pPICZα-synBPI_(m600)酵母表达载体的构建和鉴定

为使rBPIm2 3 重组抗菌蛋白在毕赤酵母表达系统中分泌表达 ,拟构建synBPIm60 0 酵母表达载体。以pUC18 synBPI41 4 质粒为模板扩增synBPI2 0 0 基因片段 ,经XhoI/EcoRI双酶切获得synBPI1 85bp基因片段 ;EcoRI/SalI双酶切PBV2 2 0 BPIm60 0 质粒获得BPIm42 0 基因片段 ;将上述 2个基因片段连接后定向克隆到pPICZα酵母表达载体上。连接产物转化E .coliTOP 10F′ ,在含Zeocin的低盐LB固体培养基上筛选阳性转化子。阳性克隆菌经菌落PCR法鉴定、酶切分析和测序鉴定 ,结果与预期相符。提示 :成功构建了pPICZα synBPIm60 0 酵母表达载体     

酵母双杂合体系研究丙型肝炎病毒进入肝细胞的受体

目的 :用酵母双杂合体系筛选肝细胞cDNA文库 ,寻找与丙型肝炎 (丙肝 )病毒 (hepatitisCvirus ,HCV)胞膜蛋白 2 (E2 )相作用蛋白的基因 ,探讨HCV与肝细胞的相互作用 ,寻找HCV进入细胞的受体。方法 :以HCVE2蛋白胞外区片段 ,构建酵母双杂合体系中“饵”载体 ,从成人肝细胞cDNA文库筛选与HCVE2相作用蛋白的基因。结果 :筛出的阳性克隆基因序列分析后 ,经GenBank查询 ,与人的apoCⅢ同源 ,同源性为 98%。 结论 :HCVE2蛋白能与人的apoCⅢ在酵母双杂合体系中结合 ,但其相互作用与HCV进入细胞间的关系待进一步研究     

DNA修复蛋白Ku70酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活检测

目的构建Ku70蛋白酵母双杂交诱饵载体,为研究Ku70及其相互作用蛋白在乳腺癌中的作用机制奠定基础。方法采用反转录聚合酶链反应（RT—PCR）法从人宫颈癌HeLa细胞株扩增出Ku70cDNA全长片段,用SalI和EcoRI双酶切Ku70cDNA片段后定向克隆到真核细胞表达载体pGBKT7,获得诱饵质粒pGBKT7-Ku70,经限制性内切酶酶切和测序鉴定后转化到酵母菌株AHl09,在营养缺陷培养基中观察pGBKT7-KuT0的自激活作用,同时利用蛋白质免疫印迹检测诱饵蛋白Ku70的表达。结果Ku70cDNA正确克隆到载体pGBKT,转化到酵母菌株AHl09中的诱饵载体pGBKT7-KuT0经表型筛选证实无自激活作用,蛋白质免疫印迹检测显示pGBKT7-KuT0在酵母细胞中稳定表达诱饵蛋白Ku70。结论成功构建了Ku70蛋白酵母双杂交诱饵载体,并且在酵母菌株AHl09中稳定表达。     

pPICZα-synBPIm600酵母表达载体的构建和鉴定

为使rBPI_m23重组抗菌蛋白在毕赤酵母表达系统中分泌表达,拟构建synBPI_m600酵母表达载体。以pUC18synBPI₄₁₄质粒为模板扩增synBPI₂₀₀基因片段,经XhoI/EcoRI双酶切获得synBPI_185bp基因片段;EcoRI/SalI双酶切PBV220BPI_m600质粒获得BPI_m420基因片段;将上述2个基因片段连接后定向克隆到pPICZα酵母表达载体上。连接产物转化E.coliTOP10F′,在含Zeocin的低盐LB固体培养基上筛选阳性转化子。阳性克隆菌经菌落PCR法鉴定、酶切分析和测序鉴定,结果与预期相符。提示:成功构建了pPICZαsynBPI_m600酵母表达载体.     

整合素β3亚基不同片段在酵母双杂交系统中的表达及对报告基因激活作用的检测

目的:为建立用于筛选人血小板整合素蛋白αⅡbβ3拮抗剂的高通量药物筛选模型,对其β3亚基不同片段在酵母双杂交系统中的表达及对报告基因的激活作用进行初步研究.方法:通过PCR扩增得到6个不同长度的整合素β3亚基基因片段,包括片段A1(55E-199Q)、A2(235K-385S)、A3(4I-454T)、A4(4I-77S)、A5(4I-147S)和A6(4I-284S),分别克隆到酵母双杂交诱饵载体pAS2-1中,然后将重组质粒导入酵母双杂交菌株Y190中,检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因的激活作用.结果:6个片段对酵母均无毒性作用,片段A1、A2、A3、A5、A6不能激活报告基因HIS3和LacZ的表达,而片段A4和一个A3的缺失突变体可以激活报告基因的表达,β3亚基N末端存在一个转录激活区.结论:在建立模型时可以使用A1、A2、A3片段,但转录激活是否是β3亚基的生理功能仍有待进一步研究确证.     

Bit1基因在酵母双杂交系统中的表达及对报告基因激活作用的检测

目的:用Bit1基因片段构建酵母双杂交诱饵载体,并检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用. 方法:运用RT-PCR技术从卵巢癌细胞系Caov-3中扩增出Bit1基因片段,克隆入pUC19质粒,经测序正确后,再克隆入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中,将重组质粒导入酵母菌AH109,检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因有无激活作用. 结果:成功获得Bit1基因片段,Bit1基因表达的蛋白对酵母菌AH109无毒性,对报告基因亦无激活作用. 结论:可以利用酵母双杂交Gal4系统来研究与Bit1相互作用的蛋白.     

日本脑炎病毒核心蛋白酵母双杂交诱饵载体构建及鉴定

目的构建日本脑炎病毒核心蛋白（JEV C蛋白）基因的酵母双杂交诱饵载体,并检测其蛋白表达产物对酵母细胞的毒性及对酵母细胞内报告基因的自激活效应。方法 PCR扩增JEV C蛋白cDNA全基序并克隆入载体pGBKT7的EcoRI/BamHI酶切位点之间,酶切及测序鉴定;PEG/LiAc法将构建好的诱饵质粒pGBKT7-JC及载体pGBKT7分别转化入酵母菌株Y2H Gold感受态细胞,经酵母氨基酸缺陷培养及表型筛选检测其对酵母细胞毒性及自激活作用;用Western-blotting法分析酵母菌中诱饵蛋白BD-JC的表达。结果重组质粒pGBKT7-JC经酶切鉴定及测序结果与Genebank公布的JEV SA14-14-2株中JEV C蛋白编码基序完全一致;成功转化质粒pGBKT7-JC及空载体pGBKT7的酵母菌株Y2H Gold感受态细胞均只在SD/-Trp、SD/-Trp/X培养基上生长,二者菌落数、菌落大小、分布无明显差异且不变蓝,且SD/-Trp液体培养基30℃过夜培养测OD600值均〉0.8,在SD/-Trp/X/A培养基上均不生长;经Western-blotting法检测到酵母菌能表达分子量约为35KDa的特异性融合蛋白BD-JC。结论成功构建了酵母双杂交诱饵表达质粒pGBKT7-JC;其诱饵蛋白BD-JC对酵母细胞无细胞毒性及自激活效应,为筛选及验证与pGBKT7-JC相互作用蛋白奠定实验基础。     

人4—1BB—hIgG1Fc融合蛋白真核表达载体的构建

目的：构建人4－1BB胞膜外区-hIgG1Fc融合蛋白真核表达载体。方法：PCR扩增人4－1BB胞膜外区和hIgG1Fc基因片段，用HindⅢ、PstI酶切4－1BB胞膜外区，PstI、EcoR I酶切hIgG1Fc,HindⅢ、EcoRI酶切pCDNA3，纯化后的酶切产物经T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，氨苄青霉素筛选阳性克隆，PCR及测序鉴定。结果：连接反应产物转化大肠杆菌DH5α，氨苄青霉素筛选出多个阳性克隆；分别以针对4－1BB胞膜外区和hIg1Fc的引物进行PCR扩增，电泳后观察到一558bp、708bp的特异性条带，与4－1BB胞膜外区和hIgG1Fc相符，提示构建成功。进一步测序分析证明克隆在pCDNA3质粒中的4－1BB和hIgG1Fc序列和读码框架正确，无基因突变。结论：成功构建人4－1BB胞膜外区－hIgG1Fc融合蛋白真核表达载体，为表达4－1BB融合蛋白奠定基础。     

Peroxiredoxin Ⅱ酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活效应检测

目的:应用酵母双杂交体系,构建人peroxiredoxinⅡ(PrxⅡ)蛋白酵母双杂交诱饵载体,并检测该载体的表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用。方法:用PCR扩增PrxⅡ基因cDNA中编码完整开放阅读框的基因片段;将该基因片段与pGBKT7载体定向重组;用酶切和测序鉴定重组质粒;用醋酸锂法(Li-Ac)将序列正确的重组质粒pGBKT7-PrxⅡ转化入AH109酵母菌株,在缺陷性培养基上观察pGBKT7-PrxⅡ在AH109中的表达情况,检测诱饵载体有无毒性作用和单倍体及二倍体自激活功能。结果:成功构建pGBKT7-PrxⅡ重组质粒。转化有重组质粒和pGBKT7空载体的酵母菌都能在SD/-Trp/X--αgal平板上长出粉红色菌落,在SD/-His/-Trp/X--αgal,SD/-Ade/-Trp/X--αgal平板上不能生长,两种酵母菌在SD/-Trp液体培养基中培养16 h后,菌液的OD600均值均为0.9,说明AH109[pGBKT7-PrxⅡ]转化成功,对酵母菌株AH109无毒性且不具自主激活报告基因的功能。结论:成功获得了在酵母细胞中正确表达,并对酵母细胞无毒性且未自主激活报告基因的诱饵表达载体pGBKT7-PrxⅡ,该载体可作为酵母双杂交系统中的“诱饵”,该诱饵载体可应用于酵母双杂交系统3筛选PrxⅡ相互作用蛋白。     

杜氏盐藻S腺苷高半胱氨酸水解酶酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活和毒性检测

目的:构建杜氏盐藻S腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-SAHH,并检测其对酵母细胞的毒性和自激活作用。方法:应用RT-PCR扩增杜氏盐藻的SAHHcDNA,测序分析后与酵母双杂交诱饵载体pGBKT7连接,构建诱饵载体pGBKT7-SAHH。用PEG/LiAc法将诱饵载体转入AH109和Y187酵母中,通过表型筛选检测诱饵蛋白对酵母有无毒性和自激活作用。结果:成功构建了诱饵载体pGBKT7-SAHH并成功转化到酵母细胞AH109和Y187中,表达的融合蛋白对宿主酵母细胞无毒性。在AH109和Y187酵母细胞中诱饵载体均未激活报告基因HIS3和ADE2,但是激活了报告基因MEL1。结论:诱饵载体pGBKT7-SAHH可用酵母双杂交方法筛选与SAHH相互作用的蛋白。     

热休克蛋白和胰腺癌的研究进展

热休克蛋白(HSPs)是一组高度保守的蛋白,可组成性或诱导性表达于所有细胞和生物体中。它们具有很大的细胞内功能并通常被认为在不同的应激中发挥着保护因子的作用。近年来,在各种疾病包括肿瘤中都已检测到HSPs的异常表达。探讨其在胰腺癌发病机制及治疗中的作用已成为学者们研究的焦点。现就HSPs和胰腺癌的关系进行综述。     

CV-1细胞中固醇调节元件结合蛋白-1c对Ⅰ型葡萄糖载体mRNA稳定性及蛋白表达的影响

[目的]探讨在CV-1细胞中固醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP-1c)对Ⅰ型葡萄糖载体mRNA稳定性和蛋白表达的影响.[方法]利用DNA克隆技术,将SREBP-1c和其阴性表达体(ADDN)DNA序列重组到表达载体pSV-sport上.用SREBP-1c转染CV-1细胞,应用Northern Blot方法观察SREBP-1c对Ⅰ型葡萄糖载体mRNA的表达及其稳定性的影响,应用Western Blot方法观察SREBP-1c对Ⅰ型葡萄糖载体蛋白表达的影响.[结果]SREBP-1c可增加Ⅰ型葡萄糖载体的mRNA表达水平及稳定性,可提高Ⅰ型葡萄糖载体的蛋白表达水平.[结论]SREBP-1c可增强Ⅰ型葡萄糖载体的蛋白表达,可能通过调节Ⅰ型葡萄糖载体的表达水平而参与胰岛素对血糖的调节过程.     

食管癌中癌基因产物c-fos,c-jun的表达及意义

目的探讨癌基因c-fos、c-jun表达产物与食管癌的发生、发展及预后的关系。方法用免疫组化SABC法,以兔抗c-fos、c-jun抗体标记90例食管癌和30例食管上皮不典型增生。观察其分化程度和组织学类型,食管癌的表达及阳性率比较。结果c-fos、c-jun阳性反应见于不典型增生上皮和食管癌组织,不典型增生上皮c-fos、c-jun阳性率分别为70.0%和50.0%,癌组织为58.8%和48.9%;食管癌表达的阳性率与癌组织分化程度和组织学类型有关（P〈0.05）。结论提示c-fos、c-jun过量表达可发生在不典型增生的食管上皮和食管癌组织。     

电极法测定血清蛋白质

本文介绍了用氨气敏电极,以样品加入法测定血清中的蛋白质,并对方法误差进行了考察。本法与凯氏定氮法的测定结果无明显差异(P>0.05),重现性良好(C.V.0.52%),平均回收率为99.49%,方法简便、快速。     

Smad蛋白在BMP-2诱导成骨分化过程中的作用

目的研究Smad蛋白在骨形态发生蛋白-2（BMP-2）诱导成骨分化过程中作用,探讨Smad蛋白在成骨分化期间信号传导的机制。方法将取自MDX大鼠颅盖骨组织分离获得成骨细胞进行培养,培养的成骨细胞分组,加入不同浓度的BMP-2或BMP-2与Trx2SARA混合物后,用反义PCR和Western Blot斑点杂交对各组诱导成骨分化的情况进行分析。体内实验中肌肉局部埋植BMP-2或BMP-2和Trx2SARA,取不同时间点处死动物,制备组织切片,用SO染色进行组织学观察。结果BMP-2处理的成骨细胞碱性磷酸酶增加,降钙素mRNA增加,Smad蛋白的表达水平呈剂量依赖性增加。Trx2SARA处理组出现碱性磷酸酶和降钙素mRNA下调。体内实验组织切片SO染色显示,BMP-2处理组大部分异位组织由增殖中、肥厚前和肥厚软骨细胞构成,而Trx2SARA处理组很少向软骨源细胞分化。结论Smad蛋白在BMP-2诱导成骨分化中发挥重要的信号传导作用。     

Tumstatin-EGFP在CHO细胞中的表达和活性分析

目的分析融合蛋白tumstatin-EGFP在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中的表达及生物学活性。方法经过酶切和测序正确的真核表达载体PIRESneo3/STL-EGFP、PIRES-neo3/sig-EGFP和空载体稳定转染CHO细胞后,用Western blot从细胞上清液中检测融合蛋白的表达、倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达。通过生长曲线分析外源基因的导入对CHO细胞生长的影响,MTT法和管状形成抑制试验评估tumstatin-EGFP融合蛋白的tumstatin样活性,体外靶向试验验证tumstatin能否携带融合蛋白特异性结合内皮细胞。结果获得了稳定转染的CHO细胞系。生长曲线表明转染后的较未转染的CHO细胞生长缓慢,MTT试验和管状形成抑制试验分别证实了融合蛋白tumstatin-EGFP具有抑制内皮细胞增殖,明显抑制血管管状结构的形成的作用;体外靶向试验也验证了tumstatin-EGFP能够特异性结合内皮细胞。结论重组真核表达载体在CHO细胞获得稳定表达,融合蛋白tumstatin-EGFP的表达不影响tumstatin和EGFP各自的生物学活性,并且在体外tumstatin能特异性携带EGFP靶向内皮细胞,为进一步tumstatin及其融合蛋白的研究奠定基础。     

SKP2和P27Kipl蛋白在直肠癌中的表达与临床病理特征的相关性研究

目的探讨细胞S期激酶相关蛋白(SKP2)和P27K ip l蛋白在直肠癌中的表达及与直肠癌各项临床病理特征的关系,并探讨两者的相关性。方法用免疫组化EnvisionTM法检测62例直肠癌中SKP2和P27K ip l蛋白的表达。结果62例直肠癌组织中P27K ip l、SKP2蛋白的表达率分别为46.77%、33.87%。随肿瘤分化程度降低、浸润深度加深、淋巴结转移和临床分期提高,P27K ip l蛋白表达率逐渐降低(P<0.05);SKP2的表达率随肿瘤分化降低和浸润深度加深而逐渐升高。两者的阳性表达率均与患者的年龄、性别、肿瘤大小无关(P>0.05)。P27K ip l与SKP2表达呈显著负相关(P<0.01)。结论P27K ip l、SKP2的异常表达可加速细胞周期转化,促进直肠癌的发生。对两种蛋白的检测有助于直肠癌恶性程度和预后的判断。     

新生霉素衍生物FM-NOV17抑制Her2+乳腺癌细胞的作用及其机制

目的研究新生霉素衍生物FM-NOV17对乳腺癌Skbr3细胞的作用,并探讨该作用是否与其干扰热休克蛋白90(Hsp90)分子伴侣的功能从而促进Her2降解有关。方法用蛋白免疫印迹法检测Her2的含量,采用免疫共沉淀的方法研究FM-NOV17对乳腺癌细胞Hsp90分子伴侣功能的影响。用免疫共沉淀的方法将Her2与其分子伴侣复合物沉淀下来,用免疫印迹法检测沉淀物中与Her2结合的Hsp90和辅伴侣Hsp70含量的变化。结果 FM-NOV17能降低乳腺癌细胞Skbr3中Her2的蛋白水平,FM-NOV17使Her2与Hsp90和Hsp70的结合减少,降低Her2蛋白水平,诱导细胞周期阻滞和凋亡。结论 FM-NOV17通过干扰Hsp90伴侣功能,减少Her2与Hsp90和辅伴侣的结合,降低Her2蛋白量,最终抑制乳腺癌细胞增殖。     

风疹病毒E1膜抗原的原核表达与纯化鉴定

①目的 重组表达风疹病毒（RV）E1膜蛋白的抗原决定簇多肽，探索制备用于RV血清学检测的基因工程抗原。②方法 通过反转录聚合酶链反应（RT-PCR）扩增RV E1膜蛋白212-241位氨基酸的编码基在片段nt8886-8976,将此片重组于质粒载体pGEX4T-2上，在大肠杆菌中表达目的多肽片与谷胱甘肽巯基转移酶（GST）的融合蛋白，纯化融合蛋白并经Western-Blot鉴定其抗原性。③结果 有效的表达出相对分子质量约为33000的融合蛋白，经Western-Blot检测结果证实可与RV的单克隆抗体发生特异性结合反应。④结论 在原核表达系统中有效地表达了保留风疹病毒抗原性的融合蛋白，为今后进一步研制RV重组抗原提供了方法学和实验室基础。     

融合蛋白HSP70-EGFP的表达、纯化及其在树突状细胞内化抗原中的应用

目的:研究树突状细胞(DCs)对热休克蛋白70(HSP70)融合蛋白的内化作用.方法:首先原核表达并分离纯化HSP70和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的融合蛋白HSP70-EGFP.实验中所用DCs来源于人外周血.内化实验分3组进行:将1,2组DCs分别与融合蛋白HSP70-EGFP和蛋白EGFP孵育30 min;第3组先将DCs与HSP70孵育30 min,再与HSP70-EGFP孵育30 min.之后将3组DCs转至37 ℃孵箱内,培养0.5,1,2和24 h,应用流式细胞仪检测含HSP70-EG-FP或EGFP的DCs数量.应用IL-12 Eli-spot法检测HSP70-EGFP等抗原促进DCs分泌IL-12的效果.结果:①成功获得了重组蛋白HSP70-EGFP,Mr约为97 000,HSP70-EGFP表达量占总蛋白的35.7%.纯化后的融合蛋白HSP70-EGFP溶液经紫外线灯照射时发出鲜绿色的荧光.②流式细胞仪检测结果显示在37 ℃孵育0.5 h后,HSP70-EGFP孵育的DCs组阳性率为63.3%,其余两组为阴性.在37 ℃孵育1,2和24 h后,3组阳性率均大于80.0%.IL-12 Eli-spot检测结果显示,在刺激DCs活化及分泌IL-12的水平上,HSP70-EGFP与脂多糖(LPS)之间的差别无统计学意义(P＞0.05),而HSP70-EG-FP的活化DCs能力明显高于EGFP(P=0.001).结论:①受体介导的吞噬作用在DCs内化HSP70-EGFP的初始阶段起主要作用,随孵育时间的延续,吞饮作用占主要地位.②HSP70-EGFP可促进DCs分泌特征性细胞因子IL-12.