肝窦内皮细胞的分离纯化及鉴定方法

肝窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cells,LSEC)是肝脏非实质细胞(nonparenchymal cell,NPC)的主要细胞群,占这些细胞数的40％左右,由LSEC组成的肝窦壁是全身毛细血管壁中唯一缺乏基底膜的毛细血管,同时LSEC具有特殊的标志性结构-窗孔.肝窦内皮细胞不仅在形态上与其他血管内皮细胞不同,在功能上也有不同.肝窦内皮细胞组成肝窦壁,构成血流与肝细胞间的屏障,在调节肝窦血流与周围组织的物质交换中起有效的中枢性作用,对于维持正常的肝功能起十分重要的作用.在物质代谢方面,L.SEC在脂质、胆固醇和维生素A的平衡和分配方面具有重要的作用,同时能通过特异的内吞作用清除变性的大分子脂质、某些细胞外基质成分,在维持肝窦的正常生理功能方面发挥重要作用;在免疫方面,ISEC的位置使其可以第一时间与抗原接触,启动免疫应答,同时近年来发现LSEC能诱导T细胞免疫耐受,这在肝移植中有重要意义;此外,研究发现LSEC损伤在肝脏冷保藏和缺血再灌注损伤中占中心地位,而LSEC在缺血再灌注损伤以及冷保藏中的损伤机制也是近几年的研究热点.     

结缔组织生长因子在血吸虫病肝纤维化鼠肝窦内皮细胞中的表达及意义

目的:动态观察结缔组织生长因子(CTGF)蛋白在血吸虫病肝纤维化鼠肝窦内皮细胞表达水平的时相变化,探讨其与肝窦内皮细胞下基底膜形成的关系。方法:采用腹部敷贴法建立血吸虫病肝纤维化模型,HE、Masson染色和透射电镜观察其病理变化;免疫组化技术检测CTGF、Ⅳ型胶原(ColⅣ)和层粘连蛋白(LN)在小鼠肝脏组织中的表达和分布;并应用彩色图像分析仪进行定量分析。结果:与正常对照组比较,模型组鼠肝窦内皮细胞表达CTGF蛋白阳性或强阳性,肝窦壁LN、ColⅣ表达水平增高,且随着肝纤维化的发展,CTGF和LN、ColⅣ表达逐渐增强,肝窦内皮下基底膜逐渐增厚。图像定量分析两组平均吸光度值、平均灰度值和阳性面积比具有统计学差异;CTGF蛋白与LN、ColⅣ水平呈正相关。结论:血吸虫病肝纤维化时小鼠肝窦内皮细胞通过CTGF蛋白表达上调,调控细胞外基质产生,导致ColⅣ、LN分泌增加,参与肝窦内皮下基底膜形成,从而引起肝内微循环障碍。     

肝纤维化形成过程中Ⅰ型血管紧张素Ⅱ受体表达的研究

目的 :探讨Ⅰ型血管紧张素Ⅱ受体 (AngiotensinⅡType1Receptor,AT1R)在人肝脏组织中的表达情况。方法 :运用免疫组织化学SABC法和间接免疫荧光标记法 ,对 12例正常肝组织及 18例纤维化肝组织进行检测。结果 :AT1R阳性表达主要分布在肝小叶周边及肝窦区星形细胞 (HepaticStellateCell,HSC)的胞浆内。 12例正常肝组织中 8例呈阳性表达 ,18例纤维化肝组织均表达AT1R ,且纤维化组阳性细胞数明显多于正常组 (P <0 0 0 1)。结论 :AT1R在肝星形细胞胞浆中的表达随肝纤维化的发展明显增强 ,并且可能在肝纤维化的发生发展中发挥着一定作用。     

肝窦状内皮细胞(LSECs)与肝脏免疫耐受

肝脏是机体重要的免疫器官,其解剖部位和功能特性决定了肝脏具有独特的免疫机制。一方面需要强大的免疫应答能力抗感染,另一方面需要强有力的调节机制避免不必要的免疫激活,而后者主要通过免疫耐受来实现。在肝脏的免疫防御系统中,肝窦状内皮细胞通过抗原特异性的免疫耐受诱导以及T淋巴细胞的凋亡诱导与清除,从而在肝脏的局部免疫以及全身免疫调控、器官移植耐受以及病毒感染的慢性化等生理病理过程中发挥着关键作用。     

肝靶向纳米给药系统治疗肝纤维化的研究进展

肝纤维化是慢性肝损伤早期重要的病理特征,可以通过药物治疗逐渐逆转消退.传统药物存在药效下降及对正常器官的毒副作用等问题.运用纳米技术开发的给药系统,可以保护药物,克服生物屏障,将药物定向递送到指定区域发挥作用.在肝损伤修复过程中,肝实质细胞(HC)、肝星状细胞(HSC)、枯否细胞(KC)和肝窦内皮细胞(LSEC)均起到关键作用.肝靶向纳米药物可专门针对肝脏细胞,基于它们的摄取能力和调节能力实现药物靶向性,更有效地发挥药物抗炎和抗纤维化治疗作用,降低毒副作用,逆转肝纤维化.就纳米技术应用于肝纤维化靶向治疗的研究进展作一综述.     

瘦素与肝纤维化

瘦素主要由白色脂肪组织产生 ,有广泛的全身生物学效应。目前国内外研究主要集中于瘦素与活化HSC间的关系、瘦素对TGF α ,TNF ,TIMP 1等细胞因子的分泌调控 ,以及瘦素对肝纤维化的胶原产生及降解过程的影响等方面。但瘦素受体的功能及其在肝脏中的分布、瘦素与窦内皮细胞、Kuppfer细胞等其他肝窦内细胞间作用的研究则相对较少     

p-moesin在血吸虫病肝纤维化鼠肝窦内皮细胞中的表达及意义

目的:动态观察血吸虫病肝纤维化鼠肝窦内皮细胞moesin表达水平的时相变化,探讨其与肝窦内皮细胞失窗孔化的关系。方法:采用腹部敷贴法感染血吸虫尾蚴建立血吸虫病性小鼠肝纤维化模型,除正常对照组(A组,10只)外,78只成模小鼠分为血吸虫病组(B组,24只)、吡喹酮(Biltricide)杀虫片治疗组(C组,18只)、Rock抑制剂(Hydroxyfasudil)治疗组(D组,18只)、Biltricide+Hydroxyfasudil治疗组(E组,18只),分别于治疗第16周、19周、21周分批剖腹取各组小鼠肝组织进行HE、Masson染色;同时Western blotting检测p-moesin蛋白表达,透射电镜观察超微结构。结果:与A组相比,B组肝组织p-moesin蛋白表达量增加。给予药物干预后,D组、E组p-moesin蛋白降低,16周时最为明显,但D组于19周开始逐渐恢复到原水平,而E组继续下降,明显低于D组。肝窦超微结构观察,药物干预21周时,C组与D组相比,肝组织炎性细胞明显减少,Disse腔内胶原纤维有所减少,但肝窦内皮细胞窗孔、肝窦内皮下基底膜无明显好转。E组与C组比较肝细胞器形态明显恢复,可见窗孔,未见基底膜。结论:血吸虫病肝纤维化小鼠肝窦内皮细胞通过p-moesin蛋白表达上调,参与肝窦内皮细胞失窗孔化,从而引起肝内微循环障碍。     

肝纤维化时肝脏OPN和PAI-1的表达变化

目的:研究骨桥蛋白(OPN)及纤溶酶原激活物抑制物(PAI-1)的表达特征及其在肝纤维化时的变化。方法:采用二甲基亚硝胺制作大鼠肝纤维化模型,大鼠肝脏常规HE和天狼猩红染色,采用SABC法做免疫组织化学染色及Western blotting检测OPN和PAI-1蛋白表达,抽提肝组织总RNA,RT-PCR检测OPN mRNA表达。结果:正常大鼠肝组织OPN和PAI-1表达极弱,肝纤维化大鼠肝脏中OPN表达增强,阳性信号散在或弥漫性分布,主要见于小叶内中央静脉周围、纤维间隔内以及周围巨噬细胞胞浆、枯否氏细胞、汇管区的部分肝细胞、肝窦壁内皮细胞。PAI-1在肝纤维化大鼠肝组织汇管区、肝细胞变性坏死处,肝窦周Disse间隙及毗邻以上部位的肝细胞,组织纤维间隔处及其外周细胞亦见阳性染色。Western blotting检测正常大鼠肝脏OPN的蛋白表达极低,肝纤维化组OPN的蛋白表达较正常组显著增强(P0.01)。与正常组比,肝纤维化组PAI-1表达也显著增强。RT-PCR检测结果显示,正常大鼠肝脏OPN mRNA表达极低,肝纤维化大鼠肝脏OPN mRNA的表达明显增强(P0.05)。研究结果证明,肝纤维化时大鼠肝组织OPN及PAI-1的表达水平显著增高。结论:肝纤维化时大鼠肝组织OPN及PAI-1的表达水平显著增高,OPN可能会促进PAI-1的高表达,从而抑制ECM降解、加速肝纤维化进程。     

IL-34与肝纤维化

IL-34是近年来发现的白介素家族的新成员,它是集落刺激因子受体1(colony stimulating factor 1receptor,CSF-1R)的另一个配体。目前,已知IL-34和巨噬细胞集落刺激因子受体(macrophage-colony stimulating factor,M-CSF)的功能相似,在各种炎性和自身免疫性疾病中发挥着重要的作用。此外,在纤维化肝脏中检测到过度表达的IL-34,提示IL-34可能在肝纤维化的免疫发病机制中起了一定作用。因此,研究IL-34与肝纤维化的关系有助于更深入了解肝纤维化发生的炎症反应机制,为疾病的防治提供新的方向,现对IL-34与肝纤维化作一综述。     

组织蛋白酶B在大鼠肝脏的分布

目的研究组织蛋白酶B(cathepsins B,CB)在正常SD大鼠肝脏组织中的表达。方法采用免疫荧光组织化学的方法,观察CB在大鼠肝脏组织中的分布。结果 CB免疫反应阳性细胞主要分布在肝细胞、枯否细胞、肝窦内皮细胞,枯否细胞、肝窦内皮细胞的免疫活性比较强,肝细胞的免疫活性比较弱,而肝星状细胞没有CB免疫活性。阳性物质分布于细胞质,细胞核阴性。结论 CB在大鼠肝脏组织的表达提示其可能在肝脏起着非常重要的作用。     

肝星形细胞的研究进展

肝星形细胞（HSCs）是肝脏中具有储存脂质特别是维生素A、合成细胞外基质、调节肝窦微循环等功能的非肝实质细胞,它们与多种肝脏疾病,特别是肝纤维化密切相关。我们简要总结了近几年有关肝星形细胞的分离、鉴定、增殖及增殖调控、在肝再生、肝病等中作用的研究进展。     

C-met蛋白和α平滑肌肌动蛋白在肝纤维化大鼠部分肝切除后肝组织中的表达

目的:研究 C-met 蛋白和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)在肝纤维化大鼠部分肝切除后肝组织中的表达情况及两者之间的关系.方法:成年雄性 SD 大鼠正常组、肝纤维化组和肝纤维化大鼠部分肝切除组(PH).免疫组织化学、免疫荧光组织化学和免疫印迹法检测各组大鼠肝组织中 C-met 蛋白和α-SMA 的表达情况.结果:肝纤维化大鼠部分肝切除后肝组织中 C-met 蛋白和α-SMA 的表达都呈现出先降低后升高的规律,两者的变化具有高度的相关性.结论:C-met 蛋白和α-SMA 在纤维化肝再生过程中的表达都呈现出先降低后升高的规律性变化,肝星状细胞活化可能是纤维化肝再生过程中 C-met 蛋白表达的重要影响因素.     

SE—S抗原的发现及其组织化学与超微结构分布

通过肝脏酶解灌流和密度梯度离心法获得的肝窦内皮细胞作为免疫原，建立一株单克隆抗体ＳＥ－Ｓ，它特异性识别大鼠肝窦内皮细胞，而与其它类型的内皮细胞或非内皮细胞无交叉反应。免疫电镜及免疫印迹分析显示，此抗体所识别的抗原（ＳＥ－Ｓ抗原）位于肝窦内皮细胞的膜表面和胞饮小泡的内表面，分子量为４４￣４８ｋＤ。以上结果说明ＳＥ－Ｓ抗原与肝窦内皮细胞的特殊功能密切相关。因此，对于研究不同病理，生理状态下的肝脏，ＳＥ     

裸鼠肝窦内皮细胞的分离、培养及鉴定

背景：建立裸鼠肝窦内皮细胞的原代分离培养方法,进一步研究其生长特点及生物学特性。 目的：建立裸鼠肝窦内皮细胞的原代分离、培养方法,并鉴定其纯度及观察其生物学特性。   方法：无菌下摘除裸鼠肝脏,剪成 1 mm3大小,Ⅳ型胶原酶在 37 ℃恒温下消化,应用CD146免疫磁珠分选肝窦内皮细胞,在倒置显微镜观察内皮细胞形态及生长特性,用von-Willebrand因子免疫细胞化学验证分选细胞的表面蛋白表达,鉴定肝窦内皮细胞的纯度,Hochest 33342 测定凋亡。 结果与结论：分离的肝窦内皮细胞纯度达95%以上,活力好,光镜下可以看到典型的铺路石样形态,von-Willebrand因子免疫细胞化学染色阳性。肝窦内皮细胞在体外培养3周后凋亡。提示Ⅳ型胶原酶消化加CD146免疫磁珠分选肝窦内皮细胞纯度高,方法可靠。        

大鼠肝纤维化过程中肝组织黏着斑激酶表达增加

本研究采用胆总管结扎 (BDL)方法建立大鼠肝纤维化模型 ,应用免疫组织化学、Westernblotting技术及逆转录聚合酶链式反应 (RT PCR)方法 ,研究了FAK及其mRNA在肝纤维化不同时期肝组织中的分布及含量的动态变化 ;用免疫组织化学方法测定α 平滑肌肌动蛋白 (α SMA)表达。结果显示 :正常肝组织有少量α SMA、FAK分布 ,随着肝纤维化发展 ,α SMA、FAK阳性细胞明显增多 ;正常大鼠肝组织中亦有FAK蛋白、FAKmRNA表达 ,造模 4周表达最多。FAK与α SMA呈显著正相关 (r=0.96 3,P <0.0 5 )。提示肝纤维化形成过程中FAK及其mRNA表达明显增加 ,FAK在HSCs增殖及肝纤维化形成过程中发挥作用     

四氯化碳诱导肝纤维化早期大鼠肝窦内皮细胞及基底膜形态改变的动态研究

 目的：探讨四氯化碳诱导肝纤维化早期大鼠肝窦毛细血管化的形成过程。方法：清洁级雄性SD大鼠采用随机数字表法随机分为2组：正常对照组（N组,6只）和肝纤维化模型组（M组,32只）。M组大鼠腹腔注射50%四氯化碳蓖麻油混合液, N组大鼠腹腔注射生理盐水,剂量为2 mL/kg,每周2次,共4周。分别于造模第3天、1周、2周和4周处死大鼠,HE染色和Masson染色观察肝脏组织炎症及纤维化的改变,透射电镜观察肝窦内皮细胞（LSECs）窗孔与基底膜（BM）的改变,免疫组织化学检测LSECs表面标志物CD31及基底膜成分IV型胶原（Col IV）和层黏连蛋白（LN）的改变。结果：HE及Masson染色显示四氯化碳造模4周早期肝纤维化已形成。肝组织透射电镜显示四氯化碳造模第3天后开始出现LSECs窗孔直径变小及数目减少,随着造模时间的延长,LSECs失窗孔现象逐步严重,至第4周时局部内皮下可见连续的基底膜。免疫组化染色显示LSECs表面标志物CD31表达随着LSECs窗孔数目的减少而逐渐增强;基底膜成分Col IV于造模第2周时表达开始显著增强并随着造模时间延长表达逐渐增强,LN于造模第4周时表达开始显著增强。结论：肝纤维化早期大鼠局部肝组织可见典型的肝窦毛细血管化形成;肝窦壁内LN沉积是肝窦毛细血管化时形成连续基底膜的关键因素。     

转化生长因子-β在肝纤维化形成中的作用及意义

转化生长因子 β(TGF β)是一类多肽生长因子 ,通过与其受体结合发挥生物学作用。Mφ、内皮细胞、胆管上皮细胞、淋巴细胞、血小板、肝细胞及活化的肝星状细胞可能是肝脏TGF β的来源细胞。TGF β在肝纤维化形成过程中的主要作用是促进细胞外基质的合成 ,其机制可能与其通过不同途径增加胶原基因表达和增加肝星状细胞增殖有关。TGF β可能成为反映肝纤维化的血清学指标 ,TGF β反义基因治疗可能成为肝纤维化的血清学指标 ,TGF β反义基因治疗可能成为肝纤维防治的一种有效措施。     

枯否细胞的负向免疫调节作用

目前认为肝脏是淋巴器官,它倾向于产生免疫耐受而非免疫应答。枯否细胞(KC)是肝内固有的巨噬细胞,其在发挥免疫防御的过程中可释放多种化学介质介导肝损伤并参与肝纤维化的病理改变。近来研究发现活化的KC与肝脏免疫耐受的形成和维持有关,KC能够分泌免疫抑制性细胞因子,抑制T细胞增殖并诱导T细胞凋亡,从而发挥负向免疫调节功能。对KC负向免疫调控的研究将大大拓展对致耐受性APC尤其是巨噬细胞的认识与理解,为深入研究肝脏内环境稳定和免疫耐受形成的机制开拓新的思路。     

固有免疫信号因子MyD88在CCl4致大鼠肝纤维化模型中的表达

目的观察固有免疫信号因子MyD88在肝纤维化大鼠肝脏中的表达特点,探讨MyD88与肝纤维化发生发展的关系。方法将40只SD大鼠随机分成正常对照组和实验组,以四氯化碳皮下注射和高脂低蛋白饮食复制大鼠肝纤维化模型。在制备模型实验过程中的第6个月根据不同检测目的进行取材。石蜡切片常规HE染色和免疫组化实验,另一部分标本直接进行RT-PCR实验和Western blot实验检测。结果 HE结果显示,正常组大鼠肝小叶结构罗列规则有序,未见大量炎性细胞等异构细胞出现。而MyD88在内皮细胞轻度表达,而在星形细胞并未见明显表达。模型组肝小叶结构明显破坏,数量明显减少,结构紊乱无序,代之以大量异常细胞浸润,纤维增生等特点。内皮细胞、星形细胞等MyD88都有强烈高表达,并且以胞核表达为主,亦见胞浆表达。而基因和蛋白表达都明显升高,与正常对照组相比,呈现显著性差异(P<0.01)。结论 MyD88在肝纤维化中表达显著增强,可能在纤维化形成中起到重要作用。     

肝脏微循环障碍在慢性乙型肝炎中的作用及其发生机制

目的 :探讨肝脏微循环障碍的发生机制及其在慢性乙型肝炎 (慢乙肝 )病情发展中的作用。方法 :40例慢乙肝患者均行肝活检 ,活检组织分别进行HE染色、免疫组化染色及电镜观察。同时常规检查肝脏功能。结果 :40例慢乙肝患者均存在不同程度的肝脏微循环障碍 ,其中 2 3例肝窦内皮细胞胞浆内可见WP小体。 40例中vWF沿肝窦壁呈阳性表达的有 2 5例 ,肝细胞内HBcAg阳性表达 17例。vWF与HBcAg同时表达者肝功能均不正常。 2 8例肝功异常者中有9例肝细胞内无HBcAg表达 ,但vWF为阳性表达。结论 :慢乙肝存在肝脏微循环障碍 ;肝脏微循环障碍可协同乙肝病毒对肝细胞的免疫损伤 ,从而影响肝脏功能 ;肝窦内皮细胞中WP小体的出现可能是导致肝脏微循环障碍的重要环节。