KIAA基因家族的研究进展

人类基因组计划实施和完成过程中,不断地发现KIAA基因,这是一类新识别的大片段cDNA,可编码巨大蛋白质,而对巨大蛋白质的功能研究已经成为后基因组计划的一大主题.该文就KIAA基因家族数据库的建立、序列特征、功能分类、研究新进展作一综述.     

KIAA1199基因的研究进展

随着人类基因组学进入了后基因组计划,研究人类基因组所蕴藏的遗传信息,探索其具有的功能成为重要的方向之一。HUGE蛋白质数据库的建立正式这个方向的代表。它具有代表性的KIAA基因家族因其编码一些重要的蛋白而为人重视,其中KIAA1199基因因其与多种肿瘤的发生、发展密切相关而备受关注。本文就KIAA1199基因的结构、认识、研究新进展而作一综述。     

KIAA0649多克隆抗体的制备及其细胞内定位

目的：制备抗KIAA0649多克隆抗体并鉴定抗体的特异性,同时初步鉴定KIAA0649蛋白在细胞内的定位及其功能结构域。方法：通过TMHMM和DNAstar等软件对KIAA0649的蛋白质序列进行分析,选取了3段序列合成多肽,将3段多肽混合后对新西兰兔进行免疫,通过酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immuno-sorbnent assay, ELISA)测定血清中抗多肽的滴度,当抗血清的滴度达到1∶10⁵（体积比）时取血清,通过免疫亲和层析柱对抗体进行纯化。在U2OS细胞中表达Flag-KIAA0649或通过小干扰RNA沉默内源的KIAA0649,提取细胞蛋白,电泳后转膜,通过Western blot分析上述制备的多克隆抗体的特异性;将表达Flag-KIAA0649的细胞在玻片上固定,用抗Flag抗体和抗KIAA0649抗体进行双色免疫荧光分析,通过免疫荧光对KIAA0649抗体进行鉴定。利用PCR克隆构建Flag-KIAA0649全长表达质粒和系列Flag-KIAA0649缺失突变体,转染细胞后通过免疫荧光对KIAA0649在细胞内的定位进行研究。 结果：得到的纯化KIAA0649多克隆抗体特异性地识别内源及外源KIAA0649蛋白,可用于免疫荧光和Western blot分析;全长KIAA0649蛋白在细胞核内显示特定的分布方式;KIAA0649的缺失突变体中,含有PENF motif 的突变体与全长KIAA0649蛋白在细胞核内的分布形式一致,推测该结构域可能为KIAA0649 的功能结构域。 结论：通过上述方法制备的KIAA0649 多克隆抗体具有较高的特异性,可应用于KIAA0649的功能研究,KIAA0649在细胞内定位的研究对于阐明KIAA0649的功能机制具有重要意义。     

KIAA0101调控胃癌细胞周期的相关基因筛选

目的筛选KIAA0101 基因对细胞周期影响的相关基因。方法以RT-PCR方法分析胃癌组织相对于配对癌旁组织中 KIAA0101基因表达量,利用DAVID数据库对差异基因进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,使用KEGG绘制通路 图,将与KIAA0101表达模式相关的基因列表回带入TCGA cBioPortal进行基因之间相互网络作用的关系研究,并借由系统生 成基因拓扑关系图。最后采用RT-PCR方法对候选基因进行筛选。结果癌组织中KIAA0101 mRNA表达水平为1.104±0.379, 显著高于配对癌旁组织（0.421±0.172;P=0.0179）。系统通过汇总分析全部基因探针的表达强度,对来自478 例组织中与 KIAA0101相关的基因进行了筛选。GO功能分析显示差异基因主要富集在蛋白磷酸化、RNA加工、细胞周期、DNA代谢过程、 蛋白质转运、乙酰化、细胞凋亡、蛋白质水解、氧化还原等功能。KIAA0101表达水平的改变主要影响的胃癌相关通路有：细胞周 期、剪接体、DNA复制、p53 信号转导通路等。KEGG通路图及基因拓扑图显示,BUB1B、MAD2L1、CDC45、CDK1、CCNE1、 CCNB2等与KIAA0101相关的基因也与细胞周期相关,RT-PCR结果证实BUB1B、MAD2L、CDK1、CCNE1、CCNB2 mRNA表 达水平显著高于配对癌旁组织（P<0.05）,CDC45 mRNA表达水平无显著性差异（P>0.05）。结论KIAA0101 可能通过影响 BUB1B、MAD2L1、CDK1、CCNE1、CCNB2 表达产生对细胞周期的影响,这个结果可以为KIAA0101 影响细胞周期的作用机 制、肿瘤标志物的筛选和药物靶点的选择提供参考。     

KIAA1456靶向调控Runx1抑制肺癌A549细胞增殖和侵袭

目的探讨KIAA1456靶向调控Runx1对非小细胞肺癌A549细胞增殖和侵袭的影响。方法采用免疫组织化学法检测91例肺癌及癌旁组织中KIAA1456表达情况,分析KIAA1456与肺癌患者临床病理特征的相关性,并进行Kaplan-Meier生存分析。用Lipofectamine法将miR-NC KIAA1456 RNAi和pCDNA3.0-HA-KIAA1456质粒转染A549细胞,MTT法和Transwell法检测细胞增殖和侵袭能力,Western blotting法检测细胞KIAA1456、Cyclin D1、Runx1和MMP-9表达。结果KIAA1456在肺癌组织中的高表达率明显低于癌旁组织(P＜0.05)；KIAA1456在不同淋巴结转移、TNM分期分层间表达有差异(P＜0.05)。KIAA1456高表达肺癌患者5年总生存率高于KIAA1456低表达者(P＜0.05)。与阴性对照组比较,KIAA1456 RNAi组A549细胞增殖率、侵袭细胞数、Cyclin D1、Runx1和MMP-9表达均增加,KIAA1456表达降低；KIAA1456质粒组A549细胞增殖率、侵袭细胞数、Cyclin D1和MMP-9表达均降低,KIAA1456和Runx1表达增加(P＜0.05)。结论KIAA1456可作为肺癌的抑癌基因,通过靶向调控Runx1表达,抑制A549细胞增殖和侵袭。     

人KIAA1173基因的克隆、转染及生物学特性的实验研究

目的建立表达KIAA1173基因的鼻咽癌6-10B细胞模型,并观察转染细胞的生物学活性.方法从新鲜肌肉组织中提取总RNA,采取逆转录PCR得到人KIAA1173基因cDNA.获得的人KIAA1173基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1（＋）,进行酶切和序列鉴定.将重组质粒pcDNA3.1（＋）-KIAA1173和空载体利用阳离子脂质体介导转入鼻咽癌6-10B细胞,经G418筛选阳性克隆.用RT-PCR、原位杂交及免疫细胞化学等方法检测KIAA1173基因在6-10B细胞中的稳定表达情况,并通过MTT法、肿瘤细胞侵袭实验及裸鼠体内成瘤性实验方法,检测KIAA1173基因对鼻咽癌细胞的增殖、侵袭及成瘤能力的影响.以空白质粒转染组作为对照.结果在mRNA和蛋白水平证实,转染细胞内有KIAA1173基因的高表达,表明细胞可表达人KIAA1173基因.6-10B在转染了pcDNA3.1（＋）-KIAA1173后,较转染空载体pcDNA3.1（＋）,肿瘤细胞的增殖能力、侵袭能力及裸鼠体内成瘤能力明显降低（P＜0.05）.结论结果提示KIAA1173基因可能是一鼻咽癌肿瘤抑制基因.获得生物学活性稳定的KIAA1173基因高表达的鼻咽癌细胞模型,为进一步研究奠定了基础.     

KIAA0101基因在人非小细胞肺癌中的功能预测

目的应用生物信息学分析方法对肺癌组织中高表达的基因KIAA0101进行功能预测与分析。方法通过dChip软件对人肺癌基因表达谱数据集中癌旁组织与癌组织两组样本进行比较,筛选出与KIAA0101基因共表达的差异基因。运用DAVID、GO、STRING等生物信息学软件对筛选基因进行生物学功能分析,并通过GATHER转录因子预测软件预测该组基因的共同转录因子。结果与癌旁正常组织比较,肺癌组织中KIAA0101等9个基因表达水平升高两倍以上,并且具有相似表达变化趋势;转录因子预测发现该组多数基因启动子区含有转录因子E2F1结合位点。结论筛选出人非小细胞肺癌组织中与KIAA0101基因共表达的一组基因,其中BUB1B、CDC20、CCNB2等基因与细胞周期的调节密切相关,推测KIAA0101基因可能参与肺癌细胞周期的调节,并且该组基因转录水平表达升高可能受转录因子E2F1的调控。     

利用双向凝胶电泳和质谱技术进行前列腺癌差异蛋白质组学研究

目的 分离前列腺癌雄激素依赖型和非依赖型细胞系差异表达蛋白质,为进一步研究前列腺癌的蛋白组学打下基础. 方法 培养前列腺癌雄激素依赖型(LNCaP)和非依赖型(DU145)细胞系,分别提取两种细胞系的总蛋白,进行等电点聚焦和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,对所得胶图利用ImageMaster4.01软件进行分析,选取差异点进行质谱分析,对分析结果进行数据库检索. 结果 得到了分辨率和重复性均好的前列腺癌雄激素依赖型和非依赖型细胞系的双向凝胶电泳图谱,每块凝胶上平均蛋白质点数为816±15,通过分析得到3倍差异点41个,完全差异点10个.对完全差异点进行质谱分析和数据库检索得到与差异点相对应的3个蛋白质,其中第83号和175号为未命名蛋白质,第632号蛋白质是KIAA1283蛋白质,具有载脂蛋白功能. 结论 在前列腺癌激素依赖型和激素非依赖型细胞系中存在差异表达蛋白质,并可以利用双向凝胶电泳技术进行分离,为进一步研究前列腺癌的蛋白质组学和发病机制提供了线索.     

人亲磷脂酸磷脂酶A1基因的克隆与序列分析及真核表达载体的构建

目的 克隆人亲磷脂酸磷脂酶A1(PA-PLA1)基因,分析该酶基因及其蛋白质的序列特征并构建PA-PLA1基因真核表达载体,为该酶生理功能的研究提供实验依据.方法 从人的肾脏组织中提取总RNA,逆转录制备cDNA.扩增人PA-PLA1基因并克隆测序.以Vector NTI 8.0、DNASTAR、ORF finder分析所克隆的人PA-PLA1基因及其蛋白质序列.构建真核表达载体pcDNA3.1-PA-PLA1,测序证实后转染小鼠分泌胰岛素细胞株MIN6,以Western blotting检测PA-PLA1蛋白的表达水平.结果 人PA-PLA1基因mRNA全长为2 923 bp,编码区长2 238 bp,编码1个由745个氨基酸残基组成的蛋白多肽.序列比对表明所克隆的人PA-PLA1基因与牛PA-PLA1基因同源,并与KIAA0725p和p125基因高度相似,三者在脂肪酶家族中形成亚家族,但KIAA0725p蛋白和p125蛋白具有常见的脂肪酶活性中心保守序列GX-S-XG,而PA-PLA1的该序列为SX-S-XG.真核表达载体pcDNA3.1-PA-PLA1构建正确并在所转染的MIN6细胞中过表达PA-PLA1蛋白.结论 PA-PLA1、KIAA0725p蛋白和p125蛋白在脂肪酶家族中形成亚家族,但PA-PLA1具有独特的脂肪酶活性中心保守序列SX-S-XG.所构建的PA-PLA1基因真核表达载体能在MIN6细胞中过表达小鼠PA-PLA1蛋白.该研究结果将为PA-PLA1生理功能的研究提供实验依据.     

心脏发育候选致病基因KIAA0196斑马鱼品系的建立及初步机制研究

目的：探究KIAA0196基因对心脏发育的影响及斑马鱼品系的建立。方法：提取先天性心脏病患者外周 血和gDNA,采用拷贝数变异和靶向序列分析筛选出候选致病基因。用CRISPR/Cas9技术建立KIAA0196基因敲除斑 马鱼品系。对野生型和突变型斑马鱼进行解剖和组织学染色,观察心脏形态、大小及环化方向等表型。结果：通过 CRISPR/Cas9技术成功构建了斑马鱼KIAA0196基因敲除品系。受精后60 h,突变个体(杂合子+纯合子)显微镜检查显 示心包积液、心脏受压和尾部严重卷曲。突变型斑马鱼与野生型相比,心脏存在心房缩小,心室增大,心肌细胞更 加松散等缺陷。结论：KIAA0196基因在心脏发育过程中起重要的调控作用,该基因可能为先天性心脏病的致病候选 基因。     

人KIAA1173基因的克隆、转染及生物学特性的实验研究

目的 建立表达KIAA1173基因的鼻咽癌6-10B细胞模型,并观察转染细胞的生物学活性。方法 从新鲜肌肉组织中提取总RNA,采取逆转录PCR得到人KIAA1173基因cDNA。获得的人KIAA1173基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),进行酶切和序列鉴定。将重组质粒pcDNA3.1(+)-KIAA1173和空载体利用阳离子脂质体介导转入鼻咽癌6-10B细胞,经G418筛选阳性克隆。用RT-PCR、原位杂交及免疫细胞化学等方法检测KIAA1173基因在6-10B细胞中的稳定表达情况,并通过MTT法、肿瘤细胞侵袭实验及裸鼠体内成瘤性实验方法,检测KIAA1173基因对鼻咽癌细胞的增殖、侵袭及成瘤能力的影响。以空白质粒转染组作为对照。结果 在mRNA和蛋白水平证实,转染细胞内有KIAA1173基因的高表达,表明细胞可表达人KIAA1173基因。6-10B在转染了pcDNA3.1(+)-KIAA1173后,较转染空载体pcDNA3.1(+),肿瘤细胞的增殖能力、侵袭能力及裸鼠体内成瘤能力明显降低(P<0.05)。结论 结果提示KIAA1173基因可能是一鼻咽癌肿瘤抑制基因。获得生物学活性稳定的KIAA1173基因高表达的鼻咽癌细胞模型,为进一步研究奠定了基础。     

原发性下肢深静脉瓣膜功能不全患者曲张大隐静脉组织内KIAA0353基因的表达缺失

目的　筛选原发性下肢深静脉瓣膜功能不全 (PDVI)患者中大隐静脉曲张的致病相关基因。方法　利用荧光差异显示技术 (FDD) ,比较 10例PDVI患者中曲张的大隐静脉隐 股瓣膜区组织与正常人相应组织中mRNA表达的差异。获得的差异表达cDNA片段经Northern印迹证实后进行克隆和测序 ,分析其来源。结果　发现 37条差异表达cDNA片断 ( 30条证实为阳性 ) ,其中一条 5 40bp的片断只在正常人组中特异性表达 ,与人类KIAA0 35 3基因的mRNA部分序列有 99%的同源性。结论　原发性下肢深静脉瓣膜功能不全患者中大隐静脉曲张的发生是一个多基因参与的过程 ;KIAA0 35 3基因的表达缺失可能与PDVI患者中大隐静脉曲张的发生有关。     

肿瘤相关基因KIAA1173在皮肤鳞状细胞癌中的表达及其临床意义

目的 探讨KIAA1173基因在皮肤鳞状细胞癌(SSCC)中表达的临床与病理意义.方法 克隆KIAA1173基因片段(354 bp),并制备cDNA探针;采用原位杂交检测133例SSCC患者肿瘤组织(52例Ⅰ级、37例Ⅱ级、31例Ⅲ级和13例Ⅳ级)和47份正常表皮中KIAA1173基因mRNA的表达情况,并分析其与临床病理因素的关系.结果 KIAA1173基因阳性定位在实质细胞胞质内,在SSCC中阳性表达率为3 8. 3%(51/133),在正常表皮组织中的阳性表达率为93.6%(44/47),两者比较差异有统计学意义(x2=42.567,P＜0.01);正常表皮组的强阳性表达率为48.9%(23/47),SSCC组为6.0%(8/133),两者比较差异有统计学意义(x2=44.876,P＜0.01);KIAA1173基因在SSCC I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级的表达缺失率分别为53.8%(28/52)、62.2%(23/37)、67.7%(21/31)和76.9%(10/13),差异无统计学意义(x2=4.005,P＞0.05);分化较差组的表达缺失率70.5%(31/44)高于分化较好组57.3%(51/89),但两者比较差异无统计学意义(x2=2.154,P＞0.05).结论 KIAA1173基因在正常皮肤和SSCC不同分化程度中表达不同,KIAA1173基因可能参与SSCC的演变过程.     

联用2-DE和MALDI-TOF-MS技术筛查胃癌组织和血清中的差异蛋白质

目的 分别建立肠型、弥漫型胃癌组织和血清双向凝胶电泳图谱,鉴定差异表达蛋白,从中发现有意义的胃癌肿瘤相关标志物.方法 采用双向凝胶电泳（two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis,2-DE）分离组织和血清总蛋白,经硝酸银染色,分析选取有表达差异的蛋白质点,通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS）鉴定差异蛋白.结果 获得重复性和分辨率较好的胃癌组织和血清双向凝胶电泳图谱,经MALDI-TOF-MS鉴定得到20种蛋白,在7例（58.3%）肠型胃癌组织中均有硒结合蛋白1（SBP1）表达,KIAA基因家族蛋白在弥漫型胃癌组织和血清中均有表达.结论 建立了弥漫型肠型胃癌组织和血清双向凝胶电泳图谱,获得了差异蛋白质点,为寻找胃癌的特异蛋白质作为胃癌肿瘤标志物奠定了基础.     

大鼠坐骨神经Wallerian溃变的分子机制研究

目的：运用基因芯片和蛋白芯片技术及生物信息学分析,系统分析大鼠坐骨神经损伤后远端神经组织wallerian溃变的差异表达基因和蛋白,从基因和蛋白水平探讨wallerian溃变的分子机制。方法：建立大鼠损伤坐骨神经远端Wallerian溃变模型,利用表达谱基因芯片和抗体蛋白芯片,进行表达趋势分析、功能分析、京都基因与基因组百科全书信号通路分析。通过生物信息学方法全面系统分析,大鼠坐骨神经损伤后远端Wallerian溃变的基因和蛋白表达变化。结果：在Wallerian溃变和再生过程中,共有6076个基因差异表达和23种表达趋势,有93个蛋白差异表达,108种信号通路参与形成Wallerian溃变的信号调控网络。结论：大鼠坐骨神经损伤后Wallerian溃变过程中,有大量基因的表达变化和多种关键因子的调控,本研究为进一步阐明wallerian溃变的分子机制提供了基本数据,为经典的Wallerian溃变学说增添了新的内容。     

原肌球蛋白的分子生物学研究进展

原肌球蛋白 (TM )是肌肉收缩过程中重要的调节蛋白质 ,它以大量异构体形式广泛分布于各种真核细胞中。哺乳动物中的 4个TM基因已被确认 ,分别命名为TPM1、TPM2 、TPM3、TPM4 ,至少可表达出 2 0种TM异构体。TPM1基因突变与家族性肥大性心肌病有关 ;TPM3基因突变与线状肌病和骨骼肌无力有关