以杀伤70%～80%以上的肿瘤细胞.体内实验表明TK基因结合前药GCV可显著杀伤肿瘤,而TK基因本身并无杀伤作用(P=0.046).联合mIL-2后抗肿瘤作用进一步加强,部分肿瘤完全消退(P=0.005).免疫组化显示CD ,CD 细胞在局部聚集.结论自杀基因TK联合前药GCV对小鼠胃癌产生显著杀伤作用,不仅转基因细胞被杀死,而且通过旁观者效应杀伤大量周围细胞.细胞因子基因mIL-2可增强TK的抗肿瘤作用.     

腺病毒介导CD基因对人胰腺癌细胞株的体外杀伤作用

目的　探讨腺病毒介导胞嘧啶脱氨酶基因 (CD)对人胰腺癌细胞株体外杀伤作用。方法　构建含CD基因的腺病毒穿梭载体 pAdTrack CMV CD与骨架载体 pAdEasy 1,在细菌内重组为pAd CD ,经 2 93细胞包装、扩增 ,氯化铯密度梯度离心制备纯化高效的含绿色荧光蛋白 (GFP)的CD腺病毒 ,体外转染人胰腺癌细胞株Patu 8988、SW 1990 ,并给予前药 5 氟胞嘧啶 (5 FC) ,观察其体外杀伤效果。结果　含CD基因腺病毒载体经酶切鉴定正确。包装纯化后 ,检测病毒滴度为 2× 10 11PFU/ml,将重组腺病毒转染胰腺癌细胞株Patu 8988、SW 1990后 ,可见 5 FC对转染CD基因的Patu 8988、SW 1990细胞及混育细胞有明显毒性作用 ,而对未导入CD基因的人胰腺癌细胞毒性较低。结论　体外腺病毒介导CD基因 ,不仅转染效果强 ,而且可直接或通过旁观者效应以杀伤胰腺癌细胞 ,可作为胰腺癌基因治疗的有效方法     

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因治疗结肠癌的研究

目的：观察单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk),丙氧鸟苷(GCv)自杀基因治疗系统在体内外对结肠癌的杀伤效应。方法：构建携带HSV-tk基因的逆转录病毒载体,将该重组逆转录病毒感染结肠癌细胞株SW480,筛选稳定表达tk的细胞克隆SW480／tk,测定SW480／tk细胞在体外对GCV的敏感性;SW480／tk细胞在裸鼠皮下成瘤,用GCV治疗并观察疗效。结果：HSV-tk基因整合入SW480细胞并在SW480／tk细胞中稳定表达;GCV在体外对SW480／tk细胞有明显的杀伤作用,其作用呈现剂量和时间依赖性特点和旁杀伤效应,对未转染细胞则无明显毒性。裸鼠ex vivo实验得到相应结果,治疗组肿瘤受到明显抑制。结论 在in vitra和ex vivo水平,表达HSV-tk基因的肿瘤细胞均可被GCV有效杀伤,逆转录病毒介导HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统有可能成为结肠癌的有效治疗方法。     

旋毛虫pcDNA3.1/Ts87重组质粒的构建和表达

目的构建和表达旋毛虫重组质粒。方法PCR法在旋毛虫抗原基因Ts87两端加上合适的酶切位点和KOZAK序列,与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,构建pcDNA3.1/Ts87重组质粒。采用Lipofectamine介导的细胞外源DNA转染法,把重组质粒导入COS7细胞。分别用肌肉注射和基因枪免疫小鼠。结果和结论成功构建pcD-NA3.1/Ts87重组质粒,并在COS7细胞和BALB/c小鼠体内表达。     

慢病毒介导的双自杀基因对大肠癌细胞的靶向杀伤作用

目的:研究慢病毒介导的KDR启动子驱动CD／ TK双自杀基因系统对大肠肿瘤细胞选择性杀伤作用．方法:构建的重组质粒pLenti6/V5-D-KDR- CDglyTK及阳性对照质粒pLenti6.V5-D-GFP 在lipofectamine 2000介导下转染293FT细胞,包装扩增后获得病毒颗粒,体外感染表达 KDR的SW620细胞株和不表达KDR的LS174T 细胞株,荧光显微镜下计数确定阳性对照质粒的感染效率并以RT-PCR方法检测转基因细胞 CDglyTK的表达,然后给予不同浓度的前药 5-FC及GCV处理,观察该体系对不同细胞株的杀伤效应及其旁观者效应．结果:重组体对各细胞株的感染率相似,其感染率随慢病毒滴度的增高而递增．RT-PCR方法检测发现:除LS174T细胞外,SW620细胞有目的基因CDglyTK的表达．对于转基因的 SW620细胞,单用GCV(100 mg／L)时,其存活率为32.34％±2．42％．单用5-FC(2．0 g／L)时, 存活率为30．56％±2．14％．而联合应用两者时, SW620细胞存活率为5.36％±1．55％,LS174T 细胞存活率为95．48％±1．70％．SW620细胞对前药具有较高的敏感性,SW620与LS174T细胞株对前药敏感性有显著性差异(P<0．001), 双自杀基因的疗效优于任一单自杀基因的疗效(P<0．001)．当转基因细胞比率为40％时, 加入前药GCV和5-FC,SW620细胞存活率为11．42％±2．66％,而LS174T细胞存活率为 99．54％±2．61％,二者比较差异有显著性意义 (P<0．001),该体系旁观者效应明显．结论:慢病毒作为载体有较高的转染效率, KDR基因启动子可调控双自杀基因系统选择性杀伤表达KDR的大肠肿瘤细胞．