两种新突变导致血友病B的分子发病机制研究

目的 对所发现的2种FⅨ基因的新突变Cys82Ser和Ile288Ser进行体外研究,以探讨血友病B的分子发病机制.方法 克隆野生型PcDNA3.1(-)FⅨwt表达载体质粒,以此为模板,采用大引物法构建PcDNA3.1(-)FⅨM1(Cys82Ser)、PcDNA3.1(-)FⅨM2(Ile288Ser)突变表达载体质粒.采用脂质体法将这3种表达载体质粒分别瞬时转染人胚胎肾293细胞(HEK293细胞)和中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞),同时以PcDNA3.1(-)空载体质粒为空白对照.经体外培养后获得相应的表达蛋白,所得产物分别采用ELISA法检测蛋白抗原;活性测定检测表达蛋白的FⅨ因子活性;免疫荧光染色法检测蛋白在细胞中的定位情况;RT-PCR法检测各培养细胞的FⅨmRNA水平.结果 2种突变体转染细胞的FⅨmRNA水平与野生型无明显区别.以PcDNA3.1(-)FⅨwt转染细胞裂解液和细胞培养上清液中的FⅨ:Ag为100.0%,细胞培养上清液中的FⅨ:C为100.0%,则PcDNA3.1(-)FⅨM1转染细胞裂解液和细胞培养上清液中的FⅨ:Ag分别为(99.4±4.1)%和(27.1±5.2)%,而细胞培养上清液中的FⅨ:C为(8.5±3.2)%;PcDNA3.1(-)FⅨM2转染细胞裂解液和细胞培养上清液中的FⅨ:Ag分别为(31.7±2.5)%和(5.3±1.8)%,细胞培养上清液中的FⅨ:C＜1%.细胞免疫荧光试验也证实,转染PcDNA3.1(-)FⅨM1的CHO细胞,其荧光强度与转染PcDNA3.1(-)FⅨwt的CHO细胞相当,转染PcDNA3.1(-)FⅨM2的CHO细胞,其荧光强度明显弱于转染PcDNA3.1(-)FⅨwt的CHO细胞.结论 Cys82Ser突变由于改变了FⅨ的EGF-1区的分子空间构象从而可能导致突变蛋白分泌障碍并存在胞内滞留现象;Ile288Ser突变则可能导致突变蛋白分泌障碍或细胞内降解加速从而引起FⅨ活性降低.     

中国汉族血友病B家系五种新的FⅨ基因突变的研究

目的探讨中国汉族无关血友病B家系先证者的凝血因子Ⅸ基因的突变和发病的分子机制。方法对19例中国汉族无关血友病B家系先证者，静脉采集各家系先证者外周血，表型诊断确诊后，用PCR对FⅨ8个外显子及其侧翼序列进行扩增，用末端标记双脱氧法检测核酸序列。结果19例血友病B家系先证者均检测到相应的基因序列的改变。结论19例中国汉族无亲缘关系的血友病B家系先证者FⅨ基因在编码外显子的核苷酸部位均发现有基因突变，其中发现五种新的突变，即6444T→A（Cys23Stop）；10497G→C（Cys82Ser）；31101G→T（Arg327Ile）；31102InsertT；30984T→G（Ile288Ser）为国际上首次报道。     

74例血友病B患者FⅨ基因突变研究

目的 研究导致中国人血友病B的凝血因子Ⅸ（FⅨ）基因突变类型的分布,并比较与美国白种人群有何异同。方法 从患者外周血白细胞抽提基因组DNA,分9段扩增Ⅸ基因外显子序列,用基因扩增转录测序技术直接测序法检出突变。结果 74例患者中有69例查到了FⅨ基因58种突变。分析比较这69例患者FⅨ基因突变类型的分布特征与美国白种人无显著性。中国不同地区之间差异也无显著性。结论 中国人血友病B的FⅨ基因突变类型非常分散,呈高度异质性。与美国白种人之间相比差异无显著性。     

凝血因子ⅨArg327Ile突变蛋白功能缺陷机制研究

目的 研究FⅨArg327Ile (R327I)及Arg327 Ala(R327A)突变蛋白功能,探讨R327I突变导致血友病B的分子发病机制.方法 采用潮霉素筛选稳定表达细胞株,ELISA法筛选高效表达FⅨ重组蛋白细胞株,采用快流速Q琼脂糖凝胶和离子交换两步法分离纯化重组蛋白.ELISA和SDS-PAGE电泳分别检测重组蛋白含量和纯度.FⅦa/TF/Ca2+和FⅪa/Ca2+活化野生型及R327I和R327A突变FⅨ蛋白,用WB法分别检测不同时间内活化生成的FⅨa.野生型及两种突变FⅨa在不同FⅧa浓度下活化激活FX,以此计算野生型及两种突变FⅨa与FⅧa的解离常数;在含或不含FⅧa的条件下,检测野生型及两种突变FⅨa对不同浓度FX的激活能力,以此计算其催化效率.结果 表达分离纯化野生型、R327I和R327A FⅨ重组蛋白总量分别为450、210和64 μg,SDS-PAGE电泳结果显示重组蛋白纯度符合要求.两种突变蛋白均能被FⅦa/TF/Ca2+和FⅪa/Ca2+正常激活.R327I与R327A两种FⅨa突变蛋白与FⅧa的结合力分别为野生型的1/4和1/5.在含FⅧa条件下,R327I和R327I突变FⅨa对FX催化效率分别为野生型的1/6和1/8.而不含FⅧa条件下,催化效率分别为野生型的1/3和1/7.4.结论 R327I和R327A两种突变FⅨa与FⅧa结合异常,R327位点参与FⅧa结合,同时也与底物活化相关.R327I突变与FⅧa结合力降低导致重型血友病B的发生.     

FⅧ His99Arg突变导致血友病A的分子发病机制研究

目的 探讨1例临床出血表现与凝血因子Ⅷ活性(FⅧ:C)检测结果明显不符的血友病A患者表型、基因型诊断及其分子发病机制。方法 凝血、抗凝及纤溶相关指标检测,一步法及发色底物法检测FⅧ:C,ELISA法检测FⅧ的抗原(FⅧ:Ag)。活化部分凝血活酶时间(APTT)纠正实验筛查FⅧ抑制物;PCR扩增先证者F8基因的所有外显子及其侧翼序列,利用直接核苷酸测序法进行基因序列分析。针对先证者的基因突变位点,对其家系成员进行相应外显子基因检测;定点突变法构建B亚基缺失(760aa～1639aa)的人FⅧHis99Arg和His99Ala两种突变的表达质粒(pRC/RS Ⅴ-BDhFⅦcDNA),两种突变质粒分别瞬时转染HEK293T细胞,测定细胞上清液中的FⅧ:C和细胞上清液及裂解液中的FⅧ:Ag。结果 先证者APTT 延长,一步法及发色底物法检测的F Ⅷ:C均低于1.0％,血浆FⅧ:Ag为120.0％。APTT纠正试验阴性,其他凝血、抗凝及纤溶相关检测均未见异常。诊断为交叉反应阳性(CRM+)的血友病A。患者F8基因直接核苷酸测序发现3号外显子存在28828A→G突变,导致His99Arg氨基酸改变,其母亲该位点为杂合突变。体外表达研究结果显示细胞上清液中His99Arg突变蛋白FⅧ:Ag及FⅧ:C分别为野生型的180.0％及5.8％,His99Ala突变蛋白FⅧ:Ag及F Ⅷ:C分别为野生型的45.0％和20.0％。Western blot显示,His99Arg突变质粒表达上清液中FⅧ蛋白含量较野生型明显增高,而His99Ala突变质粒表达上清液FⅧ蛋白含量较野生型减少。提示His99Arg为CRM+血友病A突变而His99Ala为CRM-血友病A突变。结论 体外检测发现His99Arg和His99Ala两种FⅧ能够表达,但常规凝血检测Hi99Arg突变FⅧ基本无功能,而His99Ala凝血功能也降低。     

应用DNA测序技术检测血友病B患者FⅨ基因突变

为了研究3名中国汉族非亲缘系血友病B患者凝血因子Ⅸ（FⅨ）基因突变的类型,常规检测患者血浆APTT及FⅨ：C,进行表型诊断;抽提患者外周血白细胞基因组DNA,应用PCR技术分8段扩增FⅨ基因外显子序列,用双脱氧终止法检测核酸序列,结果表明：与正常对照者相比,HB患者APTT测定值明显升高,FⅨ：C测定值明显降低,胛测定值正常、测序结果显示3例HB患者均有相应的基因序列改变,患者1有外显子6G22119A点突变,患者2有外显子1G7932C点突变,患者3有外显子T32685C点突变。结论：3例HB患者均检测到相应的基因序列改变,这为HB患者基因缺陷的分子机制提供了证据.     

三个血友病B家系的基因诊断

目的 探讨中国汉族3个无关血友病B家系先证者凝血因子Ⅸ(FⅨ)基因突变及分子发病机制,对家系女性成员进行携带者诊断.方法 家系先证者及成员采静脉血,先证者表型诊断确诊后,检测先证者及其家系成员6个STR位点的基因多态性,进行家系遗传连锁分析,应用PCR法对先证者及可疑携带者FⅨ8个外显子及其侧翼序列进行扩增,用末端标记双脱氧法检测核酸序列.结果 家系1先证者FⅨ基因外显子6发现G22119A突变,家系2先证者FⅨ基因外显子2发现G7392C突变,家系3先证者FⅨ基因外显子8发现T32685C突变.结论 血友病B先证者FⅨ基因缺陷是其发病的分子机制.     

血友病A发病的分子机制

凝血因子Ⅷ(FⅧ)内含子22倒位和错义突变分别是重型和轻/中型血友病A发病的主要机制。CpG岛是突变热点。约5%的重症血友病患者由内含子1倒位引起。大片段缺失突变多与重复序列有关。插入/缺失突变常常发生在单碱基连续地方。无义突变和剪接位点突变多导致重度表型。错义突变的效应和其所累及的位置有关,如影响蛋白分泌,降低F与血管性血友病因子(vWF)、磷脂或因子(FⅧ)结合力、影响凝血酶活化以及增加F不稳定性等。研究发病分子机制对于了解F分子结构和功能的关系、携带者判定、产前诊断以及患者的预后和治疗都有重要的意义。     

用 Ion Torrent 半导体测序技术对血友病 B 家系 F9 基因行突变分析及产前诊断

目的用Ion Torrent半导体测序技术对11个血友病B(HB)家系的F9基因进行序列分析,寻找致病突变,并为遗传咨询和产前诊断提供依据。方法采集11个HB家系先证者及女性成员的外周血样本,抽提基因组DNA,利用Ion Torrent半导体测序技术检测F9基因致病突变,对发现的致病突变进行Sanger测序验证。进一步对7例高危家系孕妇进行羊膜腔穿刺,采集胎儿羊水样本,并进行产前诊断。结果 13例HB患者均存在F9基因致病性突变,共发现10种突变,其中1种为新的突变类型。对8例胎儿进行产前诊断,其中1例为半合子突变,2例为杂合突变,5例不携带母源致病突变。结论用Ion Torrent半导体测序技术检测F9基因的突变谱,对于HB家系携带者的产前诊断具有一定的临床意义。     

变性梯度凝胶电泳检测到四例新的FⅨ基因突变

目的：研究凝血因子Ⅸ的基因突变。方法：应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）和变性梯度凝胶电泳（ＤＧＧＥ）筛选技术，分析了１２例血友病Ｂ患者ＦⅨ基因的全部８个外显子，剪接区及３′，５′端部分非编码区，并对ＤＧＧＥ行为异常片段进行双脱氧链终止法ＤＮＡ序列分析。结果：发现４例新的基因突变，分别位于ＦⅨ基因第１号外显子Ｔ（ＴＧＴ）１１１Ｇ（ＧＧＴ），导致Ｃｙｓ－１９Ｇｌｙ；第３号内含子剪接位点Ｃ１０３８０Ｔ和第８号外显子Ａ（ＴＡＣ）３０９１８Ｇ（ＴＧＣ），导致Ｔｙｒ２６６Ｃｙｓ；第８号外显子Ａ（ＡＣＧ）３１００７Ｃ（ＣＣＧ），导致Ｔｈｒ２９９Ｐｒｏ。结论：阐明血友病Ｂ的点突变有助于进一步了解ＦⅨ蛋白各功能域的精细功能，并为血友病Ｂ家系携带者检测和产前诊断提供了一个重要的遗传信息。     

高分辨率熔解曲线分析在血友病B F9基因突变检测中的应用

目的 利用高分辨率熔解曲线(HRM)技术建立简便有效的血友病B(HB)基因诊断的方法.方法 收集2005年1月至2010年6月就诊于上海瑞金医院的55例HB患者的外周血标本,抽提外周血基因组DNA.采用PCR扩增结合测序的方法对40例HB患者进行F9基因突变检测,利用其中21例带有F9基因1～7号外显子突变的HB患者标本建立相应的HRM突变筛查方法.采用F9基因1～7号外显子的PCR-HRM突变筛查方法及8号外显子的DNA直接测序方法,对15例未知F9基因突变的HB患者进行基因诊断.结果 通过PCR扩增结合测序,40例HB患者均检测到F9基因突变.21例带有F9基因1～7号外显子突变的HB患者标本中,19例(90％)患者的突变可通过PCR-HRM技术进行检测.通过F9基因1～7号外显子PCR-HRM突变筛查及8号外显子的DNA直接测序,15例未知F9基因突变的HB患者均检测到F9基因突变.55例HB患者中共检测到34种F9基因突变.结论 HB基因诊断的新方法,即PCR-HRM筛查F9基因1～7号外显子突变结合8号外显子的DNA测序法操作简便、结果可靠.     

江苏省泰州地区乙肝病毒基因型与基因变异的研究

目的　研究江苏省泰州地区乙肝病毒 (HBV)基因型分布和基因变异情况及其临床意义。方法　选择江苏省泰州地区HBV感染者 15 8例 ,其中乙肝携带者 2 9例 ,急性肝炎 (AC) 18例 ,慢性轻、中度肝炎 (CH) 5 6例 ,重型肝炎 (FHF) 2 2例 ,肝硬化 (LH) 2 1例 ,肝细胞癌 (HCC) 12例 ,采用基因芯片法进行基因分型和基因变异检测。结果　 15 8例乙肝患者中B型 3 5例( 2 1 1% ) ,C型 12 1例 ( 76 6% ) ,B/C混合型 2例 ( 1 3 % )。 15 8例乙肝感染者中发生前C区基因 1896变异的 95例( 60 1% ) ,发生C基因启动子 (BCP) 1762变异的 93例 ( 5 8 9% ) ,发生HBV聚合酶 (P)基因区YMDD变异的 11例 ( 7 0 % )。结论　江苏省泰州地区存在乙肝病毒基因型B和基因型C ,其中C型占优势 ;乙肝患者基因组可有多种变异 ,BCP 1762变异、前C区 1896变异与肝病的严重程度有关 ;部分乙肝患者在拉米夫定治疗过程中产生耐药 ,可能和HBV(P)基因区YMDD变异有关     

抗凝血酶基因C2759T(Leu99Phe)突变导致抗凝血酶缺陷症的分子机制研究

目的研究抗凝血酶(AT)基因C2759T(Leu99Phe)突变引起AT缺陷症的分子机制。方法用大引物法构建C2759T突变体AT重组表达质粒(ATM2759)，并将其和正常AT重组质粒(ATN)分别用Superfect试剂转染COS7细胞或CHO细胞，进行体外表达试验和细胞免疫荧光染色。、结果转染ATM2759的COS7细胞，培养上清液和细胞裂解液中的AT抗原(AT：Ag)分别为ATN的35．63％和174．97％，而培养上清液中的AT活性(AT：A)为ATN的47．73％。细胞免疫荧光试验证实，转染ATM2759的CHO细胞，其荧光强度明显高于转染ATN的CHO细胞。结论Leu99Phe 突变可能不是由于影响AT与肝素的结合而导致AT缺陷，而是由于突变导致AT分泌障碍和细胞内滞留所致。     

Clinical and molecular genetic analysis of a Chinese family with hereditary elliptocytosis caused by a novel mutation in the EPB41 gene

BackgroundHereditary elliptocytosis (HE) is a heterogeneous red blood cell membrane disorder characterized by the presence of elliptocytes on a peripheral blood smear. Clinical manifestations of HE vary widely from asymptomatic carriers to patients with severe transfusion‐dependent anemia. Most patients are asymptomatic or have mild anemia, which hinders diagnosis. The proband in this case had mild anemia and jaundice over a period of 4 years, the etiology of which was unclear. Hence, he was admitted to our hospital for further diagnosis.MethodsPeripheral blood smears and routine blood tests were performed and biochemical parameters of the proband, and his family members were determined. To confirm the diagnosis, gene mutations were screened in the proband using next‐generation sequencing (NGS) and verified by Sanger sequencing in other family members.ResultsA novel mutation (c.1294delA, p.Ser432 fs) in exon 15 of the EPB41 gene was detected in the proband and his family members. This mutation results in a frameshift and a premature stop codon at position 455, encoding a truncated protein. The variant was likely pathogenic according to the criteria of the American College of Medical Genetics and Genomics. SWISS‐MODEL protein structure prediction indicated partial loss of the spectrin and actin binding and C‐terminal domains.ConclusionA heterozygous mutation 1294delA in exon 15 of the EPB41 gene was identified using NGS and Sanger sequencing in members of a Chinese family. This identification expands the spectrum of EPB41 mutations and contributes to the genetic diagnosis of families with HE.     

7例肝豆状核变性患儿ATP7B基因突变的检测与分析

目的 探讨肝豆状核变性患儿ATP7B基因全长外显子基因突变类型及其与临床表型的相关性.方法 对7例肝豆状核变性患儿的ATP7B基因进行全外显子检测.结果 7例肝豆状核变性患儿中1例ATP7B基因未检测出突变,6例检测出6种突变,分别为R778L、G711W、N1270S、A887LfsX14、de1930I、V1121A,R778L和V1121A检出率为28.6％,其他突变检出率均为14.2％.结论 肝豆状核变性患儿ATP7B基因突变呈多样性,R778L突变与临床表型不存在明确相关性.     

AT基因13387-9delG突变引起遗传性抗凝血酶缺陷症的分子病理机制研究

目的　研究AT基因 13387 9delG突变引起AT缺陷症的分子病理机制。方法　用大引物法构建 13387 9delG突变体AT重组表达质粒 (ATM) ,并将其和正常AT重组表达质粒 (ATN)分别用Superfect 试剂转染COS7细胞或CHO细胞 ,进行体外表达试验、脉冲追踪试验以及细胞免疫荧光染色。结果　ATM转染的COS7细胞培养上清液中检测不到AT抗原 ,而在细胞裂解液中 ,其AT抗原仅为转染ATN的 2 7 13%。脉冲追踪试验发现 ,在ATM转染的COS7细胞培养上清液中 ,检测不到3 5S标记的AT蛋白 ,在chase 0min时 ,ATM细胞内3 5S标记的AT蛋白只有ATN的 2 7 8% ;在chase 180min时 ,ATM细胞内3 5S标记的AT蛋白为 0min时的 5 0 %左右。细胞免疫荧光试验的结果表明 ,ATM转染的CHO细胞内荧光强度明显低于ATN转染的CHO细胞。结论　编码的突变AT蛋白分泌障碍和细胞内快速降解 ,是AT基因 13387 9delG突变引起AT缺陷症的分子病理机制