肝素对大鼠骨髓基质干细胞来源的血管内皮细胞贴附ePTFE影响的实验研究

目的应用大鼠骨髓间充质于细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）来源的血管内皮细胞贴附ePTFE血管壁,并加入肝素共同培养,观察其对细胞贴附效率的影响,探讨提高细胞贴附ePTFE的方法。方法密度梯度离心法分离SD大鼠MSCs,加入血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）和碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth facotr,bFGF）体外诱导,通过免疫组织荧光染色和电镜鉴定,将诱导的血管内皮细胞种植于人工血管上并分别加入浓度为0、10、20、30mg·L^-1的肝素培养,每4h检测内皮细胞贴附率,绘制细胞贴壁曲线。结果获取的MSCs漩涡状生长,诱导后细胞的vWF免疫组织荧光染色呈阳性表达,电镜下可见血管内皮细胞特征性的W—P小体。诱导的血管内皮细胞在ePTFE的贴附率逐渐升高,于20h时间点达到最高,4组贴壁率分别是88．34％、96．48％、91．98％、85．69％。结论肝素对MSCs来源的血管内皮细胞有重要的影响,具有能够有效地提高血管内皮化效率的作用,为人工血管的进一步发展提供了新的思路。     

血管内皮生长因子对兔肾血管内皮细胞体外培养的影响

目的 探索血管内皮生长因子（VEGF）对兔肾血管内皮细胞（MVECs）体外培养的影响。方法采用三步梯度筛网法,获得纯度较高的肾血管球,0．5％胶原酶Ⅳ37℃消化15～20min,离心沉淀获取血管内皮细胞,分加与不加VEGF培养。对培养的细胞用倒置显微镜观察常规形态,用免疫组化法进行第Ⅷ因子相关抗原鉴定,用透射电镜观察细胞浆Weibel-Palade小体,用间接免疫荧光法检测CD31、CD34及CD44的表达。结果加VEGF的MVECs原代3d铺满瓶底,3～4d传一代;不加VEGF的MVECs原代7～12d铺满瓶底,7～8d传一代。鉴定时两种培养的MVECs表达是一致的。倒置显微镜观察细胞铺满瓶底时呈典型的铺路卵石样结构,免疫组化法第Ⅷ因子相关抗原阳性,透射电镜观察到细胞浆中的Weibel-Palade小体,间接免疫荧光法检测CD31、CD34表达阳性,CD44阴性。结论VEGF对MVECs体外培养的影响无显著意义。     

组织工程化胆管中管状组织细胞培养及其与支架材料的相容性

目的探讨分化胆管平滑肌细胞及内皮细胞与高分子材料聚乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)生物相容性。方法体外培养并纯化大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs),定向诱导分化为胆管平滑肌细胞及内皮细胞,通过形态学及PCR法加以鉴定。种子细胞与PLGA支架复合培养,测定细胞黏附率,观察细胞在支架上的生长情况。结果体外分化MSCs 4周后,细胞呈现典型树枝状胆管内皮细胞形态学改变,PCR法显示分化细胞对细胞表面标记CK19高表达;8周后,细胞呈现典型类纺锤样平滑肌细胞形态学改变,RT-PCR法显示分化细胞对细胞表面标记抗平滑肌抗体(ASMA)、平滑肌抗原22(SM22)、钙调素结合蛋白高表达。分化细胞与支架复合培养,通过测定细胞黏附率及MTT法证明细胞在支架上增殖良好,扫描电镜显示分化细胞在PLGA支架上生长良好。结论 MSCs体外经定向诱导分化具有向平滑肌细胞及内皮细胞分化能力。分化好的细胞与支架具备良好生物相容性。     

SD大鼠骨髓基质细胞体外培养及分化研究

目的 研究SD大鼠骨髓基质细胞(marrow stromal cells,MSCs)的生物学特性及其成骨和成脂分化能力.方法 处死16只6月龄SD大鼠动物,非连续密度梯度离心分离大鼠MSCs,传代后分别在成骨及成脂培养基中诱导培养14天,观察细胞形态,绘制细胞生长曲线,通过组织特染对MSCs的成骨,成脂表型进行鉴定,计数阳性染色细胞百分比.结果 SD大鼠MSCs在体外具有成骨细胞分化潜力,油红0染色显示成脂诱导培养基可定向诱导其分化.结论 本实验成功分离SD大鼠MSCs且保持分化能力.     

人和大鼠血管内皮细胞的培养和鉴定

目的：建立人和大鼠血管内皮细胞体外培养的模型，为内皮细胞相关性疾病的研究提供重要的实验基础。方法：采用0．1％I型胶原酶消化灌注法和组织块贴壁法分别获得人脐静脉内皮细胞和大鼠微血管内皮细胞，每天在倒置相差显微镜下进行观察，并用免疫荧光法分别进行鉴定。结果：经胶原酶消化法和组织块贴壁法获得的内皮细胞，经过镜下观察、免疫荧光法鉴定证明是人脐静脉内皮细胞和大鼠血管内皮细胞。结论：胶原酶消化法和组织块贴壁法都可获得血管内皮细胞，可为临床研究提供大量的种子细胞。     

MSCs分离培养及定向分化为血管内皮细胞的研究

目的建立分离和培养大鼠骨髓源间充质干细胞（MSCs）的方法及定向分化为血管内皮细胞诱导条件的优化。方法淋巴细胞分离液（比重1．077g／m1）密度梯度离心法分离单个核细胞（MNC），在含10％胎牛血清L—DMEM培养基中培养，并传代扩增MSCs；选取状态较稳定的第4代细胞，分别用含10％胎牛血清和2％胎牛血清的诱导液（终浓度为10ng／mlVEGF、2ng／mlbFGF的DMEM培养液）继续培养，于第7、14天用流式细胞术分析CD34的表达情况，免疫组化法观察FVⅢ的表达情况。结果密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化MSCs，细胞呈均一的成纤维细胞样，流式细胞术分析MSCs结果显示，CD34阳性率为1．01％、CD29阳性率为97．32％；诱导14d后免疫组织化学法检测FVⅢ的表达，10％和2％胎牛血清诱导体系细胞的阳性率分别为12．21％和91．43％。结论密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化MSCs；就诱导效果而言，2％胎牛血清诱导体系明显好于10％胎牛血清诱导体系，说明低浓度的胎牛血清更有利于MSCs向血管内皮细胞分化。     

体外长期培养的家猪骨髓间充质干细胞生物学特性变化

目的 观察体外长期培养的家猪骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)生物学特性的变化.方法 将第1代MSCs(早期)和第35代MSCs(晚期)分别进行细胞形态学观察和染色体核型分析;钙沉积和细胞增殖测定,以及采用实时定量PCR定量分析成骨分化及成脂分化相关基因表达.结果 早期培养的MSCs细胞形态为较大的纺锤形,晚期为小的梭形.第35代MSCs细胞Ki-67染色强阳性,染色体数目增加.成骨诱导条件下早期MSCs茜素红S染色呈强阳性,晚期MSCs未见明显染色且OC基因表达明显下调(P＜0.01);成脂诱导条件下早期MSCs油红O染色阳性,晚期MSCs未见明显染色且PPARγ2基因表达明显下调(P＜0.01).结论 体外长期培养的家猪晚期MSCs不适合作为组织工程种子细胞.     

兔骨髓间充质干细胞诱导分化为成骨细胞的实验研究

目的 探讨兔骨髓间充质干细胞(MSCs)体外培养、定向诱导分化为成骨细胞的途径.方法 抽取兔骨髓,以全骨髓贴壁培养法进行体外培养,贴壁细胞传代.取第3代细胞诱导培养,倒置显微镜下观察细胞形态.培养16 d后,用5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(BCIP)/氯化硝基四氮唑蓝(NBT)底物显色试剂检测碱性磷酸酶(AP),茜素红染色检测钙结节.结果 全骨髓贴壁培养法可获得MSCs,原代和传代培养的MSCs具有活跃的增殖能力.诱导培养后,AP检测与钙结节染色均为强阳性.结论 兔骨髓中培养出的MSCs可以定向分化为成骨细胞,可用作骨组织工程中的种子细胞.     

人外周血内皮前体细胞体外增殖规律的动态观察及其特性

目的：探讨人外周血内皮前体细胞（endothelial progenitor cells EPCs）体外诱导分化为内皮细胞（ECs）的生长增殖规律及其特性，以期证实人外周血是临床治疗缺血性疾病一个理想的内皮前体细胞来源。方法密度梯度离心提取单个核细胞，接种在人纤连蛋白包被的培养板上，培养于含有促血管生长因子VEGF、b—FGF、IGF、EGF等的内皮生长基质EGM-2 MV中。每天倒置显微镜观察，并记录。4d后去除未附着细胞，继续培养黏附细胞，同时，黏附细胞用Dn—AC—LDL和FITC—UEA—1进行免疫荧光染色，荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜观察。收集第7d的黏附细胞，流式细胞仪检测细胞表面标志CD34和CD31。结果接种1d后，一些细胞变形；2d后，有细胞团形成；3d后，细胞团周围一些贴壁细胞开始出现；4d后，黏附细胞呈短梭形或多角形贴壁生长，荧光显微镜、共聚焦激光扫描显微镜下可观察到Dn—AC—LDL和FITC—UEA-1双阳性的黏附细胞；第6d、7d，黏附细胞呈长梭形；FACS分析，CD34和CD31阳性率分别为（14．13±2．79）％、（54．67±3．44）％。结论外周血中确实存在EPCs，并且在促血管生长因子VEGF、b—FGF、IGF、EGF等的刺激下能分化为成熟的内皮细胞。EPCS可望作为临床血管再生的细胞治疗     

超声辅助转基因治疗缺血性心脏病的骨髓间充质干细胞的实验研究

目的血管内皮生长因子（VEGF）基因转染骨髓间充质干细胞,探讨骨髓间充质干细胞定向分化血管内皮细胞的可行性研究。方法VEGF165基因的质粒PEGFP-C1,采用超声辅助电穿法转染骨髓间充质干细胞,转染后于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）表达情况。结果超声辅助转染后5h可见细胞内有GFP表达,10h后出现表达高锋,持续3d左右,其后有些细胞荧光开始减退。结论VEGF基因转染骨髓间充质干细胞后,骨髓间充质干细胞内有GFP表达,提示细胞转染成功,骨髓间充质干细胞定向分化为血管内皮细胞具有可行性。     

体外诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的机制研究

目的体外诱导成人骨髓间充质干细胞(MSCs)向神经元样细胞分化,并探讨分化过程中多效蛋白(PTN)mRNA的表达,以了解MSCs向神经元样细胞分化的特性和机制。方法密度梯度离心加贴壁培养法分离成人MSCs,原代和传代培养。取第6代MSCs设对照和试验组进行诱导,诱导后30 min至3 d,观察细胞形态并计数。免疫细胞化学法和反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法测定分化后细胞神经细胞特异性表面标志神经元烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白(MAP)-2,胶原酸性蛋白(GFAP)和诱导前、诱导后12 h PTN mRNA的表达。结果接种24 h后MSCs开始贴壁,呈圆形或椭圆形。3 d后可见梭状细胞呈集落状生长,10～14 d融合。第5～6代时呈现较均一的成纤维细胞样形态。诱导后胞体向胞核收缩;出现双极及多极细胞。12 h变形细胞增多,细长突起相互连接。24 h后变形细胞增多不明显。诱导后12 h大部分细胞表达NSE(64.79±0.07)%、MAP-2(60.05±0.09)%,未检测到GFAP的表达,RT-PCR半定量检测有NSE mRNA的表达(0.66±0.15)。实验组诱导后12 h细胞有PTN mRNA的表达(0.689±0.017)。结论建立了稳定的成人MSCs培养增殖体系,MSCs可体外诱导分化为神经元样细胞,在分化过程中有外观形态变化和特异性标志物NSE和MAP-2的表达,同时有PTN mRNA的表达,提示PTN可能参与调控了MSCs向神经元样细胞的分化。     

丹参注射液诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的研究

目的:探讨丹参注射液在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向神经元样细胞分化的作用。方法:采用差速贴壁法体外分离培养大鼠MSCs,流式细胞仪检测其表面标志,经碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)预诱导24h,采用含丹参注射液的无血清L-DMEM培养液诱导MSCs,倒置显微镜下观察细胞形态的变化,免疫荧光细胞化学检测巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF-M)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果:体外培养的大鼠MSCs表达CD29、CD44、CD105、CD166。丹参注射液诱导后MSCs胞体收缩,突起伸出,较密的部分神经元拉成网状,免疫细胞化学显示巢蛋白、NSE、NF-M表达阳性,阳性率分别为(58.68±4.50)%、(61.23±5.72)%、(63.47±6.38)%,GFAP阳性细胞率(1.47±0.23)%。结论:丹参注射液在体外可以将大鼠MSCs诱导分化为神经元样细胞。     

肝损伤血清体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为类肝细胞

目的探讨肝损伤血清诱导人骨髓间充质干细胞分化为类肝细胞的可行性。方法分离、纯化hMSCs后用含10％肝损伤血清的培养基诱导培养，倒置显微镜连续观察细胞形态变化，并分别于诱导后7、14、21d行免疫细胞化学、糖原染色检测诱导后细胞的功能。结果①MSCs形态均一，呈长梭形；②实验组MSCs在诱导5—7d后细胞形态开始变为不规则圆形、三角形或多角形；③免疫细胞化学：实验组细胞第7天AFP表达呈阳性，第14天AFP表达消失；Alb第14天开始表达，表达量逐渐增强，可持续至第21天；④PAS染色：实验组在诱导21d时细胞有合成糖原的能力，可见胞浆呈红色。结论肝损伤血清可诱导MSCs向类肝细胞分化，为细胞移植治疗肝衰竭提供新的探索思路。     

体外诱导人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化

目的 通过体外培养将人脐带间充质干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞.方法 将体外培养的人脐带间充质干细胞分为诱导组和对照组.诱导组先后予以1 mmol·L-12-巯基乙醇培养2 d,10 μg·L-1表皮生长因子、10 μg·L-1碱性成纤维细胞生长因子及2% B27培养7 d,之后添加20 mmol·L-1尼克酰胺及艾塞那肽培养7 d.对照组不添加诱导剂,继续换液培养.通过观察细胞形态变化、RT-PCR体外扩增两组细胞的胰腺-十二指肠同源框-1（PDX-1）基因、放射免疫法测定两组细胞胰岛素分泌量三种方法来鉴定胰岛素分泌细胞.结果 （1）通过形态学观察,诱导组细胞类似胰岛样细胞,对照组细胞则无明显改变;（2）应用RT-PCR方法,诱导组细胞可扩增出PDX-1基因,而对照组则没有.（3）诱导组细胞培养上清液可检测出胰岛素分泌,7 d时胰岛素浓度为（6.32±0.18）mIU·L-1,21 d时增至（34.57±4.54）mIU·L-1,而对照组则未测出.结论成功在体外微环境下将人脐带间充质干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞.     

两种猪自体骨髓间充质干细胞培养方法的比较

目的比较猪应用单纯直接贴壁法和密度梯度离心结合直接贴壁法两种方法分离、纯化、扩增骨髓间充质干细胞(MSCs)的培养效率,为临床应用提供理论依据和实验方法。方法取滇南小型猪的骨髓液用单纯直接贴壁法和密度梯度离心结合贴壁培养法两种方法分离猪骨髓间充质干细胞,体外培养扩增,绘制其生长曲线,通过显微镜观察培养细胞的生物学形状。结果直接贴壁法收集到的细胞扩增速度较慢,密度梯度离心法收集到的细胞扩增速度较快,细胞培养后成梭形。结论密度梯度离心结合贴壁培养法较单纯的直接贴壁法培养骨髓间充质干细胞的培养效率更高。体外培养的猪骨髓间充质干细胞生长稳定,增殖力较强。     

促大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的研究

目的探讨成年大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的体外培养和向神经元样细胞分化的方法。方法通过梯度分离获得成年大鼠MSCs,在细胞因子和氧化剂作用下对其诱导分化为神经元样细胞,免疫细胞化学方法检测神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经丝蛋白（NF）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和神经巢蛋白（Nestin）的表达情况,流式细胞仪检测分析诱导率。结果BMSCs被转化神经元样细胞并表达Nestin。应用碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、叔丁基对羟基茴香醚（BHA）所获得的神经元样细胞诱导率高（49.7%）。结论bFGF、BHA能促进大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。     

转HOXB4基因人骨髓MSC促进脐血CD34~+细胞体外扩增

目的 研究转HOXB4基因的人骨髓间充质干细胞(MSC)对脐血CD34~+细胞体外扩增的支持作用.方法 用病毒载体质粒转染包装细胞293T,收获病毒上清(VCM)感染MSC后,用潮霉素筛选获得转HOXB4的MSC(MSC-HOX).分别将MSC(对照组)与MSC-HOX细胞(实验组)作为CD34~+细胞体外扩增的饲养层细胞,结合细胞因子Fh3/Flk3配体(FL)、促血小板生成素(TPO)、干细胞因子(SCF)和粒细胞-集落生长因子(G-CSF)体外扩增脐血CD34~+细胞10 d,收集所有脐血细胞,检测细胞总数、CD34~+细胞总数,集落细胞形成单位(CFU)数.结果 生产重组逆转录病毒可有效将HOXB4基因转入靶细胞内并表达.脐血CD34~+细胞经体外扩增10 d后,细胞总数和CFU数两组间差异无统计学意义(P>0.05),脐血CD34~+细胞总数和比例高于对照组(P<0.05).结论 转HOXB4基因的人骨髓MSC在脐血CD34~+细胞体外扩增中,可保持CD34~+细胞未分化状态,有潜在的应用价值.     

VEGF165在恒河猴骨髓间充质干细胞中的表达及鉴定

目的 探讨血管内皮生长因子（VEGF165）转染恒河猴间充质干细胞（MSCs）后的表达情况, 以及转染后对 MSCs 功能的影响。 方法 通过 Ficoll 法分离并培养恒河猴骨髓 MSCs, 进行细胞表型鉴定。 转染 pcDNA-eGFPVEGF165至 MSCs, 荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白（eGFP）表达情况, 同时流式细胞技术对转染成功的细胞进行细胞表型及 eGFP 表达鉴定, RT-PCR 法检测转染后 VEGF165表达情况。 结果 成功分离到纯度较高的 MSCs, 转染后的 MSCs 及子代细胞均有 eGFP 和 VEGF165 的表达, 且保留了 MSCs 的特性。 结论 VEGF165 基因转染 MSCs 后可以稳定表达外源基因, 且可以维持 MSCs 的特性。