甘草黄酮提取物对小肠上皮细胞IEC-6迁移及多胺的影响

目的 观察甘草黄酮提取物对小肠隐窝上皮细胞IEC-6迁移及迁移过程细胞内多胺量的影响。方法 划痕法制备细胞迁移模型,观察在多胺合成抑制剂二氟甲基鸟氨酸（DFMO）及钾通道抑制剂4-氨基吡啶（4-AP）存在情况下,甘草黄酮提取物对细胞迁移的影响;柱前衍生-高效液相色谱法检测IEC-6细胞在正常及DFMO存在条件下,给予甘草黄酮提取物12、24 h后细胞内多胺（精脒）的量。结果 甘草黄酮提取物可逆转DFMO或4-AP所致IEC-6细胞迁移抑制;其给药12、24 h后可提高细胞内精脒的量,并逆转DFMO对多胺合成的抑制。结论 甘草黄酮提取物促进细胞迁移的作用与影响细胞内多胺调控信号通路有关。     

黄芪多糖调控多胺介导的Ca~(2+)-RhoA通路促进小肠上皮细胞迁移研究

目的考察黄芪多糖对小肠上皮细胞(IEC-6)迁移及迁移过程细胞内多胺水平、细胞质游离钙离子([Ca2+]cyto)的量、细胞骨架蛋白Rho A表达的影响,探讨黄芪修复胃肠黏膜损伤的疗效机制。方法黄芪药材经水提醇沉、Sevage法去蛋白后得到黄芪粗多糖,运用DEAE纤维素柱分离得到黄芪多糖I、II、III、IV,黄芪多糖I以Sephadex LH-20凝胶柱色谱得到黄芪多糖V。Tips划痕法建立IEC-6细胞损伤迁移模型,柱前衍生高效液相色谱法测定多胺的量,流式细胞仪检测[Ca2+]cyto水平,Western blotting法检测Rho A蛋白表达。考察黄芪多糖对正常IEC-6细胞[未加α-二氟甲基鸟氨酸(DFMO)]和多胺耗竭IEC-6细胞(加入DFMO)迁移、多胺水平、[Ca2+]cyto的量及Rho A蛋白表达的影响。结果黄芪粗多糖、黄芪多糖I、黄芪多糖V(50、100、200 mg/L)均能促进IEC-6细胞迁移(P0.01),并且可逆转多胺合成抑制剂DFMO所致的细胞迁移抑制效果(P0.01);在正常(未加DFMO)或多胺耗竭情况(加DFMO),黄芪多糖V均可提高迁移过程细胞内多胺的量(P0.01);黄芪多糖V可提高细胞迁移过程[Ca2+]cyto水平(P0.01),并且可逆转DFMO所致的[Ca2+]cyto水平下降(P0.01);黄芪多糖V(100、200 mg/L)可明显提高Rho A蛋白表达,同时可逆转DFMO所导致的Rho A蛋白表达抑制作用。结论黄芪多糖可加速胃肠黏膜损伤早期修复过程,其机制可能与增加黏膜上皮细胞多胺的量,提升[Ca2+]cyto,从而提高Rho A蛋白表达,进而促进胃肠黏膜上皮细胞迁移有关。     

黄芪和白术提取物对IEC-6细胞迁移的影响

目的 筛选益气健脾中药黄芪和白术促进小肠上皮细胞(IEC-6)迁移的有效提取部位.方法 以系统溶剂分离法从黄芪、白术药材分别得到糖复合物、正丁醇萃取物、醇沉上清液以及大孔树脂吸附后70%乙醇洗脱部位作受试药.IEC-6细胞接种于6孔板并培养24 h,划痕法造细胞迁移模型,划痕后加入各受试药,24 h后观察细胞迁移情况;并进一步观察具有促进细胞迁移的有效部位对二氟甲基鸟氨酸(DFMO)所致细胞迁移抑制的影响.结果 50 mg·L-1的黄芪糖复合物或白术糖复合物能促进细胞迁移(P＜0.01);黄芪、白术的正丁醇萃取物、醇沉上清液、大孔树脂吸附后醇洗脱部位对细胞迁移均无明显影响;2.5 mmol·L-1的DFMO能抑制细胞迁移(P＜0.01),加入DFMO同时加入100 mg·L-1黄芪糖复合物或200 mg·L-1白术糖复合物能使细胞迁移恢复至接近正常水平.结论 黄芪糖复合物和白术糖复合物能促进IEC-6细胞迁移,还能使DFMO所致的细胞迁移抑制恢复至接近正常水平.     

四君子汤多糖对IEC-6细胞迁移、钾通道蛋白及膜电位的影响

目的:观察四君子汤多糖对小肠上皮IEC-6细胞迁移及多胺调控信号通路钾通道蛋白和膜电位的影响,探讨四君子汤修复胃肠黏膜损伤的作用机制。方法:划痕法建立IEC-6细胞迁移模型,观察正常培养及α-二氧甲基乌氨酸(DFMO,多胺合成抑制剂)或4-氨基吡啶(4-AP,钾通道抑制剂)负荷下四君子汤多糖对IEC-6细胞迁移的影响;分别以荧光定量PCR法和Western blot法检测四君子汤多糖对IEC-6细胞钾通道蛋白kv1.1 mRNA和蛋白表达的影响;流式细胞仪检测四君子汤多糖对IEC-6细胞膜电位的影响。结果:与空白对照组比较,四君子汤多糖(40、80、160 mg/L)可促进IEC-6细胞迁移,提高IEC-6细胞kv1.1 mRNA和蛋白表达水平及细胞膜电位超极化水平(P0.05或P0.01);与DFMO模型组比较,四君子汤多糖(40、80、160 mg/L)可逆转DFMO所致细胞迁移数减少、kv1.1 mRNA和蛋白表达的降低以及细胞膜电位去极化(P0.05或P0.01);与4-AP模型组比较,四君子汤多糖(20、40、80 mg/L)可逆转4-AP所致细胞迁移的抑制、kv1.1 mRNA和蛋白表达的降低(P0.05或P0.01)。结论:四君子汤多糖可促进IEC-6细胞迁移,作用机制与影响多胺调控信号通路钾通道蛋白表达和细胞膜电位有关。     

党参黄酮提取部位对小肠上皮细胞迁移及多胺的影响

目的 观察党参黄酮提取部位对小肠上皮细胞（IEC-6）迁移及迁移过程细胞内多胺（精脒）含量的影响。方法 划痕法复制细胞迁移模型,观察在多胺合成抑制剂二氟甲基鸟氨酸（DFMO）及钾通道抑制剂4-氨基吡啶（4-AP）负荷下,党参黄酮提取部位对细胞迁移的影响;柱前衍生-高效液相色谱法检测给予党参黄酮提取部位12 h和24 h后细胞内精脒的含量。结果 党参黄酮提取部位可促进IEC-6细胞迁移,逆转DFMO或4-AP所致细胞迁移抑制;党参黄酮提取部位给药12 h和24 h后可提高细胞内精脒含量。结论 党参黄酮提取部位促进细胞迁移的作用与影响多胺调控信号通路有关。     

白术甲醇提取物对小肠上皮细胞增殖、迁移及磷脂酶C-γ1表达的影响

目的观察白术甲醇提取物(以下简称白术提取物)对小肠上皮细胞(IEC-6)增殖、迁移及磷脂酶C-γ1(PLC-γ1)表达的影响,旨在探讨益气健脾中药白术促进胃肠黏膜损伤修复的作用机制。方法细胞分为空白组,精脒(5μmol/L)组,白术提取物(50、100、200 mg/L)组;负荷实验设α-二氟甲基鸟氨酸[(α-difluoromethylornithine,DFMO)多胺合成抑制剂]组,精脒+DFMO组,白术提取物(50、100、200 mg/L)+DFMO组。细胞贴壁培养24 h,给予受试药培养相应时间后,采用实时细胞分析仪(Real-time Cell Analyzer,RTCA)观察白术提取物对IEC-6细胞增殖的影响;划痕法检测白术提取物对IEC-6细胞迁移数目的影响;采用荧光定量PCR法和Western blot法检测PLC-γ1 m RNA及其蛋白表达。结果与空白组比较,白术提取物对细胞增殖无明显影响(P0.05),精脒和白术提取物(100、200 mg/L)对细胞迁移均有促进作用(P0.01),并能增加细胞迁移过程PLC-γ1 m RNA和蛋白表达(P0.01)。与DFMO组比较,精脒、白术提取物(100、200mg/L)能逆转DFMO所致的细胞迁移抑制及PLC-γ1 m RNA及其蛋白表达的抑制作用(均P0.01)。结论白术提取物可通过促进多胺介导的上皮细胞迁移发挥修复胃肠黏膜损伤作用,细胞增殖不是其主要药效作用。     

白术提取物对IEC-6细胞迁移过程Rho GTPaes及肌球蛋白II表达的影响

目的观察白术提取物对小肠上皮细胞(IEC-6)迁移多胺介导钾通道激活信号通路指标Rho GTPaes(Rho A、Rac1和Cdc42)表达的影响,对肌球蛋白II(myosinⅡ)分布和表达的影响,以探讨益气健脾中药白术对胃肠黏膜损伤修复的作用机制。方法荧光定量PCR法检测Rho A、Rac1和Cdc42 mRNA表达;Western blot法检测Rho A、Rac1和Cdc42蛋白表达;免疫荧光法检测myosinⅡ蛋白分布和表达。结果白术提取物能提高细胞迁移过程Rho A、Rac1、Cdc42 mRNA和蛋白表达,逆转多胺合成抑制剂二氟甲基鸟氨酸(DFMO)所致的Rho A、Rac1、Cdc42 mRNA和蛋白表达抑制;提高细胞迁移过程myosinⅡ表达,从而增加细胞骨架应力纤维形成,改善DFMO所致的myosinⅡ蛋白表达和分布的抑制。结论白术提取物促进IEC-6细胞迁移的作用机制,与其影响多胺介导钾通道激活信号通路有关。     

白术、黄芪糖复合物对IEC-6细胞迁移钾通道影响的研究

目的:上皮细胞迁移是胃肠黏膜损伤修复的重要环节,观察白术、黄芪糖复合物对小肠上皮IEC-6细胞迁移多胺信号通路钾通道相关指标的影响,为探讨益气健脾中药白术、黄芪胃肠黏膜损伤修复机制提供参考。方法:划痕法复制细胞迁移模型;非损伤微测法检测细胞K~+外流;Western Blot法检测Kv1.1蛋白表达;HE染色观察细胞形态;透射电镜观察细胞超微结构。结果:白术、黄芪糖复合物具有以下作用:50μg/ml均可促进细胞迁移;100μg/ml均能增加细胞K+外流;白术(50μg/ml)、黄芪(100μg/ml)糖复合物能提高钾通道蛋白Kv1.1蛋白表达;200μg/ml剂量均能逆转钾通道抑制剂4-氨基比啶(4-AP)所致的细胞迁移抑制;100、200μg/ml剂量均能改善4-AP所致的Kv1.1蛋白表达抑制和细胞空泡化。结论:白术、黄芪促进胃肠黏膜损伤修复的作用与其影响小肠上皮细胞迁移多胺信号通路钾通道相关指标有关。     

白术多糖调控钙离子以促进细胞迁移及E-钙黏蛋白表达的研究

目的观察白术多糖对大鼠小肠上皮细胞(IEC-6)钙离子水平、细胞迁移和E-钙黏蛋白表达的影响,探讨益气健脾中药白术促进胃肠黏膜损伤修复的作用机制。方法:流式细胞仪检测白术多糖对细胞游离钙离子水平([Ca~(2+)]cyt)的影响;划痕法复制细胞迁移模型,观察白术多糖对细胞迁移的影响;Western blot法和免疫荧光法检测白术多糖对细胞E-钙黏蛋白表达的影响。结果白术多糖(25,50,100 mg·L~(-1))可增加细胞[Ca~(2+)]cyt、促进细胞迁移、提高E-钙黏蛋白表达,与正常对照组比较,差异有统计学意义(P0.05,P0.01);可逆转多胺合成抑制剂α-二氟甲基鸟氨酸(DFMO)所致的[Ca~(2+)]cyt降低、细胞迁移抑制和E-钙黏蛋白表达减少,与DFMO组比较,差异有统计学意义(P0.05,P0.01)。结论白术多糖可通过提高细胞钙离子水平以促进细胞迁移和E-钙黏蛋白表达,为探讨益气健脾中药白术修复胃肠黏膜损伤的作用机制提供参考。     

甘草对胃黏膜上皮细胞损伤修复及多胺含量影响的研究

目的观察甘草含药血清对胃黏膜上皮细胞(GES-1)迁移、增殖及细胞内多胺(腐胺、精脒、精胺)含量的影响,探讨甘草促进胃黏膜损伤修复的作用机制。方法枪头(Tips)划痕法建立GES-1细胞损伤迁移模型,NIH Image J软件统计分析细胞迁移率;MTT法检测细胞增殖;柱前衍生高效液相色谱法测定细胞内多胺含量。结果 10%甘草含药血清可加速GES-1细胞迁移(与空白对照血清组比较P0.01);在损伤后24 h或36 h,10%甘草含药血清可促进GES-1细胞增殖(与空白对照血清组比较P0.01);10%甘草含药血清可提高胃黏膜上皮损伤修复过程细胞内腐胺、精脒和精胺含量(与空白对照组血清组比较P0.05,P0.01)。结论益气健脾中药甘草可促进胃黏膜损伤修复,其机制可能与提高细胞内多胺(腐胺、精脒、精胺)含量,促进细胞迁移和增殖有关。     

党参、甘草皂苷和黄酮部位对IEC-6细胞迁移的影响

目的:观察党参、甘草的皂苷和黄酮提取部位对小肠上皮细胞(IEC-6)迁移的影响。方法:以回流提取法分别提取党参和甘草的皂苷、黄酮部位,并用D101大孔吸附树脂对各部位进行分离纯化,以分光光度法检测含量。IEC-6细胞种植于6孔板并培养24小时,划痕法造细胞迁移模型,划痕后加入各种受试药,24小时后观察细胞迁移情况。结果:党参和甘草黄酮含量(以芦丁计)分别为41.73%和50.98%;党参皂苷含量(以人参皂苷Re计)为40.57%;甘草皂苷含量(以甘草酸计)为57.01%。50mg/L的党参黄酮部位和甘草黄酮部位能促进细胞迁移(P<0.05);党参和甘草的皂苷部位对细胞迁移无明显影响。结论:党参、甘草黄酮部位有促进IEC-6细胞迁移作用,党参、甘草皂苷部位对IEC-6细胞迁移无明显影响。     

甘草与白术配伍对IEC-6细胞p53,p21基因表达的影响

通过研究不同剂量甘草与白术配伍对DFMO模型小肠上皮细胞(IEC-6)增殖及p53,p21 mRNA和蛋白表达的影响,探讨甘草与白术配伍对细胞增殖影响的分子基础.采用流式细胞术分别检测药物对IEC-6细胞分裂速度及细胞周期的影响,qRT-PCR检测药物对IEC-6增殖相关基因p53,p21 mRNA的影响,Western blot检测药物对IEC-6细胞p53,p21蛋白表达的影响.白术颗粒可上调DFMO模型IEC-6细胞内p53,p21 mRNA和蛋白的表达水平;而甘草颗粒与白术颗粒不同比例配伍均能显著下调单独白术颗粒作用对DFMO模型IEC-6细胞p53,p21 mRNA和蛋白表达的影响,促进IEC-6细胞的增殖.对于DFMO模型IEC-6细胞,配伍用药甘草能调和白术对小肠上皮细胞的影响.     

Atractylodes macrocephala Koidz promotes intestinal epithelial restitution via the polyamine—Voltage-gated K channel pathway

Ethnopharmacological relevance

Atractylodes macrocephala Koidz (AMK) has been used widely as a digestive and tonic in traditional Chinese medicine. AMK has shown noteworthy promoting effect on intestinal epithelial cell migration, which might represent a promising candidate for the treatment of intestinal mucosa injury. The aim of this study was to investigate the efficacy of AMK on intestinal mucosal restitution and the underlying mechanisms via IEC-6 cell migration model.

Materials and methods

A wounding model of IEC-6 cells was induced by a single-edge razor blade along the diameter of six-well polystyrene plates. The cells were grown in control cultures and in cultures containing spermidine (5 μmol/L, SPD, reference drug), alpha-difluoromethylornithine (2.5 mmol/L, DFMO, polyamine inhibitor), AMK (50, 100, and 200 μg/mL), DFMO plus SPD and DFMO plus AMK for 24 h. The membrane potential (MP) and cytosolic free Ca²⁺ concentration ([Ca²⁺]_cyt) were detected by flow cytometry, and polyamines content was determined via high-performance liquid chromatography (HPLC). The expression of Kv1.1 mRNA and protein levels were assessed by RT-qPCR and Western blot analysis, respectively. Cell migration assay was carried out using the Image-Pro Plus software. All of these indexes were used to evaluate the effectiveness of AMK.

Results

(1) Treatment with AMK caused significant increases in cellular polyamines content, membrane hyperpolarization, an elevation of [Ca²⁺]_cyt and an acceleration of cell migration in IEC-6 cells, as compared to control group. (2) AMK not only reversed the inhibitory effects of DFMO on the polyamines content, MP, and [Ca²⁺]_cyt but also restored IEC-6 cell migration to control levels. (3) The Kv1.1 mRNA and protein expression were significantly increased by AMK treatment in control and polyamine-deficient IEC-6 cells.

Conclusions

The results of our current studies revealed that treatment with AMK significantly stimulates the migration of intestinal epithelial cells through polyamine-Kv1.1 channel signaling pathway, which could promote the healing of intestinal injury. These results suggest the potential usefulness of AMK to cure intestinal disorders characterized by injury and ineffective repair of the intestinal mucosa.     

商品鹿鞭中多胺类组分含量比较

目的:比较不同品种与产地的鹿鞭药材中3种多胺类成分的含量。方法:采用HPLC法分别测定10个鹿鞭样品腐胺、精胺及精脒的含量。结果:不同样品的3种多胺类成份及总多胺含量均有一定差异。结论:多胺类成分含量可作为鹿鞭质量控制指标之一。     

黄芪注射液通过激活鸟氨酸脱羧酶促进IEC-6细胞分化的研究

目的：观察黄芪注射液（Astragalus injection,AI)对小肠隐窝细胞株（IEC－6）增殖、分化、移行及其对细胞内鸟氨酸脱羧酶（ODC）和多胺含量的影响，探讨其粘膜修复的作用机理。方法：IEC－6细胞接种后24h,加入AI。加药后12h收获细胞，分别检测ODC mRNA水平、ODC蛋白、ODC活性及细胞内腐胺含量；24h观察细胞增殖和细胞分化；细胞接种后72h损伤细胞，并加入AI，加药后24h、48h及72h观察细胞移行。结果：AI能明显抑制IEC－6细胞增殖，促进细胞分化，对细胞移行无明显影响。AI62．5－250μg/ml各剂量组可明显增加ODC mRNA水平，与对照组比较差异有显著性（P<0．05－0．01）。AI各剂量组对ODC蛋白均无明显影响。AI随着剂量增加，逐渐升高IEC－6细胞ODC活性和腐胺含量，具有剂量依赖关系。结论：AI通过诱导IEC－6细胞ODC活性和多胺的生物合成促进细胞分化，而对细胞移行无明显作用。     

甘草体外抑制呼吸道合胞病毒作用研究

目的:开发安全有效的抗呼吸道合胞病毒的新药.方法:采用细胞病变抑制实验观察甘草在Hela细胞中对呼吸道合胞病毒的抑制作用.结果:甘草半数中毒浓度(TC50)为3.43g/L;抑制呼吸道合胞病毒的半数有效浓度(EC50)为0.2535g/L,治疗指数(TI)为13.53;甘草对呼吸道合胞病毒的抑制作用存在量效反应关系;在感染后0 h、2 h、4 h、6 h、8 h,甘草均有抑制呼吸道合胞病毒的作用.结论:甘草在Hela细胞中对呼吸道合胞病毒有明显的抑制作用,其作用机制是多途径的.     

三个不同品种甘草多糖的含量测定

[目的]建立甘草多糖含量定量的测定方法,为评估甘草药材的质量提供方法.[方法]甘草样品经95％乙醇除去小极性的杂质后,采用水提醇沉的方法,再通过多步除杂质得精制多糖.采用苯酚-硫酸法测定甘草多糖与葡萄糖的换算因子,并以此测定不同品种甘草药材中多糖的含量.[结果]三个不同品种间甘草生药中甘草多糖的含量为光果＞胀果＞乌拉尔.乌拉尔甘草多糖平均加样回收率为98.23％,RSD为1.63％.[结论]此方法简便可行,甘草多糖供试液在4h内显色稳定,重复性较好,平均加样回收率高,可作为甘草多糖的含量测定方法.     

Antioxidant effect of polyamines on erythrocyte cell membrane lipoperoxidation after free-radical damage

This in vitro study determined the effect of three doses each (100, 500 and 1000 microm) of putrescine, spermidine and spermine on malondialdehyde (MDA) release in red blood cells (RBCs) from healthy individuals after hydrogen peroxide stimulation (10 mM). Twenty-two volunteers, 9 males and 13 females, aged 41.5 +/- 16.4 years, were studied. MDA was measured by thiobarbituric reaction (TBARs) and the results were calculated using epsilon = 1.56 x 10(5). The analysis of variance (ANOVA) demonstrated a statistically significant overall decrease in MDA release in the polyamine-exposed cells (p < 0.0001) when compared with unexposed cells. Individual analysis of each polyamine separately showed a 52% decrease in MDA release with added spermine and a 39.5% decrease with added spermidine (p < 0.001). No evaluable effect was found for putrescine. There was no correlation between the effect produced and the three doses of spermidine or spermine added, indicating a non dose-dependent action.