人脐静脉内皮细胞体外培养、鉴定与形态学特征观察

目的:建立人血管内皮细胞的培养模型,为体外研究动脉硬化发病机制提供重要的实验手段。方法:采用1.25g/L胰蛋白酶(2.5g/L胰蛋白酶:0.2g/LEDTA=1∶1V/V)消化、分离和传代人脐静脉内皮细胞,并用光镜、电镜和免疫组化等方法进行内皮细胞的形态观察和鉴定。结果:原代培养的内皮细胞在接种后约2h开始贴壁生长,光镜下内皮细胞呈铺路石状镶嵌排列;免疫组化可见内皮细胞胞浆中人第VIII因子相关抗原呈阳性反应;电镜下可见胞浆中有W-P小体,证实培养的细胞为内皮细胞。结论:用胰酶灌注消化脐静脉可获得高纯度的内皮细胞,细胞存活率高。本方法为血管内皮细胞的研究提供了实验模型。     

胰蛋白酶消化法体外培养和鉴定人脐静脉血管内皮细胞

背景:体外建立稳定可靠的人脐静脉血管内皮细胞模型,目前培养方法缺乏统一的标准。目的:探索脐静脉内皮细胞的体外培养的方法。方法:采用2.5g/L胰蛋白酶和0.02%EDTA消化、分离、体外原代培养及消化传代脐静脉内皮细胞,简化完全培养液组分(不添加血管内皮细胞生长因子、肝素等辅助因子),当原代培养细胞80%以上汇合,根据细胞特有的形态学特征和Ⅷ因子进行内皮细胞的鉴定。结果与结论:种植在培养瓶中的内皮细胞2h贴壁生长,24h换液后内皮细胞80%融合,细胞状态好,内皮细胞呈单层铺路石样外观,经过镜下观察和Ⅷ因子相关抗原鉴定证明是脐静脉内皮细胞。证实用胰蛋白酶灌注脐静脉是一种简单、实用的获得人脐静脉血管内皮细胞的方法,可靠性大,成功率高,可以构建体外研究血管内皮细胞的模型。     

与胶原浮胶细胞共培养中内皮细胞血管新生相关基因的表达

背景：内皮细胞和平滑肌细胞的相互调节是稳定血管壁结构的关键因素，两者共同培养能够分别影响各自的形态和功能。目的：利用Ⅰ型胶原浮胶建立人脐静脉内皮细胞与人血管平滑肌细胞共培养体系，分析细胞之间的相互作用。设计、时间及地点：单一样本观察，于2006—10／2008—01在复旦大学上海医学院分子生物学实验室完成。材料：新鲜脐带取自国际第一妇婴保健医院，产妇知情同意。方法：取新鲜脐带，利用胶原酶灌注法分离人脐静脉内皮细胞，组织块培养法分离人血管平滑肌细胞。人血管平滑肌细胞直接种植于培养板表面，人脐静脉内皮细胞种植于鼠尾Ⅰ型胶原表面制成胶原浮胶，并与培养板上的人血管平滑肌细胞共培养。以人脐静脉内皮细胞单独在浮胶底面培养，培养板表面无人血管平滑肌细胞为对照。主要观察指标：①免疫荧光方法鉴定人血管平滑肌细胞和人脐静脉内皮细胞。光镜和电镜观察人脐静脉内皮细胞形态。②反转录-聚合酶链反应进行基因表达分析。结果：原代培养的内皮细胞呈铺路石样形态，CD31染色阳性。原代培养的人血管平滑肌细胞免疫荧光染色Q-SMA呈阳性。胶原支架上内皮细胞伸展，胶原纤维重新排列，24h后出现管腔样结构。在共培养体系中，人脐静脉内皮细胞的金属蛋白酶1和金属蛋白酶9基因表达量显著高于单独培养组人脐静脉内皮细胞的表达量（P〈0．05）。但层粘蛋白γ2和组织因子途径抑制物2的基因相对表达量在两组间未见明显变化。结论：实验建立的共培养体系，可以观察到与平滑肌细胞共培养的血管内皮细胞形成更加丰富的网络状管腔样结构，更易于血管结构的形成。     

人巨细胞病毒感染对人脐静脉内皮细胞周期和凋亡的影响——动脉粥样硬化发生的可能病因

目的：探讨人巨细胞病毒感染对人脐静脉内皮细胞细胞周期和细胞凋亡的影响。方法：实验于2003—06／2004／06在解放军第四军医大学老年病二科和解放军第四军医大学基础部生理学教研室完成。①细胞来源及分组：将液氮中冻存的人巨细胞病毒AD169株，用人胚肺成纤维细胞进行增殖培养6-8代；将人脐静脉内皮细胞消化成单细胞悬液，用DMEM培养基重新悬浮，细胞以一传三种于培养瓶继续培养至细胞贴壁并已伸展但未汇合，用台盼蓝拒染法检查活细胞数大于95％，对照组为空白对照，实验组接种人巨细胞病毒169病毒株。②组织学及实验室检查：凋亡的人脐静脉内皮细胞形态学特点在倒置相差显微镜下观察。两组人脐静脉内皮细胞增殖情况采用四甲基偶氮唑蓝比色法，以酶联免疫检测仪测得的A490值表示。两组人脐静脉内皮细胞的细胞周期变化采用流式细胞技术（在荧光激活细胞分选仪上进行细胞周期分析）；检测两组人脐静脉内皮细胞的细胞凋亡情况以Annex—in V染色法的以荧光强度判定。结果：①凋亡的人脐静脉内皮细胞形态学特点：正常的生长融合的人脐静脉内皮细胞呈铺路石状镶嵌排列，细胞边界清楚，胞浆丰富，胞核椭圆居中，核仁明显；凋亡的细胞有的变成大细胞。②人巨细胞病毒对人脐静脉内皮细胞增殖的影响：人巨细胞病毒感染人脐静脉内皮细胞后24h，对照组与人巨细胞病毒组A490值分别为1．09&;#177;0．08与2．08&;#177;0．09（t=7．96，P〈0．05）。③人巨细胞病毒对人脐静脉内皮细胞细胞周期的影响：正常对照组G0／G1期的细胞为74．4％，加入人巨细胞病毒后为59．3％，较正常对照组降低20．3％（P〈0．05）。④人巨细胞病毒对人脐静脉内皮凋亡的影响：正常对照组凋亡细胞为8.3％，当加人人巨细胞病毒后为5.8％，较对照组降低30．1％（P〈0．01）。结论：人巨细胞病毒感染人脐静脉内皮细胞后，引起细胞生长周期和凋亡水平的改变增加G0／G1期细胞进入S和G2／M期，降低细胞凋亡，导致细胞最终表现为增殖。     

阿托伐他汀钙调节人脐静脉内皮细胞E-选择素和细胞间黏附分子1表达的浓度依赖性

目的：观察具有调脂作用的阿托伐他汀钙在不同浓度下对肿瘤坏死因子诱导体外培养的人脐静脉内皮细胞表达E-选择素和细胞间黏附分子1的影响。 方法：①实验于2002-05／2003-12在大连医科大学附属第二医院实验室完成。将健康婴儿脐带进行无菌处理，用D-Hank’s液冲洗脐静脉，1g/L胶原酶消化、离心，置于37℃、体积分数0．05 CO2培养箱中培养，选择第2,3代细胞作为实验用。②用肿瘤坏死因子40μg／L、不同浓度（0．005～10μmol／L）的阿托伐他汀钙与体外培养的人脐静脉内皮细胞共同孵育24h后，提取细胞的总RNA，采用半定量反转录聚合酶链反应在mRNA水平进行分析。③用曲线图表示E-选择素和细胞间黏附分子1表达在不同浓度阿托伐他汀钙影响下的变化趋势。 结果：①在mRNA水平，阿托伐他汀钙对肿瘤坏死因子诱导的人脐静脉内皮细胞所表达的E-选择素与细胞黏附分子1均具有浓度依赖性。②阿托伐他汀钙对肿瘤坏死因子诱导人脐静脉内皮细胞表达E-选择素mRNA呈促进作用，即阿托伐他汀钙在0～10μmol／L的浓度区间内，随着其浓度由0，0．005,0．01μmol／L渐升至10μmol／L，E-选择素mRNA的表达呈逐渐升高的趋势。③阿托伐他汀钙对肿瘤坏死因子诱导人脐静脉内皮细胞表达细胞间黏附分子1的影响呈双向性，具有浓度差异性。即随着阿托伐他汀钙浓度由0,0．005,0．01μmol／L升至0．05μmol／L，细胞间黏附分子1 mRNA表达呈逐渐下降趋势，而在高浓度（0．05-10μmol／L）区间，随着阿托伐他汀钙浓度0．05，0．1μmol／L渐升至10μmol／L，细胞间黏附分子1 mRNA的量呈逐渐升高的趋势。 结论：在基因水平，阿托伐他汀钙对肿瘤坏死因子诱导血管内皮细胞黏附分子的表达有着确切的调节作用，且存在着浓度依赖性，并在不同的浓度区间，对不同的黏附分子作用不同。     

三七总皂苷对氧化型低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞血管细胞黏附分子1表达的影响

背景：氧化低密度脂蛋白能诱导血管内皮细胞活化和黏附分子表达,在动脉粥样硬化形成早期起重要作用。三七总皂苷在心血管系统方面具有保护血管内皮细胞、显著改善动脉粥样硬化病变程度的药理作用。目的：验证三七总皂苷对氧化型低密度脂蛋白损伤内皮细胞后血管细胞黏附分子1的表达及与人单核细胞黏附的影响。设计、时间及地点：体外实验,分组对照,于2007—03／2008—05在北京中医药大学东直门医院中医内科学教育部重点实验室完成。材料：原代人脐静脉内皮细胞为美国CascadeBiologics公司产品;三七总皂苷（血塞通冻干粉针）为黑龙江珍宝岛制药有限公司产品,成分为三七总皂苷,批号：20040207。方法：以培养原代人脐静脉内皮细胞作为靶细胞,用氧化型低密度脂蛋白造成人脐静脉内皮细胞损伤模型。将培养的人脐静脉内皮细胞分为5组：氧化型低密度脂蛋白组（100mg／L）、氧化型低密度脂蛋白＋三七总皂苷组（终浓度分别为200,100,50mg／L）、正常对照组。主要观察指标：光镜下观察细胞形态变化,四甲基偶氮唑盐法检测细胞活性;采用蛋白定量法检测人脐静脉内皮细胞与单核细胞的黏附率;用流式细胞仪测定人脐静脉内皮细胞的血管细胞黏附分子1的蛋白表达。结果：氧化型低密度脂蛋白作用人脐静脉内皮细胞后12,24．h时,人脐静脉内皮细胞损伤明显,细胞活性显著降低,人单核细胞与人脐静脉内皮细胞的黏附率显著升高,人脐静脉内皮细胞的血管细胞黏附分子1的蛋白表达水平也均明显升高,_均明显高于正常对照组（P〈0．05,P〈0．01）,而三七总皂苷能使氧化型低密度脂蛋白损伤的人脐静脉内皮细胞形态趋于正常,活性增强,并明显降低人单核细胞与人脐静脉内皮细胞的黏附率,以及显著降低血管细胞黏附分子1的蛋白的表达水平,与氧化型低密度脂蛋白组相比均有显著性差异（P〈0．05,P〈001）,这种作用随着剂量的增加而增强。结论：三七总皂苷能通过下调血管细胞黏附分子1的表达抑制单核一血管内皮细胞黏附,从而发挥对血管内皮细胞的保护作用,这可能是其治疗动脉硬化闭塞症的机制之一。     

辛伐他汀对人脐静脉内细胞CD40／CD40L表达的影响

目的：探讨辛伐他汀对氧化低密度脂蛋白刺激下的人脐静脉内皮细胞CD40／CD40L表达的影响。方法：实验于2004—03／06在中南大学湘雅二医院实验室完成。实验所用脐带于无菌条件下取自本院产房健康新生儿，产妇知情同意，实验符合赫尔辛基宣言中的伦理学标准。辛伐他汀原粉由杭州默沙东制药公司提供。原代培养人脐静脉内皮细胞，实验在第4代有70％细胞汇合的情况下进行。低密度脂蛋白快速分离后加入含10μmol／L硫酸铜的磷酸盐缓冲液氧化修饰24h，在准备后15d内用于实验。采用流式细胞技术检测CD40／CD40L在细胞上的表达，采用逆转录多聚酶链式反应检测NF-κBP65 mRNA，同时行细胞免疫化学染色检测细胞NF-κBP65的表达。观察辛伐他汀对氧化低密度脂蛋白刺激人脐静脉内皮细胞表达CD40／CD40L分子和NF-κB P65 mRNA的影响实验中，共分5组：①空白对照组，给予磷酸盐缓冲液。②氧化低密度脂蛋白刺激组，80mg／L氧化低密度脂蛋白与人脐静脉内皮细胞共同培养24h。③低浓度辛伐他汀组，先予1μmol／L辛伐他汀干预1h，再予80mg／L氧化低密度脂蛋白与人脐静脉内皮细胞共同培养24h。④高浓度辛伐他汀组，先予10μmol／L辛伐他汀干预1h，再予80mg／L氧化低密度脂蛋白与人脐静脉内皮细胞共同培养24h。⑤单纯辛伐他汀组，10μmol／L辛伐他汀干预25h。免疫化学检测人脐静脉内皮细胞NF-κBP65分子表达的实验中，共分3组：①空白对照组，给予磷酸盐缓冲液。②氧化低密度脂蛋白刺激组，80mg／L氧化低密度脂蛋白与人脐静脉内皮细胞共同培养24h。③辛伐他汀组，10μmol／L辛伐他汀干预1h，再予80mg／L氧化低密度脂蛋白与人脐静脉内皮细胞共同培养24h。结果：①氧化低密度脂蛋白刺激人脐静脉内皮细胞后CD40／CD40L的表达情况：20-80mg／L氧化低密度脂蛋白与人脐静脉内皮细胞共同培养24h后，CD40／CD40L的表达以浓度依赖和时间依赖的方式增加。②辛伐他汀对氧化低密度脂蛋白刺激的人脐静脉内皮细胞CD40／CD40L表达的影响：预先给予辛伐他汀（1μmol／L和10μmol／L）干预1h明显降低氧化低密度脂蛋白所致的CD40／CD40L表达，与单纯氧化低密度脂蛋白刺激组比较，差异显著（P均〈0．05）；10μmol／L的高浓度辛伐他汀较1μmol／L的低浓度辛伐他汀作用更明显（P〈0．05）；而单纯给予10μLmol／L的辛伐他汀干预不影响人脐静脉内皮细胞CD40／CD40L的表达。③辛伐他汀对NF-v：BP65 mRNA在人脐静脉内皮细胞表达的影响：人脐静脉内皮细胞中加入80mg／L氧化低密度脂蛋白培养24h后NF-κB mRNA的表达明显高于空白对照组（0．53&;#177;0．06，0．08&;#177;0．01，P〈0．01）。而预先给予1μmol／L辛伐他汀孵育lh显著降低氧化低密度脂蛋白刺激升高的NF-κB P65 mRNA，明显低于单纯氧化低密度脂蛋白刺激组（0．31&;#177;0．04，0．53&;#177;0．06，P〈0．01）。高浓度组（10μmol／L）作用更显著，显著低于单纯氧化低密度脂蛋白刺激组（0．14&;#177;0．04，0．53&;#177;0．06，P〈0．01），而单纯给予辛伐他汀（10μmol／L）不影响人脐静脉内皮细胞NF-κB P65 mRNA的表达。结论：氧化低密度脂蛋白以浓度和时间依赖的方式刺激人脐静脉内皮细胞表达CD40/CD40L，而辛伐他汀以剂量依赖的方式减轻氧化低密度脂蛋白刺激下人脐静脉内皮细胞CD40/CD40L的表达，可能与其抑制人脐静脉内皮细胞的NF—κBP65的表达有关。提示辛伐他汀可通过抑制高脂血症患者炎症信号通路而到达抗动脉硬化的作用。     

穿膜肽-凋亡蛋白融合蛋白导入人脐静脉内皮细胞和人肺腺癌Anip973细胞的生物学特性

目的：在大肠杆菌内表达穿膜肽与凋亡蛋白的融合蛋白，观察其诱导肺腺癌Anip973细胞凋亡的活性，并了解其是否有剂量依赖性。 方法：实验于2005-08／2006-01在哈尔滨医科大学生物化学与分子生物学教研室完成。①在大肠杆菌中表达穿膜肽-凋亡蛋白并用IDA-Ni^2＋亲和层析纯化。②细胞增殖抑制实验：取对数生长期人脐静脉内皮细胞和Anip973细胞接种于96孔培养板中，培养12h后加入终浓度分别为0，10，20，30，40，50mg／L融合蛋白培养48h，弃上清，每孔中加入四甲基偶氮唑盐溶液（5g／L）20μL，继续孵育4h，检测吸光度，计算肿瘤生长抑制率。③取对数生长期人脐静脉内皮细胞、Anip973细胞，每种细胞分成两组：给药组加入终浓度为30mg／L穿膜肽-凋亡蛋白，对照组加入相同体积的磷酸盐缓冲液，继续培养48h。苏木精-伊红染色，光镜下观察细胞形态；溴乙啶／丫啶橙荧光染色观察细胞凋亡率。 结果：①细胞增殖抑制实验结果表明浓度为10～50mg／L穿膜肽-凋亡蛋白对人脐静脉内皮细胞没有明显抑制作用，对Anip973细胞呈剂量依赖性抑制作用，半数抑制浓度为27mg／L。②30mg／L穿膜肽-凋亡蛋白作用48h后，人脐静脉内皮细胞形态没有显著改变，对照组和给药组的凋亡率分别为（2．9&;#177;0．4）％和（3．1&;#177;0．6）％，没有显著差异（P〉0．05）；Anip973细胞可见到细胞皱缩，染色质浓缩和出现凋亡小体等凋亡特征性形态变化，给药组和对照组凋亡率分别为（36．8&;#177;1．7）％和（6．7&;#177;0．5）％，差异显著（P〈0．01）。 结论：穿膜肽-凋亡蛋白能诱导肿瘤细胞凋亡，这种作用呈剂量依赖性，而对正常细胞没有毒性作用。     

人脐静脉内皮细胞分离培养及鉴定技术

目的探讨人脐静脉内皮细胞(HUVEC)体外分离原代培养的方法,并总结对培养的细胞鉴定方法。方法通过胰酶灌注法从人脐带获取内皮细胞进行分离培养,并采用免疫组化法及光镜和透射电镜观察超微结构鉴定所获得的细胞系。结果分离的HUVEC在体外7-10天左右可长成单层,光镜下胞体为单层铺路石状排列。第VⅢ因子相关抗原的检测为阳性。透射电镜下观察培养的内皮细胞胞浆内可见Weibel-Palade小体。结论用胰酶灌注法是获得脐静脉内皮细胞的有效方法。本方法为血管内皮细胞的研究提供了实验模型。     

人脐静脉内皮细胞中单核细胞趋化因子1表达与糖化白蛋白的影响

背景：研究表明，糖化白蛋白在内皮细胞凋亡过程中发挥重要作用，并通过增加丝裂原活化蛋白激酶、酪氨酸激酶活性和产生活性氧产物介导单核细胞趋化因子1。 目的：观察糖化白蛋白对培养的人脐静脉内皮细胞的单核细胞趋化因子1表达的影响。 设计、时间及地点：单一样本观察，于2006—05／11在东南大学心血管实验室完成。 材料：脐静脉内皮建株人脐静脉内皮细胞ECV304，引自中国科学院上海细胞生物研究所。 方法：实验分两部分，第一部分以糖化白蛋白（浓度为400mg／L）对人脐静脉内皮细胞分别干预0，8，16，24，48，72h；第二部分以不同浓度（100，200，400，800mg／L）的糖化白蛋白对人脐静脉内皮细胞干预24h。两部分实验均用无血清培养基RPMI 1640和不含牛血清白蛋白葡萄糖干预（浓度为400mg／L）的无血清培养基作为对照。 主要观察指标：四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法检测人脐静脉内皮细胞增殖，酶联免疫吸附法检测人脐静脉内皮细胞上清液单核细胞趋化因子1含量。 结果：①不同时间点糖化白蛋白对人脐静脉内皮细胞增殖的抑制作用依次为48h〉24h〉16h（相临时间点比较，P均〈0．05）；干预8h对细胞的抑制无明显作用，72h抑制作用弱于48h。②与RPMI1640组和牛血清白蛋白组相比，糖化白蛋白400mg／L及800mg／L对细胞的抑制作用明显增强（P〈0．05），并随着糖化白蛋白浓度的增高而增强。③用浓度为400mg／L的糖化白蛋白干预6h及12h，人脐静脉内皮细胞单核细胞趋化因子l表达持续升高（P〈0．05）；随着糖化白蛋白浓度加大，细胞的单核细胞趋化因子1表达进一步增高，800mg／L时达到最高峰。 结论：①糖化白蛋白以浓度、时间依赖方式抑制人脐静脉内皮细胞增殖，并在一定时间范围内呈时间依赖性地增加人脐静脉内皮细胞表达单核细胞趋化因子1表达。     

人脐静脉内皮胞细体外培养及鉴定

目的探索人脐静脉内皮细胞体外培养及鉴定的方法。方法采用0.1%Ⅰ型胶原酶分离脐静脉内皮细胞,加入含10%胎牛血清及人AB血清的M1640培养基,在37℃,5%CO2孵箱中培养,以免疫组化方法对内皮细胞进行鉴定。结果原代培养细胞在接种4 h后开始贴壁生长,5～7 d后融合成单层,倒置相差显微镜下观察细胞呈鹅卵石状排列,有接触抑制现象,免疫组化显示细胞胞浆中人Ⅷ因子相关抗原阳性。结论用胶原酶灌注消化脐静脉是获得内皮细胞的一种可靠的方法,有助于体外研究血管内皮细胞模型的构建。     

细胞外基质凝胶支架混合人脐静脉来源内皮细胞构建组织工程化的内皮细胞片层

背景:由于血管内皮细胞是形成血管网络的主要功能细胞,因此通过在支架复合体中复合血管内皮细胞的方式促进再造心肌的血管化是目前研究的热点。目的:以细胞外基质凝胶为支架混合人脐静脉内皮细胞,观察内皮细胞在细胞外基质凝胶中的生长过程及发育情况。设计、时间及地点:观察实验,于2006-11/2008-01在解放军军事医学科学院基础医学研究所组织工程研究室实验室完成。材料:取健康剖腹产孕妇的脐带分离培养人脐静脉内皮细胞。取新生SD大鼠鼠尾制备Ⅰ型液态胶原溶液。方法:将2.4g/L液态Ⅰ型胶原与2×M199培养基等比例混合,用0.1mol/LNaOH调为中性,加入分离培养3d的人脐静脉内皮细胞,使其终浓度为4×109L-1,再加入200g/L的Matrigel基质凝胶。最后加入有静态拉伸力的组织工程化片层所需的模具中,构建组织工程化内皮细胞片层。主要观察指标:体外培养20d后光学显微镜、常规苏木精-伊红染色、免疫组织化学染色和透射电镜观察。结果:显微镜下观察可见内皮细胞在细胞外基质凝胶中形成明显的管腔样、分支样、类似血管样结构。通过组织学和免疫组织化学的检测,证实其确为来源于人脐静脉中分离培养的内皮细胞。电镜观察可见随着时间的延长,在组织工程化内皮细胞片层中,内皮细胞可形成管腔,细胞间有紧密连接。结论:以细胞外基质凝胶为支架混合人脐静脉内皮细胞构建的组织工程化内皮细胞片层中具有类似血管样结构。     

血管内皮细胞体外培养方法的实验研究

目的:研究人脐静脉内皮细胞分离培养和鉴定的方法.方法:胰蛋白酶消化脐静脉,脐静脉内皮细胞培养液,贴壁法,37℃,5%CO2细胞培养箱中原代培养,培养2周后免疫组织化学染色鉴定内皮细胞.结果:培养的内皮细胞的形态学观察到脐静脉内皮细胞一般2 h就能贴壁,24 h后,变成梭形.形成数量不等的细胞群.48～72h后生长最快,约5～7 d细胞融合成单层,呈典型的镶嵌状铺路石样.内皮细胞鉴定示90%以上vWF胞浆内阳性显色.结论:脐静脉来源的内皮细胞数量,可以满足实验研究需要.     

妊娠期高血压病患者胎儿脐静脉内皮细胞模型的建立及血管紧张素Ⅱ表达的检测

目的：探索建立妊娠期高血压病患者胎儿脐静脉内皮细胞模型的优化方法并对该细胞模型中血管紧张素Ⅱ表达量进行分析。方法：取妊高症孕妇脐带（约8cm）,用PBS冲洗和灌注胰蛋白酶（浓度为1%）消化法分离脐静脉内皮细胞,用McCoy＇s 5A培养基进行原代和继代培养;用吖啶橙（AO）细胞荧光染色进行细胞的形态学鉴定;用免疫组织化学分析所分离细胞的来源;用Western blotting检测血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）的表达情况。结果：利用1%的胰蛋白酶灌注消化可以获得大量的原代细胞,并且在不添加任何生长因子的情况下,使用McCoy＇s 5A培养基进行原代和继代培养可以实现连续传代6代以上,且细胞状态良好,生长稳定。AO染色鉴定显示细胞边缘平整,细胞核小且形态完整,符合正常细胞的形态。免疫组化鉴定结果表明在所分离的细胞中人VⅡI因子及血管内皮生长因子（VEGF）相关抗原呈强阳性。Western blotting检测发现在所分离的细胞中AngⅡ表达量远远高于普通细胞[（90.20±5.84）%,P=0.0130]。结论：1%浓度的胰蛋白酶灌注消化法与McCoy＇s 5A培养基培养法是体外建立妊娠期高血压病患者胎儿脐静脉内皮细胞模型的高效经济的方法,该模型高表达血管紧张素Ⅱ,推测AngⅡ可能是诱发妊高症的原因之一。     

人脐带内皮细胞与平滑肌细胞的分离培养特照

目的：如何便捷有效地获取种子细胞是构建组织工程皮肤、角膜、血管等成功与否的关键，实验对人胎儿脐带内皮细胞和平滑肌细胞的分离、纯化、培养扩增技术进行探讨。方法：实验于2006—11在暨南大学医学院完成。①实验材料：剖宫产正常胎儿脐带由暨南大学第一临床学院提供，产妇均知情同意。②实验方法：配制培养液，A液为在M199培养液中加入20％胎牛血清、20mg，L肝素、10μg／L碱性成纤维细胞生长因子，B液为在M199培养基中加入10％胎牛血清、250mg／L G418。取脐带15-20cm，采用胶原酶“灌注消化法”获取脐带内皮细胞制成悬液，静置0．5h后利用成纤维细胞短时间内贴壁的特点，把尚未贴壁细胞吸出重新接种于含有A液的培养瓶，初步去除部分成纤维细胞，细胞贴壁24h后将培养液换为B液，继续培养3d，去除成纤维细胞，然后再用A液扩大培养。从消化完脐静脉内皮细胞的脐带中剥取脐动脉，刮除内皮细胞，将血管条剪成小块均匀贴于培养瓶底，培养瓶内加入含20％小牛血清的DMEM培养液2mL，缓慢竖直培养瓶，以培养液刚未浸没培养块为最佳，放入37℃、体积分数为0．05的CO2培养箱内干涸8h后，将培养瓶轻轻翻转，使植块刚浸入培养液中，绝对静置3d，以后每3d换液1次，待植块周围生长晕的细胞融合成片时，即可传代，传代后DMEM培养液的血清浓度由原来的20％改为5％，且在培养液中加入0．2L肝素。⑧实验评估：通过倒置相差显微镜观察细胞生长情况，分别以第Ⅷ因子、α-肌动蛋白免疫组织化学染色法鉴定内皮细胞和平滑肌细胞。结果：①内皮细胞的生长观察：接种24h后，镜下可见刚贴壁的细胞呈圆形，逐渐转变为多角形或梭形，胞间可见有成纤维细胞混杂，加入B液3d后成纤维细胞逐渐死亡。传代细胞呈“铺路石”样，细胞周围特别是近胞核处可见明显光晕，为典型的内皮细胞生长特点。②内皮细胞第Ⅷ因子相关抗原的检测：胞浆丰富且有棕黄色颗粒，细胞核不着色，呈阳性反应。⑧平滑肌细胞的生长观察：镜下组织块贴壁后5～7d可见有少数细胞从植块边缘游出，第10-15天植块周围形成明显的细胞生长晕．细胞呈长梭形、带状或三角状，有1-4个细胞核，可见半透明颗粒，第20-25天细胞密集、平行排列，形成“峰谷样”结构，是平滑肌细胞的特征性生长表现。④平滑肌细胞特异性α-肌动蛋白单克隆抗体检测：胞浆内可见棕黄色细丝，为特异性α-平滑肌肌动蛋白，细胞核不着色。结论：以胎儿脐带作为种子细胞的来源，成功分离后通过调节培养液的成分，既能排除成纤维细胞的污染又可以令内皮细胞和平滑肌细胞快速增殖。     

蜂胶乔松素对脂多糖诱导人脐静脉内皮细胞的保护作用

目的:观察蜂胶乔松素对脂多糖诱导人脐静脉内皮细胞的影响,探讨其对人脐静脉内皮细胞可能的保护作用。方法:实验于2006-03/10在泰山医学院生命科学研究所(省重点实验室)完成。①实验材料:取出生1h内新生儿脐带,患者知情同意。②实验分组及方法:培养人脐静脉内皮细胞,建立脂多糖损伤模型(以10mg/L的脂多糖培养液培养细胞12h),实验分为空白对照组(加等量D-Hank’s液)、脂多糖组(10mg/L)、乔松素组(加10mg/L脂多糖预孵育12h后,按50,100,200mg/L分别加入乔松素),各组设8个复孔,共同孵育24h。③实验评估:光镜下观察细胞形态,MTT法观察乔松素对人脐静脉内皮细胞活性的影响,ELISA方法检测培养上清中血管假血友病因子的含量,TUNEL检测细胞凋亡率。结果:①细胞形态:空白对照组细胞紧密贴壁,呈铺路石状生长。脂多糖组可见多数细胞呈圆形;乔松素组见上述细胞较脂多糖组明显减少。②乔松素对人脐静脉内皮细胞活性、凋亡及血管假血友病因子含量的影响:与对照组比较,脂多糖组能明显诱导人脐静脉内皮细胞的凋亡(P<0.01),不同浓度乔松素组可改善内皮细胞形态,组织活性明显升高(P<0.05),同时抑制内皮细胞血管假血友病因子的释放(P<0.05),使脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡细胞数明显减少(P<0.05)。结论:乔松素能增强人脐静脉内皮细胞活性,抑制脂多糖诱导人脐静脉内皮细胞的凋亡,从而发挥可能的内皮细胞保护功能。     

同型半胱氨酸通过核因子κB途径诱导人内皮细胞表达RANTES mRNA和蛋白的表达

目的：观察同型半胱氨酸诱导培养人脐静脉内皮细胞表达RANTES mRNA及蛋白，并分析其机制。方法：实验于2004-11／2005-11在新乡医学院分子生物研究室完成。①采用酶消化法分离脐静脉内皮细胞。②当脐静脉内皮细胞生长至汇合状态时。随机分为对照组、同型半胱氨酸组和二硫代氨基甲酸吡咯烷预处理组。对照组用无血清培养基、同型半胱氨酸组用含0．1mmol／L同型半胱氨酸的无血清培养基培养，分别孵育8h；二硫代氨基甲酸吡咯烷预处理组用含100μmol／L二硫代氨基甲酸吡咯烷的无血清培养基培养20min后，再加入0．1mmol／L的同型半胱氨酸孵育8h。③采用斑点杂交检测脐静脉内皮细胞中RANTES mRNA的表达。④采用Western blot检测脐静脉内皮细胞中RANTES蛋白的表达。⑤用免疫细胞化学方法检测正常对照组和同型半胱氨酸组核因子κB P65蛋白的表达。结果：①脐静脉内皮细胞中RANTES mRNA的表达：图像分析显示。同型半胱氨酸组、二硫代氨基甲酸吡咯烷预处理组的积分吸光度值分别为18790和16420，分别为对照组（积分吸光度值为12680）的1．48倍和1．29倍。②脐静脉内皮细胞中RANTES蛋白的表达：图像分析显示，同型半胱氨酸组RANTES蛋白印迹条带的积分吸光度值为0．7942．而二硫代氨基甲酸吡咯烷预处理组的积分吸光度值为0．5013，分别是对照组（0．2930）的2．72倍和1．72倍。③脐静脉内皮细胞中核因子κB P65蛋白的表达：在对照组脐静脉内皮细胞中，核因子κB P65蛋白的表达以细胞质为主；同型半胱氨酸刺激后，细胞核染色的阳性率明显增加，由对照组的8.3％上升到43．5％（P〈0．01）。结论：同型半胱氨酸能诱导人脐静脉内皮细胞表达RANTES mRNA和蛋白，核因子κB可能参与了该过程。同型半胱氨酸可能通过诱导内皮细胞表达RANTES在动脉粥样硬化形成中起作用。     

降血压肽对人脐静脉内皮细胞增殖及内皮素表达的影响

背景：降血压肽是一类能够降低人体血压的多肽，可通过抑制人体血管紧张素Ⅱ的生成而达到降低血压的作用。目的：在细胞分子水平探讨降血压肽对人脐静脉内皮细胞生长及内皮素表达的影响，为进一步将降血压肽开发为降压保健食品提供实验依据。设计：重复测量设计。单位：华南理工大学生命科学与工程学院，深圳职业技术学院应用生物技术系。材料：实验于2004-09／2005-03在深圳职业技术学院应用生物技术研究所完成。降血压肽由深圳职业技术学院应用生物技术研究所制备，在一定条件下抑制血管紧张素转移酶活性一半时所需要的抑制剂浓度为15μmol／L。传至4代的人脐静脉内皮细胞用于实验，随机分为7组：空白对照组、降血压肽150mg／L组、降血压肽300mg／L组、降血压肽600mg/L组、卡托普利阳性对照组、去甲肾上腺素阴性对照组、降血压肽＋去甲肾上腺素组。方法：①脐静脉内皮细胞按一般细胞培养方法进行，培养液为M199＋体积分数为0．15的小牛血清＋青霉素10000U／mL＋链霉素100mg／L。细胞长满致融合状态后，按1：2比例传代，传至第4代的细胞用于实验。②空白对照组含体积分数为0．15小牛血清的M199；降血压肽150，300，600ms／L组在此基础上加入降血压肽至终浓度分别为150，300，600mg／L；卡托普利阳性对照组在此基础上加入卡托普利至终浓度为10^-5mol／L；去甲肾上腺素阴性对照组在此基础上加入去甲肾上腺素终浓度为100μg／L；降血压肽＋去甲肾上腺素组在此基础上加入降血压肽至终浓度300mg／L，去甲肾上腺素至终浓度100μg／L。（3）采用细胞计数法测定各组细胞生长状况，放免法测定不同培养时间各组细胞培养液中内皮素含量，反转录聚合酶链式反应法测定内皮素mRNA的表达，免疫组化测定细胞内皮素蛋白的表达。’主要观察指标：①降血压肽对内皮细胞增殖、分泌内皮素的影响。②降血压肽对内皮细胞内皮素mRNA、内皮素蛋白表达的影响。结果：①降血压肽对内皮细胞增殖、分泌内皮素影响：随着培养时间的延长，与空白对照组比较，卡托普利阳性对照组及降血压肽各剂量组均有抑制内皮细胞生长、降低培养液中内皮素含量的作用（P〈0．01或0．05）；去甲肾上腺素可促进内皮细胞的生长和分泌内皮素，但加入降血压肽后细胞密度和内皮素含量均接近空白对照组（P〉0．05）。（函降血压肽对内皮细胞内皮素mRNA、内皮素蛋白表达的影响：与空白对照组比较，阳性对照卡托普利组及降血压肽各剂量组均可下调内皮素mBNA和内皮素蛋白的表达（P〈0.01或0．05）；去甲肾上腺素可上调内皮素mRNA和内皮素蛋白的表达，加入降血压肽后各基因表达接近空白对照组俨〉0．05）。结论：不同剂量的降血压肽对内皮细胞均有抑制生长作用，可降低细胞释放内皮素的含量，下调内皮素基因的表达，且能够有效对抗去甲肾上腺素的促脐静脉内皮细胞生长及分泌作用。     

胰岛素样生长因子Ⅰ抑制氧化型低密度脂蛋白诱导内皮细胞凋亡的体外试验

目的：胰岛素样生长因子Ⅰ作为重要的促细胞生长因子之一，其对内皮细胞凋亡影响的报道不多。实验拟验证和探讨胰岛素样生长因子Ⅰ对氧化型低密度脂蛋白诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的抑制作用及可能机制。 方法：实验于2006—12／2007—07在华中科技大学同济医学院协和医院心血管疾病研究所完成。①实验材料及分组处理：取人新鲜脐带（产妇或家属签署知情同意书）分离培养人脐静脉内皮细胞，分为：胰岛素样生长因子Ⅰ组（1×10^-9mmol／L）、氧化型低密度脂蛋白（200mg／L）＋胰岛素样生长因子Ⅰ组（1×10^-9mmol／L）、氧化型低密度脂蛋白（200mg／L）组、正常对照组。分别在细胞培养24h后加入。②实验评估：采用四甲基偶氮唑盐法测定细胞活力；DAPI细胞核荧光染色法观察细胞凋亡的形态学变化及细胞凋亡率的测定；并进行内皮细胞caspase-3活性的检测。 结果：①氧化型低密度脂蛋白可明显抑制人脐静脉内皮细胞增殖，胰岛素样生长因子Ⅰ与氧化型低密度脂蛋白共同加入后，细胞增殖率明显上升（P〈0．05）。②氧化型低密度脂蛋白可诱导人脐静脉内皮细胞发生凋亡，而加入胰岛素样生长因子I刺激后细胞凋亡率降低（P〈0．05）。③caspase-3活性检测表明与对照组相比，氧化型低密度脂蛋白能明显上调caspase-3的表达，而胰岛素样生长因子Ⅰ＋氧化型低密度脂蛋白组caspase-3活性则降低（P〈0．05）。 结论：胰岛素样生长因子Ⅰ对氧化型低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡具有抑制作用，可能与其下调caspase-3蛋白表达有关。     

体外诱导骨髓CD34+细胞生成血管内皮细胞的方法

目的：体外分离狗骨髓CD34^ 细胞，建立诱导分化血管内皮细胞的方法，并进行生物学鉴定。方法：利用免疫磁珠法分离狗骨髓CD34^ 细胞，在体外经血管内皮细胞生长因子（VEGF）、内皮细胞生长因子（EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（hFGF)诱导后，观察细胞生长状况，以光镜、电镜进行形态学鉴定，应用免疫组化方法检测冯维靳布兰德因子（Von Willebrand factor,vWF)表达。结果：光镜下细胞单层融合生长，呈铺路石样形态，单个核位子中央，细胞群体倍增时间为35h。电镜下可见到Weibel-Palade小体，在细胞胞浆vWF染色阳性。结论：采用免疫磁珠法可从骨髓获得高纯度的CD34^ 细胞，在体外诱导分化成血管内皮细胞。