山东省淡色库蚊对杀虫剂的抗药性

目的 检测山东省各地淡色库蚊对常用化学杀虫剂的抗性状况,探讨抗性治理对策。方法 采用世界卫生组织生物测定方法,测定蚊幼虫的LC_(50)确定抗性水平,计算抗性系数。结果 对山东省10个地区近10年的淡色库蚊抗性测定表明,各地淡色库蚊对常用杀虫剂均产生了一定的抗性,对DDVP的抗性最高达21.18倍,对马拉硫磷的抗性高达5.39倍,对溴氰菊酯的抗性高达42倍。各地抗性水平有逐年增高的趋势。结论 山东各地淡色库蚊对常用杀虫剂均产生了一定的抗性,急需研究实施抗性治理对策。     

山东省淡色库蚊对杀虫剂的抗药性

目的 检测山东省各地淡色库蚊对常用化学杀虫剂的抗性状况，探讨抗性治理对策。方法 采用世界卫生组织生物测定方法，测定蚊幼虫的LC50确定抗性水平，计算抗性系数。结果 对山东省10个地区近10年的淡色库蚊抗性测定表明，各地淡色库蚊对常用杀虫剂均产生了一定的抗性，对DDVP的抗性最高达2l|18倍，对马拉硫磷的抗性高达5．39倍，对溴氟菊酯的抗性高达42倍。各地抗性水平有逐年增高的趋势。结论 山东各地淡色库蚊对常用杀虫剂均产生了一定的抗性，急需研究实施抗性治理对策。     

用核酸探针检测淡色库蚊溴氰酯抗性

目的：用淡色库蚊溴氰菊酯抗性相关胰蛋白酶核针检测淡色库蚊溴氰菊抗性。方法：用逆Northern鉴定抗药性品系和敏感品系中中胰蛋白酶的表达差异，用随机引物法标记鉴定后的胰蛋白酶cDNA片段为探针Northern blot检测淡色库蚊的抗药性。结果：逆Northern显示胰蛋白酶在抗药性品系中的表达量是敏感品系的4．33倍。以其为探针Northern blot检测显示，胰蛋白酶基因在抗药性品系中高表达，抗药性品系中胰蛋白酶的表达量是敏感品系的3．90倍。结论：作为一种新的抗药性检测的分子生物学方法，胰蛋白酶核酸探针可用于区分抗药性品系和敏感品系。     

酯酶滤纸法检测淡色库蚊抗药性的研究

为探讨简捷灵敏的蚊虫抗药性早期测报技术,以α-乙酸萘酯为底物,坚硬固蓝B盐为显色剂,用滤纸法测定实验室和现场淡色库蚊（Cx.pipien pallens)酯酶活力,结果显示三个抗性品系淡色库蚊以抗DDVP品系抗性个体频率最高,其次为抗残杀威品系,抗氯氰菊酯品系较低,与敏感品系相近;三个现场淡色库蚊均对DDVP和残杀威产生不同程度抗性,其抗性个体频率均较高,表明酯酶滤纸法可用于检测蚊虫对有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的抗性水平,该方法操作简便快速,观察结果直观灵敏,具有实用价值。     

淡色库蚊氯菊酯抗性品系和敏感品系的生物学特性

目的　比较淡色库蚊氯菊酯抗性品系和敏感品系生物学特性的差异。　方法　在实验室观察淡色库蚊氯菊酯抗性品系及敏感品系的吸血、繁殖和发育等生物学特性 ,构建实验种群生命表。　结果　淡色库蚊氯菊酯抗性品系吸血率低于敏感品系 ,卵、幼虫和蛹的发育历期及成虫寿命均长于敏感品系 ,卵期死亡率高于敏感品系。以上各项 ,两种品系间差异均具有显著性意义 (P <0.01)。抗性品系相对于敏感品系的适合度为 0.58。　结论　淡色库蚊氯菊酯抗性品系表现出对生长发育和繁殖的不利性。     

温度对酯酶测定法检测淡色库蚊对DDVP的抗药性的影响

目的：用室内多年选育的抗DDVP淡色库蚊抗性株在室内和现场进行试验，以比较WHO标准法和微板测定法在检测蚊虫对DDVP抗药性的差别。方法：微板测定法、生理测定法。结果：用两种方法在温度为23－32℃范围内分别对淡色库蚊进行DDVP抗药性检测，WHO法结果与温度无关，而NSE法结果与温度有关。为消除温度对检测的影响，在缩短孵育时间后，在27－31℃对野外淡色库蚊对DDVP抗性测定，NSE法测定为WHO法结果相同。结论：NSE法检测蚊虫的DDVP抗药性可随外界温度升高而增加，实际应用时应缩短孵育时间加以纠正。     

淡色库蚊抗药性相关基因NYD-Ch和NYD-Tr的表达与初步鉴定

目的　淡色库蚊抗药性相关基因NYD Ch(糜蛋白酶 )和NYD Tr(胰蛋白酶 )表达与鉴定。　方法　以淡色库蚊抗性品系全长cDNA文库为模板 ,采用PCR方法扩增出抗性品系中高表达的NYD Ch和NYD Tr基因 ,经T/A克隆测序鉴定 ,将扩增产物用NotI、EcoRI双酶切后作为插入片段 ,与具有相同粘性末端的融合表达质粒 pET 2 8a(+ )连接 ,转化入表达菌株E .coliBL2 1中 ,取含重组表达质粒的重组菌株以IPTG进行诱导表达 ,表达产物以SDS PAGE电泳和小鼠抗NYD Ch和NYD Tr抗血清进行Westernblot分析鉴定。　结果　NYD Ch和NYD Tr基因开读框大小分别为816bp和 786bp ,预计可分别编码 2 72个和 2 62个氨基酸。对应分子质量大小分别为 2 9.4ku和 2 8ku ,加上pET 2 8a(+ )载体融合部分氨基酸 ,表达产物条带应在 3 3ku附近 ,与SDS PAGE蛋白电泳胶上蛋白条带一致。Westernblot分析确认诱导后的 pET 2 8a(+ ) /NYD Ch和 pET 2 8a(+ ) /NYD Tr在分子质量约 3 3ku处出现 1条与小鼠抗NYD Ch和NYD Tr抗血清特异反应的条带。　结论　NYD Ch和NYD Tr基因在大肠杆菌中获得表达 ,Westernblot分析表明该蛋白为目的蛋白。     

淡色库蚊抗敌敌畏和抗氯氰菊酯品系的抗性演变

本研究采用敌敌畏和氯氰菊酯对淡色库蚊敏感品系进行选育,至第42代,抗敌敌畏和抗氯氰菊酯品系的抗性指数分别为亲代的12.2倍和534.3倍。选育停止后经20代常规饲养,抗敌敌畏和抗氯氰菊酯品系的抗性指数分别降至6.1倍和83.3倍。表明淡色库蚊对敌敌畏和氯氰菊酯抗性形成和下降速度均不相同。     

淡色库蚊抗药性相关基因NYD—Ch和NYD—Tr的表达与初步鉴定

目的 淡色库蚊抗药性相关基因NYD-Ch(糜蛋白酶)和NYD-Tr(胰蛋白酶)表达与鉴定。方法 以淡色库蚊抗性品系全长cDNA文库为模板，采用PCR方法扩增出抗性品系中高表达的NYD-Ch和NYD-Tr基因，经T／A克隆测序鉴定，将扩增产物用Not Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切后作为插入片段，与具有相同粘性末端的融合表达质粒pET-28a( )连接，转化入表达菌株E.coli BL21中，取含重组表达质粒的重组菌株以IPTG进行诱导表达，表达产物以SDS—PAGE电泳和小鼠抗NYD-Ch和NYD-Tr抗血清进行Western blot分析鉴定。结果 NYD-Ch和NYD-Tr基因开读框大小分别为816bp和786bp，预计可分别编码272个和262个氨基酸。对应分子质量大小分别为29．4ku和28ku,加上pET-28a( )载体融合部分氨基酸，表达产物条带应在33ku附近，与SDS-PAGE蛋白电泳胶上蛋白条带一致。Western blot分析确认诱导后的pET-28a( )／NYD-Ch和pET-28a( )／NYD-Tr在分子质量约33ku处出现1条与小鼠抗NYD—Ch和NYD-Tr抗血清特异反应的条带。结论 NYD-Ch和NYD-Tr基因在大肠杆菌中获得表达，Western blot分析表明该蛋白为目的蛋白。     

尖音库蚊淡色亚种细胞系的建立和特征

用尖音库蚊淡色亚种(Culer pipiens pallens)新孵Ⅰ龄幼虫建成蚊细胞系Cpp512.取蚊卵消毒,孵出幼虫,剪成碎片,接种于含15％FBS的改良TC199培养基中,2周左右由幼虫组织长出的细胞形成单层。现已传至53代。细胞形态以梭形为主。细胞对数期群体倍增时间(PDT)为21h。BrdU掺入法测得细胞周期时间为18h。透射电镜检查未见病毒或支原体污染。染色体检查以二倍体核型为主,多倍体亦存在。     

淡色库蚊抗溴氰菊酯品系CYP4家族新成员基因克隆及序列分析

目的　获取淡色库蚊CYP4家族新基因。　方法　根据CYP4氨基酸保守序列设计一对简并引物 ,采用RT PCR的方法 ,从淡色库蚊抗溴氰菊酯品系四龄幼虫总RNA中扩增出与设计相符的基因片段。利用T/A克隆方法 ,将获得的基因片段克隆入 pGEM Teasy载体 ,经PCR鉴定重组成功 ,测序并进行比对。　 结果　共克隆出 3 6个阳性克隆 ,将其中 9个随机挑取的阳性克隆测序及同源性分析 ,表明为CYP4家族中 9个新的cDNA序列 ,由GeneBank登录上网 ;经国际细胞色素P45 0命名委员会鉴定 ,属CYP4家族CYP4H、CYP4J亚家族。为进一步研究细胞色素P45 0的多样性及其与抗药性的关系打下基础。　结论　克隆 9个淡色库蚊基因部分序列 ,被鉴定属于CYP4家族CYP4H、CYP4J亚家族。     

淡色库蚊酯酶活性频率与有机磷酯剂抗性关系

本文报告了采用生物测定法（ＬＣ５０）和改进的Ｐａｓｔｅｕｒ＆Ｇｅｏｒｇｈｉｏｕ（１９８１）滤纸片法测定的淡色库蚊对有机磷酯剂的抗药性．结果证实：１．我国淡色库蚊对有机磷醋剂的抗药性，酯酶Ａ和酯酶Ｂ都在其中起了重要作用．２．α－醋酸萘酯为酯酶Ａ和Ｂ的共同底物．因此，用α－醋酸萘酯为底物的方法检测单个蚊虫对有机磷酯的抗药性是成功的．３．从全国１１个城市检测结果分析，淡色库蚊对有机磷酯的抗药性同酯酶的聚集频率是一致的，而与生物测定法检出的ＬＣ５０与酯酶活性频率的聚集度不完全平行，特别是在中低度抗性时如此。因此，淡色库蚊对有机磷酯的抗性在高抗性区可用测定酯酶的频率来代替毒效生物测定法，而在低抗性区则不能。     

非特异性酯酶在淡色库蚊对不同杀虫剂抗性中的作用研究

目的　探讨非特异性酯酶（Non-specific esterase,NSE）在淡色库蚊对不同杀虫剂抗性中的作用。方法　以β-乙酸萘酯为底物,坚固蓝B盐为显色剂,测定室内5个品系淡色库蚊的NSE活力。结果　5个品系淡色库蚊中以抗DDVP品系NSE活力水平最高,其次为抗DDVP降解品系和抗残杀威品系。抗氯氰菊酯品系较低,与敏感品系相近。结论　NSE在淡色库蚊对有机磷类杀虫剂的抗性中起重要作用,也是对氨基甲酸酯类杀虫剂产生抗性的机制之一,与对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性关系不大。     

溴氰菊酯和倍硫磷混用、轮用对淡色库蚊抗性发展的影响

目的　观察杀虫剂不同用药方式对淡色库蚊抗性发展的影响。方法　以淡色库蚊（Culex pipiens pallens）为试虫,用溴氰菊酯和倍硫磷混剂和单剂隔代轮用进行抗性选育,以溴氰菊酯和倍硫磷单剂作为对照。结果　淡色库蚊经16代处理,其抗性系数在溴氰菊酯和倍硫磷混用为14.65;两者轮用为17.74（溴氰菊酯）和2.77（倍硫磷）;单剂连用则分别为729.08和24.73。结论　两种作用机制不同的杀虫剂混用或轮用均能延缓害虫对杀虫剂抗性的发展。     

淡色库蚊对溴氰菊酯抗性的遗传分析

目的：对室内选育的淡色库蚊抗溴氰菊酯品系（抗性系数５１８）进行遗传分析。方法：采用ＬＣ－Ｐ值分析法研究淡色库蚊溴氰菊酯抗性的形式遗传。采用抑制剂增效试验探讨抗性机制。结果：正交和反交Ｆ１代的抗性系数分别为１５４．８和１５９．２。Ｆ１代的ＬＣ－Ｐ线靠近抗性亲本一方，Ｄ＝０．６２５；ＢＣ代在死亡率５０％处、Ｆ２代在死亡率２５％和７５％处未出现明显平坡，ＢＣ和Ｆ２的实测曲线和理论曲线均存在较大差异，Ｐ均＜０．０１；ＰＢ、ＤＥＦ和ＴＰＰ对抗性品系的增效比分别为２７．１３、１．２２和１．０５。结论：淡色库蚊对溴氰菊酯的抗性为多基因遗传，其主要基因为不完全显性，多功能氧化酶是抗性的主要因子。     

猪囊尾蚴cDNA表达文库构建及抗原基因筛选

采用Ｑｕｉｃｋ Ｐｒｅｐ ｍ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ 试剂盒提取猪囊尾蚴ｍ ＲＮＡ;Ｔｉｍ ｅ－ Ｓａｖｅｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ试剂盒反转录合成双链ｃＤＮＡ,并在末端加上ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩａｄａｐｔｏｒ,修饰后的ｃＤＮＡ 与λｇｔｌｌＥｃｏＲＩ臂连接,体外包装为λ噬菌体颗粒;感染Ｅ．ｃｏｌｉＹ１０９０ 构建成功库容量为２×１０６、重组率为８０％ 的ｃＤＮＡ表达文库。利用兔抗猪囊尾蚴虫体抗原和囊液抗原血清分别对一部分文库进行免疫印迹筛选,分别获得８ 个阳性克隆。提取阳性克隆ＤＮＡ,利用ＰＣＲ法从重组噬菌体ＤＮＡ中扩增出ｃＤＮＡ片段,长度自４００—９００ｂｐ。本文工作为研制猪囊尾蚴核酸疫苗打下了基础。     

淡色库蚊细胞色素P450抗性相关基因克隆与初步鉴定

[目的 ]探讨淡色库蚊细胞色素P45 0与溴氰菊酯抗药性的关系。 [方法 ]采用一对昆虫细胞色素P45 0简并引物 ,以反转录 聚合酶链反应从淡色库蚊扩增特异片段 ,T/A直接克隆法筛选阳性克隆 ,对新序列进行cDNA芯片和逆Northern分析。 [结果 ]从淡色库蚊对溴氰菊酯敏感品系和抗性品系获得 112个阳性克隆 ,其中 2 4个阳性克隆测序后显示为细胞色素P45 0新序列 ,由GenBank登录上网 ;经国际细胞色素P45 0命名委员会鉴定分别属CYP4家族CYP4C、CYP4D、CYP4H和CYP4J等 4个亚家族 ;2 4个CYP4cDNA片段中 ,来自敏感品系的 2个片段(NYDS3和NYDS5 )和来自抗性品系的 4个片段 (NYDR6、NYDR9、NYDR15和NYDR17)在两品系间存在差别 ,cDNA芯片信号亮度值均是抗性品系大于敏感品系 ,倍数在 3 .1～ 9.7范围内 ;NYDR17仅与抗性探针杂交 ;逆Northern再鉴定 ,获得了与cDNA芯片一致的结果。 [结论 ]淡色库蚊CYP4与溴氰菊酯抗性相关 ;在淡色库蚊溴氰菊酯抗性机理中 ,可能存在P45 0基因点突变而导致的特异表达。