缬沙坦抑制高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞细胞外基质及CTGF的表达

目的　探讨高糖状态下体外培养的肾小球系膜细胞中结缔组织生长因子（CTGF）的表达以及缬沙坦的影响。方法 体外培养大鼠系膜细胞,分别给予高糖和缬沙坦干预,采用Western blot检测CTGF、p38丝裂原活化蛋白激酶 （p38 MAPK）、cAMP反应元件结合蛋白1（CREB1）及各自磷酸化蛋白的表达,RT-PCR检测CTGF mRNA和纤维黏连蛋白（FN）mRNA的表达。放免法测定细胞上清液中层黏连蛋白(LN)和IV型胶原的含量。结果 与低糖组相比,高糖组系膜细胞CTGF、p-p38 MAPK、p-CREB1表达明显上调,CTGF mRNA和FN mRNA表达增加,细胞上清中LN和IV型胶原含量增加。缬沙坦组CTGF、p-p38 MAPK、p-CREB1的表达明显下调,CTGF mRNA和FN mRNA表达降低, LN和IV型胶原的含量减少。 结论　缬沙坦抑制高糖状态系膜细胞CTGF表达 和细胞外基质的分泌可能部分是通过影响p38 MAPK及其下游核因子CREB1的激活而实现。     

高糖诱导大鼠系膜细胞CTGFmRNA的表达及机制探讨

目的： 观察高糖状态对肾小球系膜细胞中p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）及其下游因子cAMP反应元件结合蛋白1（CREB1）的表达以及对系膜细胞结缔组织生长因子（CTGF）和细胞外基质蛋白表达的影响。方法: 体外培养大鼠肾小球系膜细胞,分别给予高糖和p38 MAPK抑制剂SB203580干预,采用Western印迹检测p38 MAPK和CREB1及其磷酸化蛋白(p-p38 MAPK、p-CREB1)的表达,半定量RT-PCR检测CTGF和纤维黏连蛋白（FN） mRNA的表达。放免法测定细胞上清液中层黏连接蛋白(LN)和IV型胶原的分泌含量。结果: 与低糖组和低糖加甘露醇组相比,高糖组系膜细胞p-p38 MAPK、p-CREB1表达明显上调,CTGF和FN mRNA的表达增加,细胞上清液中FN和IV型胶原含量增加。SB203580能够明显抑制高糖培养系膜细胞p38 MAPK和CREB1的磷酸化,下调CTGF和FN mRNA表达,抑制细胞上清LN和Ⅳ型胶原的分泌。结论: p38 MAPK信号途径可能参与高糖诱导的肾小球系膜细胞CTGF的表达和细胞外基质的分泌。     

整合素-β1在层黏连蛋白促进施万细胞合成细胞外基质过程中的作用

目的 探讨整合素-β1在层黏连蛋白(LN)促进施万细胞(SCs)合成细胞外基质(ECM)过程中的作用.方法 体外培养10只SD大鼠来源的SCs,经外源性LN 处理后,双重免疫荧光细胞化学法检测LN和整合素-β1的表达情况,免疫印迹法检测SCs内黏着斑激酶(FAK)的磷酸化水平.用抗体Ha2/5封闭细胞表面受体整合素-β...     

结缔组织生长因子-siRNA对糖尿病肾病大鼠肾组织中转化生长因子-β1及层黏连蛋白表达的影响

目的:探讨结缔组织生长因子(CTGF) si-RNA对糖尿病大鼠肾组织中转化生长因子β(TGF-β1)及层黏连蛋白表达的抑制作用.方法:取健康雄性Wistar大鼠,随机分为正常对照组、糖尿病模型组、CTGF-siRNA隐性对照组、CTGF-siRNA实验组.腹腔注射1％链脲佐菌素(STZ)建模.特殊转染载体通过尾静脉注射CTGF-siRNA.免疫组织化学观察肾组织中TGF-β1的表达,RT-PCR方法观察肾皮质中TGF-β1、层黏连蛋白mRNA表达的变化.结果:CTGF-siRNA实验组肾组织中TGF-β1的表达减少,同时肾皮质中TGF-β1、层黏连蛋白mRNA表达也减少.CTGF-siRNA注射结束后第4周,尿蛋白明显降低.结论:CTGF-siRNA对糖尿病大鼠肾组织中TGF-β1、层黏连蛋白表达有抑制作用,缓解肾组织的纤维化作用,同时对糖尿病肾功能有明显改善作用.     

细胞外基质成分及其构筑对平滑肌细胞黏着斑激酶表达的影响

目的:探讨细胞外基质纤维连接蛋白(FN)、层黏连蛋白(LN)及三维基膜Matrigel胶对平滑肌细胞黏着斑激酶(FAK)表达的影响。方法:免疫荧光组织化学技术对生长在FN、LN和Matrigel胶里的平滑肌细胞FAK的表达进行检测。结果:生长存FN、LN和Matrigel胶里的平滑肌细胞FAK的表达依次为最高、次之和最低,各组之间有统计学意义;平滑肌细胞FAK磷酸化水平和FAK的表达呈正相关,生长在FN上的平滑肌细胞FAK(py397)的表达水平最高,生长在Matrigel胶里的平滑肌表达最低。结论:细胞外基质成分及其构筑对平滑肌细胞FAK的表达具有重要调节作用。     

甲基强的松龙对免疫复合物型肾炎大鼠细胞外基质的影响

目的：观察甲基强的松龙治疗免疫复合物型肾炎大鼠后肾小球细胞外基质成份的变化及其与PAI-1含量改变的关系及该药的效果。方法：以阳离子化小牛血清白蛋白（C-BSA）诱导的肾炎大鼠模型，以ELISA方法检测不同疗程组的大鼠肾组织中的FN、LN的含量，发色底物法检测肾组织中PAI-1含量变化，并以24小时尿蛋白定量评价甲基强的松龙的治疗作用。结果：模型组大鼠肾组织的FN、LN及PAI-1含量较正常组显著升高，且FN、LN与PAI-1的含量呈正相关关系，肾小球系膜基质轻、中度增生；经甲基强的松龙治疗1周及2周后，治疗组的FN、LN及PAI-1含量较模型组明显下降，肾小球系膜基质增生不同程度减轻，但未达到正常组水平；治疗后大鼠尿蛋白含量显著降低。结论：免疫复合物肾炎大鼠细胞外基质积聚与PAI-1含量升高密切相关，甲基强的松龙可能通过干扰PA／PAI-1系统而影响细胞外基质积聚并达到治疗作用。     

糖基化终产物对大鼠肾系膜细胞结缔组织生长因子作用的研究

目的：探讨糖基化终产物（AGEs）对大鼠肾系膜细胞结缔组织生长因子(CTGF) mRNA表达及细胞外基质（ECM）合成的影响。方法： 在培养的大鼠肾系膜细胞中，分别加入不同浓度的糖化牛血清白蛋白(AGE-BSA)及牛血清白蛋白(BSA)进行刺激，ELISA法检测培养上清中的纤连蛋白（FN）及Ⅳ型胶原（ColⅣ）含量，RT-PCR检测细胞CTGF mRNA表达。结果： 与加入BSA组比较，AGE-BSA组CTGF mRNA表达明显增强（P<0.01），上清中FN及ColⅣ合成增加（P<0.01）， 与CTGF mRNA表达量之间呈正相关（r=0.83）。 结论： AGEs能明显诱导大鼠肾系膜细胞CTGF mRNA的表达，提示AGEs可能通过上调CTGF mRNA的表达引起ECM积聚。     

糖基化终末产物对大鼠肾系膜细胞纤溶酶原激活物抑制物-1表达的影响

目的:观察糖基化终末产物(AGEs)对大鼠肾系膜细胞纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)表达的影响及其与细胞外基质(ECM)成分含量的关系。方法:体外培养正常大鼠肾系膜细胞,分别用糖化牛血清白蛋白(AGEs)及未经糖化的牛血清白蛋白(BSA)处理,以常规培养的肾系膜细胞作为对照,检测不同时间、不同浓度AGEs对纤维连接蛋白(FN)、Ⅳ型胶原、PAI-1表达的影响。MTT法检测AGEs对系膜细胞增殖的作用,ELISA测定条件培养基中FN、Ⅳ型胶原及PAI-1蛋白含量,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测系膜细胞PAI-1mRNA的表达。结果:与相应浓度的BSA比较,AGEs(0-200mg/L)对系膜细胞增殖无明显影响,但可不同程度地刺激系膜细胞FN、Ⅳ型胶原、PAI-1蛋白的产生。RT-PCR检测显示,给予AGEs(100mg/L)的系膜细胞PAI-1mRNA的表达明显增加(P<0.01)。结论:AGEs促进系膜细胞PAI-1的表达,提示AGEs通过上调PAI-1的表达而减少细胞外基质降解,可能是糖尿病肾病细胞外基质积聚的原因之一。     

Snaill在糖尿病大鼠肾组织中表达增加

目的 观察Snaill在糖尿病大鼠肾组织中的表达.并初步探讨其在糖尿病肾病(DN)发生、发展中的作用.方法 大鼠随机分为对照组(C)、糖尿病组(DM)、胰岛素治疗组(A).检测Snaill、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E-钙黏素及纤连蛋白(FN)的蛋白和(或)mRNA表达.结果 Snaill阳性染色见于各组DM大鼠肾小管.从16周开始在DM大鼠肾小管上皮细胞可见α-SMA蛋白阳性表达.肾皮质Snaill与FN蛋白和mRNA的表达水平均显著增加(P＜0.05),而治疗组上述指标显著降低(P＜0.05).E-cadherin蛋白及mRNA表达与Snaill呈负相关.结论 Snaill基因和蛋白在DM大鼠肾小管高表达,并可能通过介导FN生成和抑制E-cadherin转录触发肾小管上皮细胞EMT参与了DN的发生和发展.     

CTGF反义寡核苷酸对高糖培养人肾小球系膜细胞细胞外基质表达的影响

目的: 观察体外转染结缔组织生长因子(CTGF)反义寡核苷酸(ASODN)对高糖培养的人肾小球系膜细胞(HMC)细胞外基质表达的影响.方法: 体外培养HMC, 予以高糖(30 mmol/L)和正常糖(5 mmol/L)培养液培养, 高糖培养后应用脂质体Lipofectamine2000转染CTGF ASODN, 在不同时间收集培养液上清.用ELISA检测培养液上清中的纤连蛋白(FN)和层黏连蛋白(LN)含量.结果: 高糖呈时间依赖促进体外培养的HMC表达 FN和LN, 而转染CTGF ASODN可抑制高糖所致的FN和LN分泌增加.结论: 高糖培养可促进HMC细胞外基质的表达, 转染CTGF ASODN可抑制上述高糖的作用.故调控HMC的CTGF表达水平可能成为防治糖尿病肾病(DN)、特别是早期病变的有效途径之一.     

福辛普利对糖尿病大鼠肾组织中Fractalkine及CD68阳性细胞表达的影响

目的探讨福辛普利对糖尿病大鼠肾组织中CX3C类趋化因子Fractalkine和CD68(巨噬细胞标记物)阳性细胞表达的影响及其肾脏保护作用的机制。方法采用免疫组织化学法及RT-PCR检测肾组织中Fractalkine表达,同时采用免疫组织化学法检测肾组织CD68阳性细胞的分布,并对结果进行半定量分析。结果治疗8周后,免疫组织化学法及RT-PCR检测DM组大鼠肾组织中Fractalkine表达增强(P<0.05),肾小球内CD68阳性细胞显著增多,DF组Fractalkine表达明显减弱(P<0.05),同时肾小球内CD68阳性细胞亦显著减少,相关分析显示肾小球CD68阳性细胞数与Fractalkine mRNA表达呈正相关。结论Fractalkine在糖尿病肾组织中表达明显增强,且与肾小球内CD68阳性细胞表达正相关,说明该趋化因子在糖尿病性肾病炎症反应中起重要作用;治疗组大鼠Fractalkine较模型组明显降低,表明福辛普利对肾脏的保护作用可能与下调fractalkine,抑制糖尿病炎症状态有关。     

锌指转录因子Snail 1在糖尿病大鼠肾组织中的表达

目的： 观察锌指转录因子Snail 1在糖尿病大鼠肾组织中的表达并探讨其与糖尿病肾病（DN）发生、发展的关系。方法: 链脲佐菌素（STZ）诱发大鼠糖尿病（DM），分为2、4、8、12、16、20、24周以及16周A、20周A和24周A组，其中A组动物从第13周起用胰岛素控制血糖至正常水平，每个时点均设鼠龄匹配的正常对照组。测定各组血糖、24 h尿蛋白、血肌酐（Scr）、肾脏指数。PAS染色光镜观察肾脏病理改变。免疫组化、RT-PCR方法检测肾皮质Snail 1和纤连蛋白（FN）的蛋白及mRNA水平，Western blotting检测Snail 1蛋白表达。结果: DM各组大鼠的血糖、24 h尿蛋白、血肌酐、肾脏指数明显高于正常对照组（P<0.05,P<0.01），A组上述指标均明显低于DM组（P<0.05,P<0.01）。Snail 1免疫组化阳性染色见于各组DM大鼠肾小管，正常对照组未见阳性表达，A组见弱阳性表达，并随治疗时间延长而减少。DM组肾皮质Snail 1、FN蛋白和mRNA的表达水平高于正常对照组（P<0.01），而A组显著低于DM组（P<0.01）。Snail 1与FN mRNA的表达水平呈显著正相关（P<0.01），Snail 1蛋白表达水平与血糖、尿蛋白、血肌酐、肾脏指数亦呈正相关（ P<0.01）。结论: Snail 1基因和蛋白在DM大鼠肾组织过度表达，提示Snail 1可能参与了DN的发生、发展机制。     

Computer imaging analysis of glomerular extracellular components in patients with IgA nephropathy

Computer imaging analysis was used for quantitative evaluation of the extents, amounts and distributions of glomerular extracellular components, such as the 7S and NC-1 domains of type IV collagen, laminin (LN), fibronectin (FN) and IgA, in glomeruli from patients with IgA nephropathy. Renal biopsy specimens from 13 patients with IgA nephropathy were incubated with mouse monoclonal antibodies against the FN or non-collagenous (NC-1) domain of type IV collagen or polyclonal antiserum against the LN or 7S domain of human type IV collagen, and then stained with appropriate dilutions of FITC-labeled anti-mouse Ig antisera. Marked staining of the 7S or NC-1 domain of type IV collagen, LN or FN was detected in the glomerular capillary walls and/or mesangial areas in patients with IgA nephropathy. In particular, a prominent increase of FN was observed in the subendothelial regions of glomerular capillary walls, i.e. mesangial interposition, in the moderate or advanced stage of IgA nephropathy. Therefore, computer imaging analysis was shown to be useful for the quantitative determination of such components distributed in glomeruli from patients with IgA nephropathy.     

Computer Imaging Analysis of Glomerular Extracellular Components in Patients with IgA Nephropathy

Computer imaging analysis was used for quantitative evaluation of the extents, amounts and distributions of glomerular extracellular components, such as the 7S and NC 1 domains of type IV collagen, laminin (LN), fibronectin (FN) and IgA, in glomeruli from patients with IgA nephropathy. Renal biopsy specimens from 13 patients with IgA nephropathy were incubated with mouse monoclonal antibodies against the FN or non collagenous (NC 1) domain of type IV collagen or polyclonal antiserum against the LN or 7S domain of human type IV collagen, and then stained with appropriate dilutions of FITC labeled anti mouse Ig antisera. Marked staining of the 7S or NC 1 domain of type IV collagen, LN or FN was detected in the glomerular capillary walls and/or mesangial areas in patients with IgA nephropathy. In particular, a prominent increase of FN was observed in the subendothelial regions of glomerular capillary walls, i.e. mesangial interposition, in the moderate or advanced stage of IgA nephropathy. Therefore, computer imaging analysis was shown to be useful for the quantitative determination of such components distributed in glomeruli from patients with IgA nephropathy. Acta Pathol Jpn 39: 296 305, 1989.     

血浆型凝溶胶蛋白和纤连蛋白在糖尿病肾病肾组织的表达及其临床病理资料分析

目的 对血浆型凝溶胶蛋白(pGSN)和纤连蛋白(FN)在糖尿病肾病(DN)患者肾组织的表达及其临床病理学资料进行分析.方法 根据临床诊断,将肾活检诊断为DN的67例患者分为4组:DN或糖尿病(DM)组、DM或DN合并高血压组、DM或DN合并其他肾脏病组和单纯诊断为其他肾脏疾病组,而后者又可分为血糖正常和血糖升高两种.利用免疫组织化学方法检测pGSN和FN在上述组织的石蜡切片的表达情况,与临床资料结合进行统计学分析.结果 pGSN和FN主要表达在肾小球和肾小管中,尤其在纤维化的肾小球和肾小管表达最为明显,两者均与肾小球的硬化率(硬化肾小球/总肾小球数)相关,而与其他的临床指标没有明显相关性.在四组临床诊断分组中,临床DM症状不典型伴有肾脏改变且血糖升高组,其肾小球滤过率(eGFR)明显降低(P＜0.05).而血糖正常组,其凝血酶原时间(PT)、血糖、丙氨酸转氨酶(ALT)、二氧化碳结合力及糖化血红蛋白相较于其他组有统计学意义(P＜0.05).而DM或DN伴有高血压组的患者其凝血项检查中的凝血酶原时间活动度(PT％)、凝血酶原时间国际标准化比值(PTINR)、凝血酶时间(TT)的差异有统计学意义(P＜0.05),ATL、天冬氨酸氨基转移酶(AST)明显降低(P＜0.05).结论 pGSN和FN反映肾小球的纤维化程度.临床上不能明确诊断为DN的病人,肾活检确诊时其肾功能的损害更严重.伴有高血压的DN患者,其凝血系统及肝功发生明显变化.     

Unbalanced expression of sphingosine 1-phosphate receptors in diabetic nephropathy

Sphingosine 1-phosphate (Sph-1-P) regulates vascular homeostasis through its receptors like S1P1 and S1P2. While S1P1 works to protect vasculature, S1P2 works antagonistically against it. Therefore, the balance of S1P1 and S1P2 determines the regulation of vascular permeability. In diabetic nephropathy, one of the typical pathological changes is endothelial injury possibly as a result of changes in vascular permeability. Therefore, we hypothesized that the balance of S1P1 and S1P2 expression becomes inappropriate in glomeruli of diabetic nephropathy. To verify the hypothesis, five SD rats with diabetes induced by streptozotocin injection and six control rats injected with only the vehicle were analyzed one year after injection. The glomeruli of the diabetic rats exhibited endothelial injuries. The analysis by real-time PCR revealed that the ratio of S1P2/S1P1 mRNA in the renal cortex of the diabetic rats was significantly higher than that in the non-diabetic control group. Immunohistochemistry revealed that S1P1 was expressed by endothelial and mesangial cells, while S1P2 was mainly expressed by mesangial cells in glomeruli. Furthermore, the ratio of the staining intensity of S1P2 to that of S1P1 in the glomeruli was significantly higher in the diabetic rats. The number of cells expressing PDGF-B, which enhances S1P2 expression, was also higher in the glomeruli of the diabetic rats than in the controls. In conclusion, Sph-1-P signals are preferentially transmitted through S1P2, rather than S1P1, in the glomeruli of rats with diabetic nephropathy. Such unbalanced delivery of the Sph-1-P signals might be involved in the pathogenesis of endothelial injuries.     

黏着斑激酶在2型糖尿病大鼠肾组织中的表达变化及意义

 目的：观察黏着斑激酶（FAK）在2型糖尿病（T2DM）大鼠肾组织中的动态变化,探讨其在糖尿病肾病（DN）发病机制中的作用。方法：复制T2DM模型,随机分为糖尿病8、12和16周(DM8、DM12和DM16)组,另设正常对照(NC)组和高脂高糖对照(HC)组。免疫组织化学检测肾组织中FAK、转化生长因子β1(TGF-β1)、细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)、p-ERK1/2和纤维连接蛋白(FN)的表达;Western blotting检测FAK和p-FAK(Tyr397)蛋白水平;RT-PCR法检测肾皮质FAK mRNA的水平。结果：DM各组TGF-β1、p-ERK1/2和FN蛋白表达显著高于NC组及HC组(P<0.05);DM12和DM16组肾皮质FAK和p-FAK (Tyr397)表达均较NC组、HC组及DM8组显著增多(P< 0.05),且p-FAK(Tyr397)与总FAK蛋白表达趋势一致;FAK与TGF-β1、p-ERK1/2、FN呈显著正相关（P<0.01）。DM12和DM16组FAK mRNA比NC组、HC组及DM8周组表达明显增加(P< 0.05)。结论: 在2型糖尿病中,FAK可能作为TGF-β1的下游分子被活化,并通过活化ERK1/2使FN表达增多,从而参与了糖尿病肾病的发生发展。     

Advanced glycation end-products induce connective tissue growth factor-mediated renal fibrosis predominantly through transforming growth factor beta-independent pathway

Advanced glycation end-products (AGEs) play a critical role in diabetic nephropathy by stimulating extracellular matrix (ECM) synthesis. Connective tissue growth factor (CTGF) is a potent inducer of ECM synthesis and increases in the diabetic kidneys. To determine the critical role of CTGF in AGE-induced ECM accumulation leading to diabetic nephropathy, rats were given AGEs by intravenous injection for 6 weeks. AGE treatment induced a significant renal ECM accumulation, as shown by increases in periodic acid-Schiff-positive materials, fibronectin, and type IV collagen (Col IV) accumulation in glomeruli, and a mild renal dysfunction, as shown by increases in urinary volume and protein content. AGE treatment also caused significant increases in renal CTGF and transforming growth factor (TGF)-beta 1 mRNA and protein expression. Direct exposure of rat mesangial cells to AGEs in vitro significantly induced increases in fibronectin and Col IV production, which could be completely prevented by pretreatment with anti-CTGF antibody. AGE treatment also significantly increased both TGF-beta 1 and CTGF mRNA expression; however, inhibition of TGF-beta 1 mRNA expression by shRNA or neutralization of TGF-beta 1 protein by anti-TGF-beta 1 antibody did not significantly prevent AGE-increased expression of CTGF mRNA and protein. These results suggest that AGE-induced CTGF expression, predominantly through a TGF-beta 1-independent pathway, plays a critical role in renal ECM accumulation leading to diabetic nephropathy.     

ACE2内源性激动剂DIZE对糖尿病肾病大鼠的保护作用

目的:观察血管紧张素转换酶2(ACE2)内源性激动剂乙酰甘氨酸重氮氨苯脒(DIZE)对糖尿病肾病(DN)大鼠的保护作用。方法:30只Wistar大鼠随机分为正常对照组(NC组)、DN组和DIZE处理组(DIZE组)。DN组与DIZE组一次性腹腔注射链脲佐菌素(65 mg/kg)建立糖尿病模型,12周后糖尿病肾病大鼠模型建立后给予DIZE 15 mg·kg~(-1)·d~(-1)或等量生理盐水皮下注射4周处理。16周末称量体重和肾重,计算肾质量体质量比(KW/BW),收集血、尿标本,检测血糖(GLU)、24 h尿蛋白(24UP)及血清肌酐(SCr)等指标。通过PAS染色观察各组肾脏病理变化;ELISA法检测大鼠AngⅡ、Ang-(1-7)、TGF-β1及VCAM-1水平的变化;通过免疫组化观察collagenⅠ和FN蛋白表达的变化;利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测大鼠肾组织collagenⅠ和FN mRNA含量的变化;Western blot观察各组大鼠ACE2蛋白表达的变化。结果:DIZE显著提高了糖尿病大鼠ACE2的表达(P0.05),降低了糖尿病大鼠血浆AngⅡ含量(P0.05),提高了Ang-(1-7)的水平(P0.05)。与NC组大鼠相比,DN组与DIZE组大鼠的24UP、SCr和KW/BW明显升高(P0.05),collagenⅠ和FN mRNA水平及蛋白表达量增加,肾脏组织TGF-β1及VCAM-1明显上升(P0.05)。DIZE组与DN组大鼠相比,24UP和SCr水平降低(P0.05),GLU和KW/BW无明显差异,collagenⅠ和FN mRNA含量及蛋白表达量减少,肾脏组织TGF-β1及VCAM-1水平降低(P0.05)。结论:ACE2内源性激动剂DIZE显著提高了ACE2的活性,增加了Ang-(1-7)的含量,从而降低了肾脏纤维化及炎症水平,并对糖尿病肾病大鼠起到保护性作用。